Methoden voor het uitvoeren van Kruisen in Setaria viridis, Een Nieuw Model Systeem voor de Grassen

Samenvatting

We hebben een methode voor het uitvoeren van kruisen in Setaria viridis (S. viridis) ontwikkeld. Bij deze methode wordt het snoeien van de pluim voorafgaand aan een warm water behandeling om levensvatbare pollen doden. Kruisen worden uitgevoerd na een goed gecontroleerde groei regime en meestal tot gevolg dat het herstel van 1-7 kruisbestuiving zaad / s per pluim.

Samenvatting

Setaria viridis is een opkomende modelsysteem voor _C4 grassen. Het is nauw verwant aan de bio-energie voervoorraad switchgrass en de graanoogst vossenstaart gierst. Onlangs heeft de 510 Mb genoom van vossenstaart gierst, S. italica, is gesequenced ^1,2 en een 25x dekking genoom sequentie van de iele relatieve S. viridis is in volle gang. S. viridis heeft een aantal kenmerken die het een potentieel uitstekend model genetisch systeem met een snelle generatie tijd, kleine gestalte, eenvoudige groei eisen, vruchtbare zaadproductie ³ en ontwikkelde systemen voor zowel transiënte als stabiele transformatie ⁴ maken. De genetica van S. viridis grotendeels onontgonnen, gedeeltelijk vanwege het gebrek aan gedetailleerde methoden voor het verrichten kruisen. Tot op heden heeft geen standaard protocol is vastgesteld dat de snelle productie van zaden zullen toestaan ​​van gecontroleerde kruisingen.

Het protocol presented hier is geoptimaliseerd voor die genetisch kruisen in S. viridis, toetreding A10.1. We hebben een eenvoudige warmtebehandeling met warm water voor castratie toegepast na het snoeien van de pluim tot 20-30 roosjes en de etikettering van bloemen behouden om zaden als gevolg van nieuw ontwikkelde bloemen na castratie te elimineren. Na het testen van een reeks warmtebehandelingen bij permissieve temperatuur en variëren van de duur van het dompelen, hebben we een optimale temperatuur en tijdsbereik van 48 ° C gedurende 3-6 minuten ingesteld. Door het gebruik van deze methode kan een minimum van 15 kruisen worden uitgevoerd door een enkele werknemer per dag en een gemiddelde van 3-5 outcross nakomelingen per pluim kunnen worden hersteld. Daarom kan een gemiddelde van 45-75 outcross nakomelingen worden geproduceerd door een persoon in een enkele dag. Brede implementatie van deze techniek zal de ontwikkeling van recombinant inteeltlijn populaties van S. vergemakkelijken viridis X S. viridis of S. viridis X S. italica, in kaart brengen van veranderingen door middel van bulk segregant analyse en het creëren van hogere orde mutanten voor genetische analyse.

Inleiding

S. viridis is een NADP-ME subtype C ₄ gras nauw verwant aan de bio-energie voervoorraad switchgrass (NAD-ME subtype), de graanoogst vossenstaart gierst, en de agrarische onkruid cavia gras ^5. De 510 Mb genoom van gecultiveerde vorm van Setaria, S. italica, is onlangs de sequentie ^1,2 en een 25x bereik genoomsequentie van de relatieve iele, S. viridis, is in volle gang (niet gepubliceerd). S. viridis heeft een aantal kenmerken die het een potentieel uitstekend model genetisch systeem met een snelle generatie tijd, kleine gestalte, eenvoudige groei eisen en vruchtbare zaadproductie ³ te maken. Belangrijk zijn werkwijzen onlangs ontwikkeld voor zowel transiënte als stabiele transformatie van S. viridis die de mogelijkheid voor het creëren van transgene planten ⁴ bieden. Echter, een belangrijk knelpunt bij de ontwikkeling van genetische hulpmiddelen voor S. viridis is het herberekenenitrance om uitkruising. Tot op heden heeft geen standaard protocol gepubliceerd die snelle productie van zaden zullen toestaan ​​van gecontroleerde kruisingen.

Genetische kruisen in S. italica worden meestal uitgevoerd door castratie door verwijdering van meeldraden uit bloemen ^6,7,8 of via warmtebehandeling van bloemen van de vrouwelijke ouders ^9-11. Naar aanleiding van deze behandelingen, helmknoppen of pluimen van niet-behandelde bloemen / mannelijk ouders worden voorzichtig schuren tegen stigma's vrijgeven pollen. In castratie, worden helmknoppen verwijderd met behulp van fijne tang onmiddellijk na de bloem open en de helmknop begint te exsert, maar is nog niet vergoten pollen ^6-8. Een van de uitdagingen van deze laatste werkwijze is de moeilijkheid bij het uitvoeren castratie in een smalle tijdsinterval tussen de opening en stuifmeel schuur van de bloem. De duur van het openen en sluiten van een enkele bloem is afhankelijk van de toetreding en milieuconditie, en kan variëren van 7 min ^{6-2,5 uur 12 bij S. italica. Aangezien afstoten van stuifmeel optreedt als helmknoppen exsert van de bloem, helmknoppen moet zorgvuldig en snel verwijderd en daarom is het moeilijk om besmetting door zelfbestuiving voorkomen. Bovendien, zoals bestuiving onmiddellijk worden uitgevoerd na castratie, het aantal kruisen die kunnen worden uitgevoerd per persoon / per dag beperkt.}

Als een alternatieve werkwijze kunnen rijpe pluimen worden ondergedompeld in warm water om warmte-ontwikkeling doden stuifmeelkorrels ^9,10,13,14 met het voordeel van het uitvoeren kruisen op een groot aantal pluimen. De temperatuur en de duur van de warmtebehandeling varieert sterk van verschillende experimenten (bijv. 47 ° C gedurende 10 minuten ¹⁴ en 42 ° C gedurende 20 min. ^10). Verder zijn er geen systematische analyses over de werkzaamheid van warmte-gemedieerde emasculations gepubliceerd. Dus een standaard en eenvoudige werkwijze voor het uitvoeren van genetische kruisingen in S. viridis zou enorm versnellen de ontwikkeling van genetische hulpbronnen en de vestiging van S. viridis als modelsysteem in de onderzoeksgemeenschap.

Wij rapporteren de ontwikkeling en optimalisatie van een standaardprotocol voor die genetisch kruisen in S. viridis. Planten worden gekweekt onder gecontroleerde omgevingen bloemontwikkeling synchroniseren en verhoging reproduceerbaarheid van de procedure. Kruisen worden uitgevoerd met behulp van een transgene S. viridis lijn als de mannelijke ouder die het GUS reportergen ⁴ de identificatie van succesvolle gecontroleerde genetische kruisingen vergemakkelijken. De GUS transgen wordt aangedreven door een rijst ubiquitine promotor die het scoren van F1 zaden kunnen onmiddellijk na het verzamelen en verschaft aldus een eenvoudige kwalitatieve test om de efficiëntie castratie en bestuiving bepalen. We hebben een eenvoudige warmtebehandeling met warm water voor castratie gevoegd waarin de bloemen die emascula zijn geweest in dienstted om zaden als gevolg van nieuw ontwikkelde bloemen na castratie te elimineren. Na het testen van een reeks warmtebehandelingen bij permissieve temperatuur en variëren van de duur van het dompelen in warm water, hebben we een optimale temperatuur en duur van 48 ° C ingesteld 3-6 minuten. Een pre-dawn koudebehandeling bleek synchrone anthesis in beide ouders te bevorderen om de kruisbestuiving te bevorderen. We hebben ook gesproken over de belangrijkste stappen in het protocol en de toekomstige toepassing van deze methode om andere Setaria toetredingen.

Protocol

1. Groei S. viridis

1. Stel de kweekkameromstandigheden tot 31 ° C/22 ° C (dag / nacht), 12 uur light/12 uur donker, 50% relatieve vochtigheid met een pre-dawn behandeling van 15 ° C 8:30-09:00 AM. (Figuur 1). Onder deze omstandigheden, S. viridis A10.1 duurt ongeveer 21-22 dagen uit zaad zaaien anthese.
2. Vul flats (4 x 9 cellen) met Metro Mix 360 en verwijder een cel voor het besproeien.
3. Licht mist water op maaiveld.
4. Zaaien op het oppervlak van de bodem, een zaad per cel.
5. Bedek de zaden met een laag grond (ongeveer 0,5 cm)
6. Beslaan van het oppervlak van de bodem en het water flats van de bodem. Houd het besproeien van de bodem na het zaaien.
7. Voor elk kruis dat wordt uitgevoerd ten minste drie planten worden gebruikt als vrouwelijke ouders en negen planten worden gebruikt als mannelijke ouders. Zaaien moet worden gespreid als alle planten niet zullen bloeien op dezelfde dag. Zaad sowing wordt elke dag aanbevolen gedurende een periode van drie dagen.
8. Water de planten 1-2 maal per dag, die afhankelijk van de grootte van de planten en bodemgesteldheid. Overtollig water in de grond is niet gunstig voor een optimale groei van de planten, en kan leiden tot schimmelgroei in de bodem en beschadiging bladweefsel.
9. Bemest de planten twee keer per week, met Jack 15-16-17 bij een concentratie van 100 ppm.

2. Trimmen en etikettering van Pluim Voordat ontmanning - Dag 1

1. In de middag of avond voorafgaand aan de bestuiving, verplaatsen planten uit de groei kamer naar het lab (Temperatuur (T): 24.06 ° C ± 0,13 ° C, relatieve luchtvochtigheid (RV) 21.79% ± 1,15%).
2. Selecteer de primaire pluimen met 1 bloem tot 1/3 van bloemen op de pluim die reeds hebben gebloeid.
3. In deze studie de vier domeinen binnen de pluim zijn als volgt gedefinieerd (Figuur 2A, tip, distale midden, proximale midden-en basisnoten).
4. Idealiter choosea pluim met 1-5 bloemen die hebben gebloeid, sneed het topje van de pluim (distale einde), en verwijder alle bloemen in de proximale midden-en basisnoten secties met behulp van de lente schaar of fijne pincet.
5. Als een pluim heeft ongeveer 1/10 tot 1/5 van bloemen die hebben gebloeid, afgesneden van de tip en trim bloemen uit de basis van de pluim, maar behouden het onderste gedeelte van de distale middelste en bovenste deel van de proximale midden voor verdere trimmen.
6. Als een pluim heeft ongeveer 1/4 tot 1/2 van bloemen die hebben gebloeid, afgesneden van de distale middelste gedeelte en alleen behouden de proximale middelste gedeelte voor verdere trimmen.
7. Gebruik chirurgische schaar om licht trimmen de haren.
8. Verwijder alle bloemen die hebben gebloeid en alle onvolwassen bloemen laat ongeveer 20-30 bloemen / pluim die gelijkmatig zijn verdeeld in de regio (figuur 3). Oefen zorg aan de haren in het gebied dat zal worden bestoven om roosjes te beschermen tegen mogelijke schade door hitte te behouden.Voor elk aartje, behouden de bovenste meest volwassen floret. De meest bovenste bloem een hogere kans bloemvorming ten tijde van bestuiving (figuur 2B).
9. Markeren een zijde van elke bloem met een rode permanent marker en noteer het aantal roosjes op de pluim (Figuur 2B).
10. Vlag de pluim met de volgende informatie: de datum van castratie, de duur en de temperatuur waarbij de castratie wordt uitgevoerd.
11. Zodra de pluim is getrimd, verwijder alle bewerkers van elke plant tot herverdeling van meer middelen te waarborgen om de ontwikkeling van de belangrijkste pluim.

3. Ontmanning met warm water dompelen - Dag 1

1. Stel het waterbad tot 48 ° C ± 0,1 ° C voor de warmtebehandeling.
2. Buig de bijgesneden pluimen en dompel ze in warm water van 48 ° C gedurende 3-6 minuten. Wees voorzichtig de steel van de pluim niet te breken.
3. Ongeveer 3-4 pluimen kan worden gedompeld togeterugkeerde tegelijk, terwijl behoud van voldoende ruimte tussen de pluimen uniforme warmteverdeling. Het is essentieel om de hele pluim dompelen in warm water tijdens de warmtebehandeling. De vlag blad (het blad staalkaart de pluim die de voedingsstoffen levert aan de pluim) mag niet in contact met warm water komen om warmte schade aan bladweefsel voorkomen.
4. Zodra de ontmanning wordt uitgevoerd voor de gewenste duur, verwijder pluimen uit het waterbad en schud het water van de pluim.
5. Plaats een aangepaste micro-geperforeerd broodzak doorgronden van het ontmand pluim en zet deze vast met een twist-tie. Micro-geperforeerd broodzakken kan worden aangepast aan de grootte van de pluim (onder andere in de video).
6. Plaats planten terug in de groei kamer tot de volgende dag.

4. Crossing / bestuiving na castratie - Dag 2 en Dag 3

1. Op 9:00 op dag 2 en dag 3, bewegen vrouwelijke (gecastreerd) en male ouders van de groei kamer naar het lab (T: 24.06 ° C ± 0,13 ° C, RH: 21.79% ± 1,15%) te kruisen voeren.
2. Observeren en voeg een andere rode stip aan bloemen die hebben gebloeid of bloeien met behulp van een rode permanent marker. Noteer het totaal aantal bloeide bloemen per pluim.
3. Noteer de datum van bestuiving en de naam van de mannelijke ouder op de tag te houden van wat kruizen worden uitgevoerd houden.
4. Let op de piektijd van anthesis in mannelijke ouders. Onder onze kamer omstandigheden (figuur 1) bloemen op de pluimen van de mannelijke ouder beginnen synchrone opening rond 10:10. Vanaf het moment van opening van bloemen, zal de volledige exsertion van helmknoppen en het vrijkomen van stuifmeel optreden na 20 minuten.
5. De ideale podium voor bestuiving is de fase waarin het stuifmeel van de mannelijke ouder wordt losgelaten. De bloemen zal sluiten na 20 min van pollen release. Vandaar dat de duur van de bloei is ongeveer 40 minuten van de opening van stromingers. De kleur van de pollen verandert van geelachtig wit naar bruin over een periode van ongeveer 30 minuten na de bloem gesloten.
6. Start bestuiving onmiddellijk zodra geelwit helmknoppen zijn zichtbaar op de bloemen van de mannelijke ouder. Bestuiving worden uitgevoerd op dag 2 en dag 3 met een van de drie technieken:
   1. Pluim-to-pluim bestuiving: met behulp van een vrijstaande pluim als de mannelijke, wrijf de pluim samen met de ontmand pluim voor bestuiving vergemakkelijken en gooi de mannelijke pluim om besmetting te voorkomen. Herhaal de bestuiving proces totdat elke ontmand pluim is bestoven met 2-3 pluimen.
   2. Helmknop-to-stigma bestuiving: behulp van een tang pluk een bloem die bloeit met gelige witte helmknoppen of kies helmknoppen en fysiek aanraken het stigma van de bloem op de vrouwelijke ouder. Gebruik een bloem uit de mannelijke ouder om een ​​bloem bestuiven op de ontmand pluim. Herhaal de bestuiving process totdat elk stigma op de ontmand pluim is bestoven door een paar (ongeveer 2-3) bloemen / helmknoppen. Het dragen van een vergrootglas vizier zal een betere zichtbaarheid verlenen aan de bestuiving te voeren.
   3. Tussen de bestuiving van verschillende mannelijke ouders, dompel de tang in 95% ethanol, gevolgd door af te vegen met Kimwipes om besmetting door de overdracht van stuifmeel tussen verschillende kruisingen te voorkomen.
   4. Pluim binding: Na castratie, selecteer 3-4 pluimen op de mannelijke ouder die de volgende dag zal bloeien. Bind ze samen met de ontmand pluim van de vrouwelijke ouder met behulp van een draai-tie. Plaats de ontmand pluim iets onder de pluim van de mannelijke ouder. Plaats een pergamijn zak over de pluimen en zet de zak aan de basis met een paperclip. Dit kan worden ingevuld op dag 2 na de pluimen van de mannelijke ouder beginnen anthese.
   5. Tijdens de bloeiende tijd in de ochtend van dag 2 en dag 3, flick of schud de glassine zak te vergeitate bestuiving. Blijven gedurende de gehele duur van de bloei in de ochtend (tussen 9:00-11: 00:00) flick of schudden pluimen elke 15 minuten. Verwijder pluimen van de mannelijke ouder na bestuiving en het etiket van de andere kant van het bloeide bloemen op de ontmand pluim. Noteer het aantal bloeide bloemen op de pluim van elke vrouwelijke ouder.
7. Zodra de bestuiving is uitgevoerd, plaatst een aangepaste micro-geperforeerd brood zak om de pluim van de vrouwelijke ouder dekken en veilig aan de basis met behulp van een bindsluiting na bestuiving tot zaad oogsten.

5. Kap

1. Oogst zaden na 2 weken (14-16 dagen) vanaf de dag van bestuiving. Plaats de tag in dezelfde zak van de zaden. Zaden die rode markeringen aan beide zijden geven de zaden die het gevolg is van de gecontroleerde genetische kruis. Deze zullen naar verwachting outcross nageslacht zijn.
2. Gooi alle zaden zonder rode markering als zij vertegenwoordigende zaden die voortvloeien uit nieuw ontwikkelde bloemen na castratie. Zaden met rode markering slechts aan een zijde vertegenwoordigen waarschijnlijk de zaden verkregen uit zelfbestuiving aangezien zij geen bloei op het moment, als deze kruisingen uitgevoerd.
3. Droge zaden bij 30 ° C gedurende 2 dagen in een zaad droger. WINKEL gedroogde zaden in het laboratorium (T: 24.06 ° C ± 0,13 ° C, RH: 21.79% ± 1,15%) of een zaad kamer (T: 4,0 ° C ± 1,0 ° C, relatieve vochtigheid: 20% ± 1%).

Resultaten

In deze studie hebben we de gesequenced S. gebruikte viridis toetreding A10.1 als de vrouwelijke ouder, en een transgene S. viridis lijn (ook A10.1) met de GUS-gen ⁴ als de mannelijke ouder voor alle bestuiving. Een geoptimaliseerde groeiregime werd gebruikt om bloei te synchroniseren zoals getoond in figuur 1. We hebben verschillende combinaties van temperatuur en tijd van de warmtebehandeling voor castratie getest en vastgesteld dat ongeveer 40-80% van het in de pluim ontkracht gehouden bloemen bloeiden op de 2 ^e dag terwijl het resterende bloeide de ^3e dag (figuur 2). Indien de hittebehandeling te zwaar voor voorbeeld 49 ° C gedurende 4 min, weinig of geen bloemen bloeiden op de 2 ^e dag. Kruisbestuiving uitgevoerd op het ^2e of ^3e dag na castratie, die afhankelijk van de piektijd van bloemvorming van mannelijke ouders was.

Het was waarneembareed dat jonge bloemen blijven ontwikkelen na castratie, gerijpt en zelfbestuiving 3-6 dagen na gecontroleerde bestuiving. Na 7-10 dagen na de bestuiving, bloemen die wit zijn van kleur zijn zichtbaar op de pluim. Deze witte bloemen zijn onbevrucht als gevolg van hetzij schade hitte of slechte bestuiving. Tegelijkertijd, de bloemen die met succes zijn bestoven beginnen donkere zaden alsmede start verbrijzelen na 14 dagen. De donkere zaden met rode markeringen geoogst op de 14 ^e dag na bestuiving kon duidelijk worden onderscheiden van de zaden zonder rode markeringen die nog groen waren en niet breken. Als oogst wordt vertraagd, de anthecium van de zaden met en zonder rode markering beide draai donker, wat het moeilijk maakt om snel de zaden met rode markeringen geoogst pools onderscheiden.

Voor het optimaliseren kruising protocol verscheidene warmtebehandeling experimenten werden uitgevoerd zoals samengevat in tabel 1. Gemiddeld0-10 zaden / pluim werden uit diverse warmtebehandeling experimenten. Na de oogst werden zaden gedroogd bij 30 ° C gedurende 2 dagen in een zaad droger gevolgd door verwijdering van de anthecium met een anthecium remover. Na de anthecium werd verwijderd, werden vermeende F1 zaden gekleurd met GUS kleuring oplossing, en outcross nageslacht gekleurd blauwe kleur in 1-2 uur (figuur 2F). Gebaseerd op deze resultaten, adviseren wij een warmtebehandeling van 48 ° C gedurende 3-6 minuten. Verder raden wij kruisen worden uitgevoerd op zowel dag 2 en dag 3 na castratie.

Om de effectiviteit van deze techniek bij het ​​uitvoeren kruisingen met andere Setaria toetredingen of soorten onderzoeken kruisingen tussen S. viridis A10.1 en acht gevarieerde S. viridis toetredingen en een S. toetreding pumila werden uitgevoerd. Hoewel de dagen tot bloei gevarieerd tussen de toetredingen vonden we dat de bloemen van alle acht S. viridis toetredingen en een S.toetreding pumila beginnen opening tussen 10:00-11:00 met een piek openingstijd op 10:20-11:00 na de predawn koudebehandeling. Dit geeft aan dat de predawn koudebehandeling kan worden toegepast op diverse Setaria toetredingen. Een warmtebehandeling van 48 ° C gedurende 5-6 min werd gebruikt om S. ontkracht viridis A10.1 dat gebruikt werd als de vrouwelijke ouder van alle kruisingen uitgevoerd. Wij hersteld van een tot 12 zaden van kruisingen tussen A10.1 en drie van de diverse S. viridis toetredingen en zes zaden van een kruising tussen S. viridis A10.1 en een enkele S. toetreding pumila. Echter, op dit moment hebben we niet bepaald als deze zaden het resultaat van een succesvolle testkruising of waren het resultaat van zelf-besmetting. Ongeacht, deze voorlopige resultaten suggereren dat de groeicondities voor S. viridis A10.1 kan worden gebruikt om kruisingen genereren met verschillende S. viridis toetredingen en mogelijk andere soorten Setaria.

Temp warmtebehandeling (° C)	Tijd warmtebehandeling (min)	# Kruisen	Gem. # Van bloemen na stuwing	Dag van bestuiving (dag na emasc)	Gem. # Zaden (rood) / pluim (gemiddelde)	Gem. % Gus (+) / zaden (rood)	Gem. # Hyb zaden (Gus +)	Min # HYB zaden	Max # hyb zaden
47	10	2	27	2e dag	0	0	0	0	0
48	3	3	36	2e dag	5	60	3	1	5
	4	3	25	3e dag	10	50	5	3	7
	5	8	25	2e dag	5	60	3	1	6
	6	3	25	2e dag	4	75	3	0	4
	7	4	24	2e dag	3	33	1	0	4
	7	1	25	3e dag	4	75	3	N / A	N /Een
49	1	3	23	2e dag	5	25	1	0	2
	2	7	26	2e dag	8	25	2	0	4
	3	5	22	2e dag	0	0	0	0	1
	4	4	25	2e dag	0	0	0	0	0

Tabel 1. Optimalisatie van de warmtebehandeling voor castratie. Resultaten van het veranderen van zowel de temperatuur en de tijd van de warmtebehandeling. Bestuiving werden uitgevoerd een ^(2e dag) of twee dagen ^(3e dag) na castratie en succesvolle outcrosses sgevuld met GUS kleuring

Figuur 1. Geoptimaliseerde kweekkameromstandigheden met een pre-dawn koudebehandeling. Temperatuur en perioden voor een optimale groei en synchroniteit van bloem productie worden getoond. Groene en rode pijlen geven optimale venster voor het uitvoeren van kruisen en ontmanning, respectievelijk.

Figuur 2. Pluim voorbereiding op kruising en GUS kleuring van outcross nageslacht. (A) Een pluim van Setaria viridis A10.1 voor trimmen, toont ongeveer 1/10 van de bloemen geopend. De vier delen en richting in de progressie van de bloei langs de pluim wordt getoond. (B) Een bijgesneden pluim voorafgaand aan castratie met haren behouden. (C) Een ontmand pluim na verwijdering van haren. (D) Een ontmand pluim op dag 2 na de castratie, waaruit bloemen die in bloei staan ​​(foto genomen om 10:30 AM). (E) Een pluim van de mannelijke ouder (transgene Setaria viridis A10.1 lijn met een β-glucuronidase (GUS) reportergen) dat bloeit na pre-dawn behandeling (foto genomen op 10:30). A m E, schaalbalk = 1 mm. (F) Vermeende uitkruising nakomelingen na GUS kleuring gedurende 2 uur gevolgd door distaining in 70% (v / v) ethanol. De twee zaden van rechts zijn negatieve en positieve controles, respectievelijk.

Figuur 3. Stroomschema van het protocol Een schematische weergave van de major stappen die betrokken zijn bij het ​​uitvoeren van S. viridis kruist.

Discussie

Het belang van pre-dawn behandeling

Om een ​​hoge frequentie van outcross nageslacht te vinden is het noodzakelijk om zeer synchrone bloemvorming van mannelijke en vrouwelijke ouders. In eerste instantie, we fietsten temperatuur en licht regimes (31 ° C/22 ° C, dag / nacht) en gebruikt de S. viridis toetreding A10.1 voor alle bestuiving. Onder deze omstandigheden, de meeste bloemen opent vroeg in de ochtend voordat de temperatuur stijgt tot 31 ° C, hoewel een paar bloemen open willekeurig tussen 08:00-8: 12:00. Eerdere studies in S. italica geven aan dat moment van de dag, locatie en het seizoen bij te dragen aan variatie in anthese ^7,15,16. Siles et al.. ⁶ opgemerkt dat anthesis werd geassocieerd met snelle veranderingen in temperatuur en vochtigheid, maar niet met een lage temperatuur en een hoge luchtvochtigheid, per se, zoals geconcludeerd in eerdere studies ^7,15. Daarom gebruikten we een vroege ochtenduren koudebehandeling van 15 ° C gedurende 30 min (van 08:30-9: 12:00) na te bootsende natuurlijke pre-dawn conditie. Deze pre-dawn koudebehandeling geholpen bij het synchroniseren van de bloei bij de ouders. We zagen dat ondanks de vaststelling kamer voor de relatieve luchtvochtigheid van 50%, de relatieve vochtigheid in de kamer verhoogd tot boven 70% als de temperatuur daalde van 22 ° C tot 15 ° C en bleef boven 70% zal blijven totdat de temperatuur geleidelijk gestegen tot 31 ° C na 09:30. Op 9:00, ontmand vrouwelijke ouders en planten van de mannelijke ouder worden naar het lab gebracht (T: 24.06 ° C ± 0,13 ° C, RH: 21.79% ± 1,15%). Bloemen van de mannelijke ouders beginnen opening rond 10:10, en bestuiving kan op 10:30-11 worden uitgevoerd: 12:00. Een gedetailleerde lijst van alle reagentia en apparatuur is opgenomen in tabel 2.

Belang van pluim voorbereiding voor castratie

Onder de kamer voorwaarden in dit onderzoek (figuur 1), de duur van de primaire pluim bloeien varieerde van2-3 dagen. Typisch, bloemen, gelegen op het distale midden van de bloeiwijze (Figuur 2A) geopend eerste en opening voorafgaat proximaal en distaal. Het ideale aantal bloemen op de pluim te bewaren is 20-30. Voorzichtigheid is geboden tijdens het verwijderen van onrijpe bloemen zodat alleen goed ontwikkelde bloemen (de bovenste bloem of grootste op de aartjes ¹⁷⁾ blijven behouden. Labeling met rode marker aan beide zijden van de bloemen helpt efficiënt onderscheiden vermeende uitkruising nakomelingen uit zaden van nieuw ontwikkelde bloemen na castratie. Bovendien is het belangrijk om de borstelharen op de pluimen verlaten voordat castratie de roosjes tegen voortgezette thermische beschadiging, maar als optie, kunnen verwijderd worden na castratie door veerkracht schaar om bestuiving vergemakkelijken, vooral wanneer een pluim bindende techniek wordt toegepast (fig. 2C en 2D).

Geoptimaliseerde temperatuur eend behandelingsduur voor warm water behandeling

De basis voor castratie door warm water dompelen is dat stuifmeel is gevoeliger voor warmte dan de gestigmatiseerde oppervlak. Echter, de duur en de temperatuur van de warmte-behandelingen variëren tussen Setaria soorten en toetredingen. In het algemeen zal een hogere temperatuur met een kortere behandeltijd of een lagere temperatuur met een langere behandeltijd hetzelfde effect op castratie hebben. Vermeld is dat een warmtebehandeling van 42 ° C gedurende 20 minuten ¹⁰ of 47 ° C gedurende 10 minuten ¹⁴ rendered S. italica pollen niet-levensvatbaar, maar de doeltreffendheid van deze behandelingen werd niet bepaald. Wij hebben ons protocol ontwikkeld na de hypothese dat onder een optimale temperatuur en behandelingsduur, pollen van bloemen op de vrouwelijke ouder zal onrendabele terwijl stempels open blijft behouden. Na vergelijken en analyseren van de effecten van verschillende temperaturen enbehandelingsperioden (tabel 1), vonden we dat de gevoeligheid voor de warmtebehandeling varieert tussen de aan elke pluim gehouden bloemen, dus is het moeilijk om zaden gevolg van zelfbestuiving volledig te elimineren. We concluderen dat de efficiëntie van de productie outcross nageslacht het grootst wanneer behandelingen worden uitgevoerd bij 48 ° C gedurende 3-6 min in S. viridis toetreding A10.1.

Piektijd van anthesis en kruisbestuiving

Wanneer de bloemen volgroeid en staan ​​op het punt om te openen, helmknoppen zijn geelachtig wit van kleur en stuifmeel wordt zodra helmknoppen exsert uit de bloemen ⁸ schuur. Helmknoppen geleidelijk bruin na stuifmeel wordt vergoten als de bloemen beginnen te sluiten. Eenmaal vrijgekomen, de levensvatbaarheid van pollen onbekend. Daarom is het essentieel om het stuifmeel zo snel mogelijk gebruikt worden geopend of vers geopende bloemen op de mannelijke ouder. Onder onze kamer omstandigheden (figuur 1), het merendeel van de blors van de mannelijke ouders beginnen te openen om 10:10 en de geopende bloemen schuur stuifmeel op 10:30. Zo is de gewenste venster voor het uitvoeren van de bestuiving is 10:30-11:00. De stigma's blijven buiten de kelkkafjes na bloemen dicht en kunnen ontvankelijk voor pollen zijn. Dit werd eerder waargenomen en bevestigd in S. italica dat de stigma ontvankelijk zijn voor ongeveer 48 uur na bloemopening door Siles et al.. ^6, dus het is belangrijk om tas pluimen na warmtebehandeling en na het uitvoeren van gecontroleerde kruisingen. Zoals hierboven besproken, raden wij presterende bestuiving zowel op dag 2 en dag 3 na de castratie.

Werkwijzen voor bestuiving

Wij vergeleken de efficiëntie van drie bestuiving technieken. Als bloeiende bloemen niet beperkend, pluim naar pluim bestuiving is de meest efficiënte techniek en zal een groter aantal nakomelingen outcross opleveren. Als blooming pluimen beperkend, een hogere frequentie van outcross nageslacht wordt geproduceerd wanneer de helmknop naar stigma methode. We hebben outcross nakomelingen verkregen van beide methodes met succes. De "bindende pluimen" methode is gebruikt bij het ​​oversteken van S. italica ⁶ maar we vonden deze methode om de minst efficiënte methode als het tijdvenster voor stuifmeel van de mannelijke ouder kort. Bovendien is er minder controle over bestuiving en haartjes van S. viridis pluimen kan ook de beweging van pollen hinderen op de gestigmatiseerde oppervlak.

Zaad oogsten, drogen en opslag

Na de oogst dient zaden bij 30-33 ° C gedroogd gedurende 2 dagen. Anthecium worden verwijderd GUS kleuring, indien nodig. Zaden moeten worden opgeslagen in een droge, koele plaats (T: 24.06 ° C ± 0,13 ° C, RH: 21.79% ± 1,15%) voor de korte-termijn opslag (minder dan twee jaar) of in een zaad kamer (T: 4,0- 10 ° C ± 1,0 ° C, RH: 20% ± 1%) voor langdurige opslag.Slechte bewaarcondities kan resulteren in lage levensvatbaarheid tarieven ^8. We hebben waargenomen dat de kiemkracht van S. viridis A10.1 ongeveer 5% bij gezaaid 4 dagen na de oogst, maar kan worden verhoogd tot 90-96% na opslag in het laboratorium (T: 24.06 ° C ± 0,13 ° C, RH: 21.79% ± 1,15%) voor 110 dagen na de oogst, gevolgd door een driedaagse stratificatie bij -80 ° C tot kiemrust te breken. Voor de stratificatie bij -80 ° C, kan droge zaden in een luchtdichte container (bv. micro-centrifugebuis of munt envelop in een afgesloten plastic zak) en te worden gehouden bij -80 ° C gedurende 3 dagen voor het planten. Na 16 maanden opslag in het laboratorium (T: 24.06 ° C ± 0,13 ° C, RH: 21.79% ± 1,15%), kan kieming percentages van 90-95% nog worden verkregen. Ook de slaaptoestand breken, zaden kunnen worden bij 30-33 ° C gedroogd gedurende 2 dagen na de oogst, en dan gegeven drie dagen stratificatie bij -80 ° C gevolgd door verwijdering vananthecium voor het planten. Na deze behandelingen, kan zaadontkieming percentages tot 33% worden bereikt.

Voordelen, beperkingen en eventuele wijzigingen

Hier hebben we de eerste standaard protocol voor het uitvoeren van kruisen in S. viridis A10.1 met behulp van een warmtebehandeling voor castratie. In tegenstelling tot fysieke castratie, dit protocol is minder invasief en relatief eenvoudig vast te stellen in een lab. Het duurt meestal ongeveer 15 minuten tot een pluim trimmen en ongeveer 15 pluimen kunnen worden bijgesneden en gekruist / persoon / dag. Uitgaande van een gemiddelde van 3-5 outcross nakomelingen / pluim kan onder optimale omstandigheden worden hersteld, kan een totaal van 45-75 outcross nakomelingen worden geproduceerd door een persoon in een enkele dag. Bovendien kan deze techniek worden toegepast kruisen in andere Setaria species, hoewel extra optimalisaties zal waarschijnlijk. Als groei kamer ruimte is beperkt, kunnen planten worden gekweekt in groen huis of groei kamers zonder een pre-dawn Treatment totdat de pluim komt voordat zij naar de kamer geoptimaliseerde omstandigheden.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Scharen, veer	World Precision Instruments, Inc	14126
Pincet, Dumostar Biology Polished	SPI Supplies	TD5BP-XD
Chirurgische scharen	F.S.T (Fine Science Tools)	14005-12
Europack Clear Polypropylene Micro-Perforated Crusty Broodzakken 6"x28"	http://www.pjpmarketplace.com	361001
Flats	T.O. Plastics	715401C
metro mix 360	Hommert International	10-0356-1
Jack's 15-16-17	Hommert International	07-5925-1
Kimwipes	VWR International	34120
Sharpie Ultra Fine Point Permanent Markers, Rood	Staples	37002
Donegan DA-10 OptiVisor Hoofdbandvergroter, 3,5x Vergroting, 4" Brandpuntsafstand	Amazon	DA-10, B0015IP380
12"24/7 Verpakkingsimpulszeefmachine Poly Sealing Free Element Grip	Amazon	N/A
waterbad	VWR scientific	Model: 1166
BDW walk in plant groeikamer	Conviron	BDW 40