Wonen Imaging Assay voor het beoordelen van de Rollen van Ca<sup&gt; 2 +</sup&gt; En sphingomyelinase in de Reparatie van Pore-vormende Toxine Wonden

Samenvatting

Beeldvorming van levende cellen blootgesteld aan de lipofiele kleurstof FM1-43 maakt nauwkeurige bepaling van de kinetiek waarmee poriënvormende toxines worden verwijderd uit de plasmamembraan. Dit is een gevoelige test die kan worden gebruikt om vereisten voor Ca ^{2 +,} sphingomyelinase en andere factoren plasmamembraan reparatie beoordelen.

Samenvatting

Plasmamembraan letsel is een frequente gebeurtenis en wonden snel worden gerepareerd cellulaire overleven. Instroom van ^{Ca2 +} is een belangrijke signalerende gebeurtenis die de reparatie van mechanische wonden veroorzaakt op het plasmamembraan binnen ~ 30 sec. Recente studies toonden aan dat zoogdiercellen hun plasmamembraan sluit ook na permeabilisatie met porievormende toxinen in een ^{Ca2 +-afhankelijk} proces dat exocytose van het lysosomale enzym zure sphingomyelinase gevolgd door endocytose poriën omvat. Hier beschrijven we het gebruik aan te tonen dat het opnieuw afdichten van de cellen permeabel gemaakt door het toxine streptolysine O is snel en afhankelijk van ^{Ca2 +} influx methodologie. Het testontwerp kan synchronisatie van de schade gebeurtenis en een nauwkeurige kinetische meting van het vermogen van cellen om plasmamembraan integriteit herstellen door beeldvorming en kwantificeren van de mate waarin de liphophilic kleurstof FM1-43 intracellulaire membranen bereikt. Deze live test ALSo kan een gevoelige beoordeling van het vermogen van exogeen oplosbare factoren zoals sphingomyelinase toegevoegd FM1-43 influx remt, die het vermogen van cellen om hun plasmamembraan herstellen. Deze test liet ons te tonen voor de eerste keer dat sphingomyelinase handelt stroomafwaarts van ^{Ca2 +-afhankelijke} exocytose, omdat extracellulaire toevoeging van het enzym bevordert opnieuw afdichten van de cellen permeabel in afwezigheid van ^{Ca2 +.}

Inleiding

Het is bekend voor enkele tientallen jaren dat plasmamembraan herstel na mechanische letsel is een Ca ^{2 +-afhankelijk} proces ^1,2. Latere studies toonden aan dat ^{Ca2 +} influx door de wond veroorzaakt een krachtig proces van exocytose intracellulaire blaasjes op de plaats van letsel, die nodig is voor het opnieuw afdichten ^3,4. Het verlies van een fluorescente kleurstof in het cytoplasma van cellen opgeladen werd gebruikt om de snelheid van herstel beoordelen en concludeerde dat opnieuw afdichten is binnen <30 sec na verwonding ^5. Twee modellen werden in eerste instantie voorgesteld om de eis voor exocytose in plasmamembraan reparatie uit te leggen: 1) de "patch"-model, dat suggereerde dat Ca ^{2 +} influx door het letsel veroorzaakt aanvankelijk homotypische fusie van intracellulaire blaasjes, de vorming van een grote "patch" Dat zou vervolgens toegepast op het plasmamembraan naar de wond ⁶ en 2) de spanning verminderen model, dat dat membraan Adde voorgestelde sluitd door ^{Ca2 +-afhankelijke} exocytose in de nabijheid van de wond zou plasmamembraan spanning te verminderen, vergemakkelijken opnieuw afdichten van de bilaag ^7. De rol van ^{Ca2 +-geactiveerd} exocytose bij plasmamembraan reparatie werd verder versterkt door studies die aantonen dat lysosomen bevatten Ca ^{2 +} sensor molecule, synaptotagmin VII, waarin hun exocytose en plasmamembraan reparatie beschadigde cellen vergemakkelijkt ^8,9,10,11 .

Echter aanvullend bewijs aangegeven dat exocytose niet voldoende was om plasmamembraan kan herstellen. Naast mechanische tranen op het plasmamembraan, frequente vorm van celbeschadiging is permeabilisatie door poriënvormende toxinen geproduceerd door bacteriën ^12,13 of immuuncellen ^14,15. In tegenstelling tot mechanische tranen, porievormende eiwitten plaatst zichzelf op de plasmamembraan de vorming van een stabiele,-eiwit gevoerde porie die niet zomaar kunnen worden afgesloten door een membraan "patch" of door verminderinging membraan spanning. Intrigerend studies blijkt dat zoogdiercellen een efficiënt mechanisme om hun plasmamembraan herstellen na permeabilisatie met porie-vormende eiwitten, en dit proces vereist ook de aanwezigheid van extracellulair Ca ^{2 + 12.} Deze bevinding de vraag opgeworpen of transmembraan porie verwijdering uit het celoppervlak was ook een snel proces, zoals waargenomen met mechanische wonden ^5. Verrassenderwijs onze recente studies aangetoond dat het opnieuw afdichten van de cellen permeabel gemaakt met poriënvormende toxinen zeer vergelijkbare eigenschappen aan de reparatie van mechanische wonden: het proces vereist extracellulair Ca ^{2 +,} en is binnen ~ 30 sec. Onderzoeken deze werkwijze nader we onlangs vernomen dat naast Ca ^{2 +-gereguleerde} exocytose van lysosomen, plasmamembraan reparatie omvat een snelle vorm van endocytose, die wordt veroorzaakt door de afgifte van lysosomale enzym zure sphingomyelinase (ASM) en is essentieel niet alleen voor ee verwijdering van transmembraan poriën, maar ook voor het herstel van mechanische wonden ^16.

Om de kinetiek van cel nieuwe sluiting na permeabilisatie met porievormende eiwitten te bepalen, in ons laboratorium hebben we aangepast een live imaging methode die eerder had gebruikt om opnieuw afdichten van geïsoleerde-laser gewond spiervezels ¹⁷ beoordelen. Deze test is gebaseerd op eigenschappen van de lipofiele kleurstof FM1-43, die stabiel intercaleert in de buitenste laag van lipide bilagen verhoging in fluorescentie-intensiteit. Wanneer de plasmamembraan dubbellaag verstoord extracellulaire kleurstof toegang krijgt tot intracellulaire membranen, die een gevoelige test voor plasmamembraan letsel detecteren en repareren ^18,16,19,20. Om deze test te passen voor de beoordeling van de cel opnieuw sluiten na permeabilisatie met poriën vormende eiwitten, we pre-cellen geïncubeerd bij 4 ° C met bacteriële toxine streptolysine O (SLO), dat bindt aan cholesterol membraan ^21. Synchrone celpermeabilisatie kan vervolgens eenvoudig worden bereikt door het verplaatsen van de cellen van ijs verwarmen medium in een verwarmde microscoop fase die de oligomerisatie en verandering in conformatie die leidt tot de vorming van transmembraan porie activeert. Een voordeel van deze benadering op de eerder gepubliceerde tests met laser verwonding is dat een groter aantal cellen tegelijk kan worden geanalyseerd in een microscopisch veld, betere bemonstering van de celpopulatie. Gezien de overeenkomsten tussen de mechanistische cel nieuwe sluiting proces gezien na mechanische verwonding en permeabilisatie met porievormende toxinen, de test hier beschreven verschaft een zeer veelzijdige en krachtige werkwijze voor het ontleden van factoren betrokken bij het fundamentele proces van plasmamembraan reparatie. Als voorbeeld wordt aangetoond dat het mogelijk is om deze test te gebruiken om ^{Ca2 +} afhankelijke en onafhankelijke stappen van het reparatieproces te identificeren.

Protocol

1. Transcriptionele silencing van ASM

1. Zaad 1,5 x 10 ⁵ HeLa-cellen in 2 ml DMEM kweekmedium (DMEM hoog glucose met 10% foetaal runderserum (FBS), 2 mM L-glutamine, 1% Penn-Strep) op 35 mm glazen bodem gerechten (MatTek) en incubeer overnacht bij 37 ° C in een 5% _CO2 incubator.
2. Op de volgende dag, aspireren van de groei media en vervang deze door 2 ml DMEM gereduceerd serum medium (DMEM met 4% FBS), ten minste 1 uur voor het toevoegen van de siRNA transfectie mengsel.
3. Bereid 4 buizen voor de siRNA oligo transfectie mengsel. In de buizen A en C, voeg 250 pl Optimem verlaagde serum en 4 pi Lipofectamine RNAiMax, per 35 mm schaal worden getransfecteerd. In buis B, voeg 250 ul van Optimem verminderde serum en 8 pi (160 pmol) of control medium GC inhoud oligo (Control siRNA), per 35 mm schaal worden getransfecteerd. In buis D, voeg 250 ul van Optimem verminderde serum en 8 pi (160 pmol) van SMPD1 oligo (asme), per 35 mm schaal to worden getransfecteerd. Incubeer de buizen bij kamertemperatuur gedurende 5 minuten.
4. Combineer buizen A en B om de transfectie complex voor controle siRNA, en buizen C en D voor de ASM siRNA vormen. Incubeer de reactie bij kamertemperatuur gedurende 20 minuten.
5. Voeg de controle siRNA en ASM siRNA transfectie reactiemengsels langzaam druppelsgewijs in de respectievelijke 35 mm glazen bodem gerechten en incubeer bij 37 ° C / 5% _CO2. Op 24 uur na transfectie, Zuig voorzichtig uit de media en te vervangen door vers DMEM groeimedia. Voor een efficiënte ASM knockdown dient de vaat verder geïncubeerd bij 37 ° C / 5% _CO2 gedurende 31 uur (totaal 55 uur) voor levende beeldvorming.

2. Bereiding van reagentia voor Live microscopie

1. Bereid een oplossing van recombinant poriënvormende toxine streptolysine O (SLO) bij een concentratie van 100 ng / ul in koud 1x PBS zonder ^{Ca2 +} en ^{Mg2 +.} De SLO gebruikt in deze assays een constitutively actieve cysteïne mutant die niet vereist reductiemiddelen activiteit, vriendelijk verschaft door Dr Rod Tweten, University of Oklahoma. Het toxine werd uitgedrukt in E. coli BL21 DE3 en gezuiverd onder natieve omstandigheden, zoals hiervoor ¹⁶ beschreven.
2. Bereid de FM1-43 stockoplossing: Hersuspenderen FM1-43 gevriesdroogd poeder in DMSO om een ​​25 mM oplossing te creëren.
3. Bereid Oplossing A: Verdun de FM1-43 voorraadoplossing in koude DMEM met ^{Ca2 +} tot een eindconcentratie van 4 uM (1,5 ml nodig per MatTek schaal) en bewaar op ijs totdat het nodig is.
4. Bereid Oplossing B: Verdun de FM1-43 voorraadoplossing in koude DMEM zonder ^{Ca2 +} en 10 mM EGTA (Ca ^{2 +-vrij} DMEM) tot een uiteindelijke concentratie van 4 pM (1,5 ml nodig per MatTek schaal) en bewaar op ijs tot nodig.
5. Voorverwarmen (37 ° C) 1 ml aliquots van oplossing A en oplossing B in Eppendorf buizen.
6. Blijf op ijs oplossingen van DMEM met Ca ^{2 +,} en C^{2 +-vrij} DMEM.

3. Live cell imaging van FM1-43 Instroom in SLO behandelde en onbehandelde cellen

1. Vul een middelgrote ondiepe metalen container met crushed ijs, keer het in een grote glazen bak met ijs, en voeg extra ijs waardoor alleen de onderkant van de metalen container blootgesteld. Leg een natte papieren handdoek op de blootgestelde metalen bodem te zorgen voor gelijkmatige warmtestroom.
2. Neem een controle siRNA behandelde MatTek gerecht (monster 1) en plaats het op de koude natte papieren handdoek. Aspireren voorzichtig uit alle media en was 3x met koud Ca ^{2 +-vrij} DMEM. Na de laatste wasbeurt, zuigen uit alle media in de schotel.
3. Om het celgebonden FM1-43 in cellen zonder SLO verwonding (monster 1) in aanwezigheid van ^{Ca2 +,} voeg 180 ul koude oplossing B naar het centrum glazen dekglaasje van 35 mm glazen bodem schaal en incubeer gedurende 5 min op ijs (tabel 1).
4. Plaats MatTek schotel op het podium van een confocale microscoop verwarmd tot 37 ° C en voorzien van een klimaatkamer (welke temperatuur, vochtigheid en _CO2 vasthoudt). Zoek het gebied van cellen die zal worden afgebeeld die door een 40X NA 1.3 objectief (Nikon). Indien beschikbaar, zet PerfectFocus of een soortgelijk instrument om te corrigeren voor thermische drift.
5. Voeg 1 ml voorverwarmde oplossing A zachtjes aan de zijkant van de 35-mm schaal en plaats cover van klimaatkamer (tabel 1).
6. Acquire beelden gedurende 4 min bij 1 beeld per 3 seconden met behulp van geschikte imaging software (Volocity in de UltraView Vox Perkin Elmer draaiende schijf confocale microscopie-systeem). Excitatie van FM1-43 wordt bereikt met een 488 nm laser lijn met behulp van een dichroic filter met een 488 nm band pass, en discriminatie emissie wordt bereikt door gebruik van een 527 (W55) emissie-filter. Laservermogen niveaus en camera gevoeligheid ingesteld op de foto om de blootstelling van 100 msec bereiken.
7. Herhaal stap 3,2-3,6 detecteren FM1-43 in control siRNA behandelde cellen zonder SLO verwonding (monster 2) in afwezigheid van ^{Ca2 +,} behalve dat in stap 3,5 Oplossing B worden toegevoegd (Tabel 1).
8. Om FM1-43 instroom meten in controle siRNA behandelde cellen gewonden met SLO, hetzij in aanwezigheid (Monster 3) of afwezigheid van Ca ^{2 +} (monster 4), voeg 180 ul van koude Oplossing B SLO naar het centrum glazen dekglaasje van de 35-mm glazen bodem schaal en incubeer gedurende 5 minuten op ijs zoals in stap 3.3. Herhaal stap 3,2 tot 3,6; passen voegen ofwel Oplossing A en Oplossing B bij stap 3.5 (tabel 1).
9. Om de rol van ASM in plasmamembraan reparatie bepalen, herhaalt u de stappen 3,2-3,6 behulp van ASM-siRNA behandelde cellen voor alle omstandigheden (Monsters 5-8) (tabel 1).
10. Om de rol van extracellulaire recombinant sphingomyelinase (SM) op het bepalenkinetiek van plasmamembraan reparatie (gereflecteerd door de remming in FM1-43-instroom) (Monsters 9-10), SM wordt toegevoegd (0-50 uE) om ofwel Oplossing A of Oplossing B in stap 3.5 en vervolgens aan cellen toegevoegd tijdens levende cellen beeldvorming in een totaal volume van 1 ml (tabel 1).

4. Kwantificering van FM1-43 Instroom in cellen

1. Na films zijn verworven, het meten van de intracellulaire fluorescentie-intensiteit van FM1-43 met behulp van beeldanalyse-software (Volocity Suite, PerkinElmer). Teken een gebied van belang in het cytosolische gebied van elke cel in het veld en de software toepassing op de gemiddelde FM1-43 fluorescentie-intensiteit in alle frames van de video te bepalen.
2. Om corrigeren voor variaties in de oorspronkelijke FM1-43 kleuring, de data voor elke video wordt uitgedrukt als voudige toename in fluorescentie-intensiteit in de tijd en uitgezet voor elke andere toestand. De voudige toename in fluorescentie van elk tijdspunt percel wordt berekend als F _T / V _0, waarbij F _T de gemiddelde fluorescentie op specifieke tijdpunt en F ₀ is de gemiddelde fluorescentie bij t = 0 (figuren 1-2).

Resultaten

Lage concentraties van bacteriële sfingomyelinase (SM) redding plasmamembraan reparatie in cellen waaruit lysosomale zuur sfingomyelinase.

De FM1-43 imaging test toonden eerder we cellen deficiënt voor het lysosomale enzym ASM en blootgesteld aan SLO verwonding in aanwezigheid van ^{Ca2 +} een plasmamembraan defect wordt gered door extracellulaire toevoeging van recombinant menselijk enzym ^19. Aangezien de menselijke lysosomale ASM heeft een lage pH-optimum hebben we onderzoc...

Discussie

Eerdere studies op mechanische schade en plasmamembraan reparatie vertrouwd op diverse mechanismen van het verwonden van cellen, variërend van het laten vallen van glazen kralen, micropipetteren, scheren, krassen of schuren. Het uitlezen van al deze testen was kwalitatieve dan kwantitatieve, en heeft nauwkeurige informatie over de kinetiek van de reparatie-mechanisme niet geven. Het vermogen van cellen om hun plasmamembraan gesloten worden deze vormen van schade werd gemeten door de aanwezigheid of afwezigheid van trace...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Reagens
HeLa 229 cellijn	ATCC	CCL2-1
DMEM Hoge Glucose	Invitrogen	11965
DMEM Hoge Glucose Zonder Calcium	Invitrogen	20168
FM1-43	Invitrogen	T3163
Optimem Verminderd Serum	Invitrogen	31985
Lipofectamine RNAiMax	Invitrogen	13778
Control medium GC inhoud RNAi oligo	Invitrogen	12935300
SMPD1 RNAi oligo	Invitrogen	HSS143988
Fetaal Rundserum Hitte-geïnactiveerd	Gemini-Bioproducts	100-106
Sphingomyelinase van Bacillus cereus	Sigma	S7651
35 mm-glasbodem schalen	MatTek	P35G-0-14
Materiaal
Omgekeerd microscoop	Nikon	Eclipse Ti
Camera	Hamamatsu Photonics	C9100-50
Spinning disk confocal microscoop	PerkinElmer	UltraViewVoX
Software analysesoftware	PerkinElmer	Volocity Suite
Omgevingskamer	Pathology Devices	LiveCell System Chamber