One Minute, Sub-One-Watt Fotothermische Tumor Ablation behulp Porphysomes, Intrinsieke Multifunctionele nanovesicles

Samenvatting

We ontwikkelden nieuwe intrinsieke multifunctionele nanovesicles genaamd porphysomes, welke structuur-afhankelijke fluorescentie zelf-afschrikken en unieke fotothermische eigenschappen hebben, waardoor het als krachtige fotothermisch therapie agenten. We formuleerden porphysomes behulp van hoge druk extrusie en onderzocht hun fotothermische therapie werkzaamheid bij een xenograft tumor model.

Samenvatting

We hebben onlangs porphysomes als intrinsiek multifunctioneel nanovesicles. Een fotosensibilisator, pyropheophorbide α, werd geconjugeerd met een fosfolipide en zelf-geassembleerde met liposoom-achtige bolvormige blaasjes. Vanwege de extreem hoge dichtheid van porfyrine in de porfyrine-lipide bilaag, porphysomes genereerden grote extinctiecoëfficiënten, structuur-afhankelijke fluorescentie-quenching zelf en fotothermische uitstekende werkzaamheid. In onze formulering porphysomes werden gesynthetiseerd met behulp van hoge druk extrusie, en toonde een gemiddelde deeltjesgrootte ongeveer 120 nm. Vierentwintig uur na intraveneuze injectie van porphysomes, de lokale temperatuur van de tumor verhoogd van 30 ° C tot 62 ° C kan bij blootstelling minuut van 750 mW (1,18 W / cm ^2), 671 nm laserbestraling. Na de volledige thermische ablatie van de tumor, roofvorming gevormd en genezen binnen 2 weken, terwijl de controlegroepen de tumoren blijven groeien en bereikten allen gedefinieerde end punt binnen 3 weken. Deze gegevens tonen hoe porphysomes kan worden als krachtige fotothermische therapie (PTT) middelen.

Inleiding

Porphysomes zijn nieuw multifunctioneel nanovesicles dat we onlangs ontwikkeld die in staat van multimodale beeldvorming en therapie ¹ zijn. Ze worden gevormd van zelf-geassembleerde porfyrine dubbellagen en bevatten een zeer hoge dichtheid van porfyrine (meer dan 83, 000/porphysome deeltje), die groot extinctiecoëfficiënt en resulteert in unieke structuur-afhankelijke fluorescentie zelf-uitdoving genereert. Porphysomes goede in vivo farmacokinetische en biodistributie eigenschappen: ze vertonen een bloed halfwaardetijd van 12 uur na systematische toediening en passief accumuleren in xenograft tumoren met 7,5% ID / g bij 24 uur na injectie ^2.

Hun unieke structuur en fysisch-chemische eigenschappen maken porphysome een goede kandidaat voor multimodale beeldvorming en beeld-geleide therapie. Allereerst bevattende porfyrine, porphysomes intrinsiek geschikt voor fluorescentie beeldvorming van tumoren bij de tumor accumulatie ^1.Bovendien, elke porfyrine een stabiele plaats voor chelerende radioisotopen kan daarom porphysomes gemakkelijk gelabeld met radioisotopen zoals 64Cu PET beeldvorming ^3. Verder wordt de geabsorbeerde lichtenergie thermisch gedissipeerd onder laserbestraling blootstelling bij porphysome intact is, zo porphysomes vertonen ook uniek foto-akoestische beeldvorming en PTT mogelijkheden. Het is aangetoond dat 24 uur na intraveneuze injectie van porphysomes, laserbestraling van de porphysome geaccumuleerde tumor veroorzaakte een snelle temperatuurstijging en sterke fotothermische tumor ablatie. Dit toonde aan dat porphysomes efficiënt fotothermisch enhancers met uitsterven coëfficiënt zo hoog als gouden nanodeeltjes (AuNPs) ^1. Aan de andere kant, in vergelijking met andere anorganische fotothermische middelen, waaronder AuNPs, porphysomes tonen een opmerkelijke voordeel bioveiligheid vanwege hun organische aard. Porphysomes zijn enzymatisch biologisch afbreekbaar en veroorzaken minimale acute toxicity in muizen met intraveneuze doses tot 1000 mg / kg ^1. Bovendien vergelijkbaar met liposomen, de grote waterige kern van porphysomes kan passief of actief zijn geladen met therapeutische of beeldvorming. De optische eigenschappen en biocompatibiliteit van porphysomes tonen de multimodale mogelijkheden van organische nanodeeltjes voor biofotonische beeldvorming en therapie.

In dit artikel introduceren we de synthesewerkwijze van pyropheophorbide-lipide conjugaten, de productie en de karakterisering methode porphysomes onder hoge druk extrusie. In vivo PTT op muizen wordt ook uitgevoerd om de efficiëntie van porphysome mogelijk PTT in de tumor tonen behandeling met behulp van een subcutane xenograft tumor model.

Protocol

1. Synthese van Pyropheophorbide lipide

1. Combineer 200 mmol pyropheophorbide (bereid uit Spirulina algen zoals hierboven beschreven;... Zheng et al., Bioconj Chem, 2002, 13, -392) ^4, 98,7 mg 16:00 lysophophatidylcholine (1-palmitoyl-2-hydroxy-sn-glycero -3-fosfocholine, Avanti Polar Lipids # 855.675), 76,3 mg EDC, 48,7 mg DMAP (4 - (dimethylamino) pyridine) in 5 ml amyleen gestabiliseerd chloroform voor een verhouding van 1:1:2:2 Pyro: Lipide: EDC : DMPA.
2. Roer het reactiemengsel bij kamertemperatuur onder argon gedurende 24 uur. Damp het chloroform onder verminderde druk met een rotatieverdamper onder verwarmen tot 40 ° C. Het mengsel van pyro-lipide isomeren (pyro bevestigd aan de sn-1 of sn-2 positie) wordt geproduceerd.
3. Resuspendeer pyro-lipide isomeer mengsel in 1 mM _CaCl2, 50 mM Tris (pH 8), 0,5% Triton X-100 en 10% methanol bij een concentratie van 5 mg / ml. Voeg fosfolipase A2 (PLA2) van honingbij gif op0,1 mg / ml concentratie en incubeer de oplossing bij 37 ° C gedurende 24 uur tot sn-1 pyro-lipide verteren en het zuivere sn-2 pyro-lipide isomeer.
4. Voeg extra 2 volumes chloroform en 1,25 delen methanol, extract, en verwijder het oplosmiddel met behulp van roterende verdamping bij verminderde druk bij 40 ° C. Resuspendeer de splitsing product in 1% MeOH in DCM en zuiveren over een kleine diol silica kolom voor de isomeer zuivere pyro-lipide.

2. Bereiding van Porphysomes

1. Los pyropheophorbide lipide, distearoyl-sn-glycero-3-fosfoethanolamine-N-methoxy (polyethyleenglycol) (PEG-2000-PE) en cholesterol in chloroform afzonderlijk, respectievelijk nemen de concentraties.
2. Bereid porphysome lipide film in een 12x75 mm borosilicaat reageerbuis met een totale lipidegehalte van 5 mg / leiding combineert 65 mol% porfyrine-lipide, 5 mol% PEG-2000-PE en 30 mol% cholesterol.
3. Droog het lipide films onder een stroom nitrogen gas en laat ze verder gedroogd onder vacuüm gedurende 1 uur. Bewaar de lipide films bij -20 ° C onder argon tot toekomstige hydratatie en extrusie.
4. Voeg 1 ml fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS, 150 mM NaCl, 10 mM fosfaat, pH 7,4) aan elke buis lipidefilm. Bevries de reageerbuis in vloeibare stikstof tot het volledig bevroren, en vervolgens ontdooien de buis in 65 ° C waterbad totdat het monster is al gesmolten. Vortex de buis voor een totaal van 30 seconden (3 x 10 seconden elk met 5 sec naverwarming bij 65 ° C waterbad tussen elk vortexen).
5. Herhaal de vries-dooi voor 5 cycli of meer bij benodigde totdat er geen grote aggregaten kan worden waargenomen in de gehydrateerde oplossing. Laat de porphysome schorsing op ijs als je klaar bent.
6. Monteer de hogedruk extruder (10 ml) met twee gestapelde 100 nm polycarbonaat filters geïnstalleerd inch Connect de thermobarrel extruder een gethermostreerde circulatiepomp voor 65 ° C circulerend waterbad, en sluit de extruder systeem om een ​​stikstof tank voor hoge drukzeker aanbod.
7. Breng de porphysome schorsing aan de extruder kamer met een 9 inch glazen pipet overdracht. Stel de druk door de draaiknop op de stikstof tank regulator tot een lees tussen de 200 en 300 psig wordt waargenomen als eerste extrusiedruk. Open de klep van de drukregelaar geleidelijk totdat voldoende porphysome debiet wordt bereikt of een maximum van 800 psig (5440 kPa) druk is bereikt.
8. Na de eerste extrusie pas is voltooid, sluit u het drukregelventiel en laat de druk van de extruder door het openen van het overdrukventiel op de extruder top. Vul de extruder met de vers geëxtrudeerde porphysome oplossing en herhaal de extrusie gedurende ten minste 10 maal te zorgen voor de uiteindelijke geëxtrudeerde oplossing homogeen is.
9. Bepaal de concentratie van de uiteindelijke porphysome oplossing door meting van de absorptie van een verdunde monster in methanol door UV-Vis spectrometer. Bereken de concentratie met de volgende vergelijking with de extinctiecoëfficiënt van 97.000 M ^-1 cm ^-1 bij 410 nm voor pyropheophorbide-lipide.

10. Meet de uiteindelijke grootte verdeling van porphysomes met een Malvern Zetasizer ZS90 door dynamische lichtverstrooiing. Verdunnen porphysome oplossing in PBS en voeren drie metingen met 15 runs elk voor de gemiddelde resultaten.
11. Bepaal de fluorescentie quenching van porphysome door vergelijking van de fluorescentie-emissie van geblust porphysome (1 mM in PBS) en afgeschrikte porphysome (1 mM in 1% Triton X-100) met Spectrofluorometer. Neem de spectra voor en na de detergens (Tirton X-100) toegevoegd, en het normaliseren signaal lezen maximale fluorescentie. Stel de excitatie tot 410 nm en emissie golflengte 600-800 nm zijn.
12. Houd porphysomes oplossing onder argon bij 4 ° C tot toekomstig gebruik, en het te beschermen tegen licht door het aluminium folie.

3. Voorbereiding van Animal xenograftmodel

1. Cultuur de KB cellen in RPMI-1640 (met 10% FBS) en houden de cellen in 5% _CO2 en bevochtigde atmosfeer bij 37 ° C.
2. Harvest KB cellen met behulp van standaard celkweek techniek. Houd de celsuspensie (20.000 cellen / ml) in met fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS) op ijs voor kortstondige opslag tot het moment van injectie.
3. Bereid een KB xenograften op naakt muizen. Naakt muizen worden gekocht van Charles River Laboratories als ze 20 g (Categorie # CRL: NU (NCR)-Foxn1 ^nu, 6-7 weken oud), gegeven standaard dieet en beddengoed (Harlan Laboratories; Dieet: doorstraald LM-485, # 7912; Bedding: maïskolf beddengoed, ¼ ", # 7097). Steriliseer alle dierlijke hanteren instrumenten van de (spuit, tang, en dierlijke pad) voorafgaand aan de experimenten. Verdoven muizen met 2% isofluraan v / v in 100% zuurstof dragergas. Alle dierlijke protocollen worden goedgekeurd door de instelling (University Health Network in dit geval) Animal Care en gebruik Comite.
4. Injecteer tumorcellen gesuspendeerd in PBS subcutaan aan de rechter flank van muizen. Muizen zijn klaar om gebruikt te worden na 10 dagen wanneer de tumor bereikt een diameter van 4-5 mm en een dikte van 2-3 mm.

4. In vivo Fotothermisch Therapy

1. Injecteren porphysomes (met 750 nmol pyro bij 200 pi volume) intraveneus via staart ader. Voeren laserstraling 24 uur na injectie van porphysomes.
2. In deze paragraaf over tot alle procedures in een afgesloten laserveiligheid kamer. Draag laser veiligheidsbril tijdens laser bestraling.
3. Stel de laser bestraling apparatuur. Houd de laser vezel en een diffusor met een klem op een stand. Stel het laservermogen op een laag niveau en zet de laser. Stel de hoogte van de laser fiber om een bestraling oppervlakte van 9 mm in diameter bereiken (DPSS Laser, LaserGlow Technologies, Toronto, Canada), kalibreren het laservermogen tot 750 mW (1,18 W / cm ²⁾ met behulp van apower meter en zet de laser om de dieren te bereiden.
4. Verdoven van de dieren met 2% isofluraan v / v in 100% zuurstof drager gas door neuskegel geen wegvangen evident van isofluraan een risico voor de menselijke gezondheid gevaar). Bevestigen dat het dier diep genoeg wordt verdoofd door het uitvoeren van een teen knijpen met een pincet of vingers om achterpoten dier. De dieren zijn klaar voor laserbestraling wanneer ze reageren op deze procedure.
5. Bewaken van de tumor temperatuur met een infrarood thermische camera (Mikroshot, LUMASENSE Technologies). Plaats de camera in de buurt van de tumor, richten het goed en een pre beeld PTT evenals een gewone afbeelding voordat PTT bestraling begint wit licht nemen.
6. Zet de laser weer, en verhoging van de lichtsterkte tot 750 mW. Plaats de tumor in het centrum van de laserbundel te krijgen de tumor volledig bedekt, en start timing van de bestraling. Neem het imago van de tumor temperatuur om de 5 seconden voor een minuut laserbehandeling. Zet de laser op 1 min.. Stop de gastoevoer van 2% isofluraan, wachten tot het dier herstelt van de narcose en weer terug naar de kooi.
7. Houd muizen op normothermie dier kamer onder 00:12 uur donker en licht cyclus volgens dier protocollen door University Health Network goedgekeurd. Injecteren Buprenorfine (0,05 mg / kg, subcutaan tweemaal per dag gedurende een week na de laser bestraling om de pijn veroorzaakt door het litteken te verminderen. Om de twee dagen, het meten van de tumor diameter met een schuifmaat en maak een foto. Bereken de tumor volume met de volgende vergelijking: V = π / 6 · a · ^b2, waarbij a de lange diameter en b de korte.
8. Offer de dieren door ze in CO ₂ zijn ondergebracht als de lange diameter van de tumor bereikt 10 mm, want het is het gedefinieerd eindpunt in ons laboratorium. Voer cervicale dislocatie na de behandeling CO2. Teken de survival curve.

Resultaten

Pyropheophorbide is geconjugeerd aan het fosfolipide als een stabiele lipide monomeer (figuur 1a) en de conjugaten zelf-assembleren porphysomes membraan te vormen door extrusie onder toepassing van een hoge druk extruder. Het is meestal moeilijk om porphysome-lipidesuspensie extruderen tijdens de eerste 3 cycli van extrusie met een relatief langzame doorstroming. Naarmate meer extrusies worden herhaald, de stroomsnelheid van geëxtrudeerde oplossing geleidelijk toe en druk kan enigszins worden verminderd...

Discussie

Bij de ontwikkeling van drug delivery technologieën, multifunctionele nanodeeltjes worden momenteel breed onderzoek voor een nauwkeurige opvolging van de drug delivery voertuig, terwijl het handhaven van een hoge drug laadvermogen. Porfyrine beladen liposomen ontwikkeld betere farmacokinetische eigenschappen en meer efficiënte levering dan directe toediening van porfyrine, maar belemmert, waaronder de beperkte laden hoeveelheid porfyrine en snelle herverdeling van porfyrine van liposomen aan plasmaproteïnen ^5,6.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Rotary evaporator	Thermo-Savant	SPD131DDA
Votex	Scientific Industries	SI-0236	Model number: G560
High pressure extruder	LIPEX, Northern Lipids Inc.	T.001	10 ml Thermobarrel Extruder
Heated bath circulators (Thermostatted circulator)	Thermo SCIENTIFIC	SC100-S5P
Polycarbonate filters	Avanti Polar Lipids	610005	Pore size 100 nm, and membrane diameter 19 mm
Zetasizer	Malvern Instruments	ZS90
UV/Visible Spectrophototmeter	Varian Australia	Cary 50 Bio UV/ Visible Spectrophotometer
Spectrofluorometer	HORIBA Scientific	FluoroMax-4
Transmission Electron Microscopy (TEM)	Hitachi	H-7000
Cell culture incubator	SANYO	MCO-18AIC
Powermeter	Thorlabs	PM100D	met sensor S142C
671nm Laser	LaserGlow Technologies	LRS-0671_PFN-02000-05	S/N:10097270
Infrared Thermometer	Mikroshot, LUMASENSE Technologies	9102409
Laser protective eye goggles	LaserGlow Technologies	AGF6602XX	Optical Density: 1.5+ bij 630-700 nm