Synthese, Cellular Levering en<em&gt; In vivo</em&gt; Toepassing van Dendrimeer-gebaseerde pH Sensoren

Samenvatting

Fluorescentie sensoren zijn krachtige hulpmiddelen in life science. Hier beschrijven we een methode te synthetiseren en te gebruiken dendrimeer gebaseerde fluorescente sensoren pH meten in levende cellen en in vivo. De dendritische steiger versterkt de eigenschappen van geconjugeerde fluorescente kleurstoffen leidt tot betere detectie eigenschappen.

Samenvatting

De ontwikkeling van fluorescerende indicatoren betekende een revolutie voor de life sciences. Genetisch gecodeerde en synthetische fluoroforen met sensing capaciteiten kon de visualisatie van biologisch relevante soorten met een hoge ruimtelijke en temporele resolutie. Synthetische kleurstoffen zijn van bijzonder belang zijn dankzij hun hoge tunability en het brede scala van meetbare analyten. Echter, deze moleculen lijden een aantal beperkingen met betrekking tot kleine molecule gedrag (slechte oplosbaarheid, moeilijkheden bij targeting, vaak geen ratiometrisch imaging toegestaan). In dit werk introduceren we de ontwikkeling van dendrimeer gebaseerde sensoren zijn en een procedure voor pH-meting in vitro, in levende cellen en in vivo. We kiezen dendrimeren als ideaal platform om onze sensoren voor hun vele gewenste eigenschappen (monodispersiteit, instelbare eigenschappen, multivalentie) dat ze een veel gebruikte steiger voor meerdere biomedische apparaten gemaakt. De vervoeging van fluorescerende pHindicatoren om de dendrimer schavot geleid tot een verbetering van hun sensing optredens. In het bijzonder dendrimeren vertonen verminderde cel lekkage, verbeterde intracellulaire targeting en laat ratiometrisch metingen. Deze nieuwe sensoren werden met succes toegepast om de pH te meten in levende HeLa cellen en in vivo in muizenhersenen.

Inleiding

Het gebruik van fluorescerende moleculen aan specifieke biologisch relevante moleculen te labelen is volledig veranderd de manier waarop we bestuderen van biologische systemen. Widefield en confocale microscopie toegestaan ​​voor een real-time hoge-resolutie visualisatie van biologische processen en tegenwoordig de meest populaire technieken studeren biologische gebeurtenissen in vitro in cellen en in vivo. ^1A relevante verbetering werd voorgesteld door de ontwikkeling van fluorescentie indicatoren , dwz kleurstoffen waarvan de fluorescentie afhankelijk is van de concentratie van een specifieke moleculaire entiteit. pH en calcium indicatoren bijzonder had een dramatisch effect op de studie van de celfysiologie door de enorme relevantie van H ⁺ en ^{Ca2 +-ionen} in de biologie. ^2,3

De meeste van de detectie kleurstoffen vertonen vele intrinsieke beperkingen in hun kleine moleculen gedrag, zoals: i) moeilijkheden subcellulaire targeting, ii) een slechte oplosbaarheid in water en daardoor slechte biocompatibiliteit,. en iii) cel lekkage en dus weinig tijd-lapse imaging vermogen ⁴ Bovendien is het signaal van vele probes kunnen niet worden gecorrigeerd voor de afhankelijkheid van de kleurstof concentratie (non- ratiometrische beeldvorming) en derhalve een absolute meting in cellen of in vivo niet mogelijk.

We hebben recent beschreven een eenvoudige en effectieve methode om deze beperkingen op basis van de conjugatie van sensing kleurstoffen op een dendrimeer steiger. ⁵ Dendrimeren zijn monodisperse hypervertakte polymeren met zeer aantrekkelijke eigenschappen voor biologische toepassingen. ⁶ name dendritische verscheidene platforms ontwikkeld en gebruikt voor drug ⁷ en gen delivery. ⁸ Zeer recent verscheidene trad vanaf het potentieel van deze moleculen als matrix voor sensoren onderzoeken. ^9,10,11

We hebben eerderbeschreven een eenvoudige synthetische route naar de functionalisering van verschillende polyamidoamine (PAMAM) scaffolds gebaseerd op NHS-geactiveerde esters. ¹² Conjugaten kunnen in een enkele stap worden verkregen door middel van dialyse zoals het zuiveren. Interessant deze benadering kan eenvoudig worden toegepast op een verscheidenheid van dendritische of polymere scaffolds. ^13,14

Om ratiometrisch beeldvorming dendrimeren bereiken waren dubbel-gelabeld met twee sets van kleurstoffen: i) een pH-indicator (dwz fluoresceïne) en ii) een pH-onafhankelijke fluorescerende groep (dwz rhodamine). Dit liet ons toe om nauwkeurige pH beeldvorming uitgevoerd als de verhouding tussen fluoresceïne en rhodamine alleen afhankelijk van de pH en niet meer van de concentratie van de probe. Een andere interessante benadering van dit probleem wordt vertegenwoordigd door het gebruik van levensduur probes. ¹⁵ Aangezien de levensduur niet afhankelijk probeconcentratie deze metingen geen ratiometrische correctie nodig. Echter, lifetime metingen vereisen een meer gecompliceerde instrumentale setup en hun temporele resolutie is suboptimaal voor snelle fysiologische processen, waardoor de beperking van hun potentiële toepassingen.

Om intracellulaire beeldvorming uitvoeren, moet de sonde over het plasmamembraan te leveren in het cytosol. Aangezien de dendrimeren niet doorlaatbaar membraan vanwege hun grootte en hydrofiliciteit kan intracellulaire afgifte worden bereikt door elektroporatie. Met deze techniek op grote schaal gebruikt in de biologie voor transfectie, gelabelde macromoleculen kunnen effectief in cellen afgeleverd hoge beeldkwaliteit voeren. Bovendien, met elektroporatie complicaties gerelateerd aan dendrimeer endocytose kunnen worden vermeden als de macromoleculen rechtstreeks geleverd aan het cytoplasma. Interessant na elektroporatie verschillende dendrimeren toont verschillende lokalisaties in de cellen zelfs bij gebreke van een specifieke targeting-sequentie. ⁵ Deze passievee gericht, alleen vanwege de fysisch-chemische eigenschappen van het dendrimeer, kan worden benut om organel-specifieke pH beeldvorming bereiken.

Ratiometrische beeldvorming kan worden uitgevoerd met behulp van confocale microscopie. Fluoresceïne en rhodamine, covalent geconjugeerd met de dendritische schavot werden afzonderlijk afgebeeld en een pixel-voor-pixel verhouding map is gemaakt. Verschillende procedures intracellulaire pH controle in levende cellen door middel van ionoforen gemeld. Ionoforen zijn kleine hydrofobe moleculen voor ionen over het plasmamembraan vervoer; ionoforen voor H ⁺ ion, zoals nigericine, zijn beschikbaar en kunnen worden gebruikt om dendrimeer gebaseerde sensoren kalibreren ¹⁶ Deze metingen toonden een lineaire respons op pH overeenkomstig hetgeen waargenomen. in vitro. Op basis van de kalibratie intracellulaire pH nauwkeurig kan worden gemeten. Deze metingen toonden aan dat dendrimer gebaseerde sensor een waardevol instrument in studie H ⁺ homeost kan zijnasis in levende cellen en pathologische processen die pH-regulering storingen betrekken.

We hebben onlangs aangetoond dat dendrimeer gebaseerde pH sensoren ook kan worden toegepast in vivo uitvoeren pH beeldvorming in de hersenen van verdoofde muizen. ¹⁷ Wegens de complexe omgeving van levende weefsels hoge kwaliteit in vivo detectie is technisch uitdagend. Hier laten we een gedetailleerde beschrijving van de experimentele procedure voor in vivo pH beeldvorming met nadruk van de cruciale kwesties die moeten worden aangepakt om een nauwkeurige pH beeldvorming te voeren in de hersenen. Twee-foton microscopie werd toegepast om twee belangrijke redenen: i) het gebruik van infrarood licht kan het ontbreken van weefselpenetratie standaard confocale microscopie overwinnen, ii) de algemene twee-foton absorptie van fluoresceïne en rhodamine toestaan ​​hun gelijktijdige excitatie vermijden van de complicaties met betrekking tot het gebruik van twee golflengten voor excitatie. pH-metingen in de hersenen van muizen warenmet succes uitgevoerd; sensoren gemakkelijk reageren op hypoxie veroorzaken verandering van de pH in de hersenen extracellulaire ruimte. Deze metingen tonen aan dat dendrimeer gebaseerde indicatoren met succes kunnen worden gebruikt om fysiologische en pathologische verandering van de pH in vivo in een diermodel markeren.

Protocol

1. Synthese van de sensoren

1. In de volgende paragraaf geven we een procedure voor de vervoeging van pH indicatoren PAMAM dendrimeren. Hetzelfde protocol kan worden toegepast met minimale modificatie alternatieve amine-dragende dendrimeren. ^5,17,13,14 handel verkrijgbare dendrimeren en pigmenten kunnen zonder verdere zuivering worden gebruikt.
2. Los het dendrimeer in watervrij DMSO (50 uM eindconcentratie). Bereid 10 mM voorraad oplossingen van fluoresceïne-NHS en tetramethyl-rhodamine-NHS (TMR) in watervrij DMSO.
3. In het dendrimeer oplossing de gewenste hoeveelheid fluoresceïne en TMR. De molaire verhouding in het mengsel de hoeveelheid kleurstoffen geladen op het dendrimeer weerspiegelen. Typically 1 ml G4 PAMAM dendrimeer oplossing in een microcentrifugebuis reageren met 8 eq (40 pl) van fluoresceïne en 8 eq (40 pl) van TMR. Roer de oplossing bij kamertemperatuur gedurende 12 uur.
4. Verdun 1:10 met gedemineraliseerd water en laadt de reactiemengsel in een dialysezak (MWCO = 10 kDa). Dialyze gedurende 24 uur tegen gedemineraliseerd water vervangen vaak het water in het reservoir.
5. Breng de oplossing een flesje en vriesdrogen om 24 uur. Een paars poeder worden verkregen. Weeg het verkregen vaste en oplossen in milliQ water bij een eindconcentratie van 10 uM. Aliquot de oplossing en bewaar bij -20 ° C.

2. In Vitro pH-metingen

1. Voor in vitro kalibratie wordt een oplossing van 500 nM dendrimeer in PBS (2 mM fosfaat) in een kwarts cuvet. Het gebruik van een zeer verdunde PBS-buffer (2 mM) om abrupte pH gedurende de titratie te vermijden wordt aanbevolen.
2. Meet de emissiespectra van fluoresceïne (exc 488 nm) en TMR (exc 550 nm) en optimaliseren van de optische instellingen van de fluorimeter een goede signaal-ruisverhouding te bereiken.
3. Voer een pH titratie door kleine hoeveelheden NaOH 0,1 N en HCl 0,1 N toe te voegen Na elke toevoeging schud de cuvettevoor het mengen, wacht 1 min voor equilibratie en wordt de pH met behulp van een micro-elektrode pH. Emissiespectra van fluoresceïne en TMR moeten worden geregistreerd voor elke stap zonder enige verandering in de optische instellingen.
4. Teken de fluorescentie-intensiteit vs pH voor de titratie. De rhodamine signaal moet worden niet beïnvloed door de pH (<10%). De fluoresceïne signaal zou een sigmoïdale curve en wordt voorzien van een bindende model met pK = 6,4.

3. Celkweek en Elektroporatie

1. Ontwikkel HeLa-cellen in Dulbecco's gemodificeerd Eagle medium (DMEM) aangevuld met 10% foetaal runderserum en 100 E / ml penicilline en 100 mg / ml streptomycine (Invitrogen). Houd celkweek bij 37 ° C in een bevochtigde 5% _CO2 atmosfeer.
2. Voor dendrimer elektroporatie, wanneer de cellen confluent, verwijder de media en was cellen met behulp van DPBS (Dulbecco's fosfaat-gebufferde zoutoplossing). Verwijder de DPBS en voeg trypsine-EDTA. Neutraliseren de trypzondigen door toevoeging dat een serum bevat, maar geen antibiotica. Centrifugeer bij 900-1200 rpm gedurende 2 minuten bij kamertemperatuur. Verwijder de media en spoel de pellets met behulp DPBS.
3. Tel de cellen en nemen 4 * 10 ⁶ cellen. Centrifugeer bij 1.200-1.500 rpm gedurende 2 minuten bij kamertemperatuur.
4. Resuspendeer de celpellet in 200 ui microporatie buffer (geleverd door de fabrikant microporator) en breng cellen een 1,5 ml microcentrifugebuis.
5. Voeg dendrimeer waterige oplossing in geresuspendeerde cellen. De hoeveelheid benodigde dendrimeer per monster is afhankelijk van het soort PAMAM (typisch 250 nM voor kationische en 2 uM voor neutrale dendrimeren).
6. Voeg elektroporatie buffer (geleverd door de fabrikant microporator) in een microporatie buis. Pipetteer de cellen en dendrimeren mengsels met elektroporatie puntje van 100 ul volume-en kleinbedrijf. Plaats de microporator pipet in de pipet station. Stel de pols voorwaarde voor microporatie: impulsspanning = 1.005 V; puls width = 35 msec; puls aantal = 2.
7. Na de puls overdracht cellen een 1,5 ml microcentrifugebuis en centrifugeer cellen gedurende 5 minuten bij 1200 rpm om de overmaat dendrimeer in het medium te verwijderen. Plaat 10 ul van geëlektroporeerde cellen op 35 mm glazen bodem gerechten (Willco-dish GWSt-3522) met vers medium w / o antibiotica.

4. pH Sensing in Living HeLa cellen

1. Afbeeldingscellen met een confocale microscoop 12 uur na elektroporatie.
2. Standaard filter set voor fluoresceïne en rhodamine kunnen worden gebruikt. Als afstembare filters zijn beschikbaar set een groene kanaal 500-550 nm en een rode kanaal van 580 nm tot 650 nm. Excitatie bij 488 nm is optimaal voor fluoresceïne terwijl rodamine kon worden afgebeeld of met de 543nm of de 561 laserlijn.
3. Focus op het model en pas lasers kracht en detectoren krijgen tot de signaal-ruisverhouding te maximaliseren. Als de elektroporatie was succesvol cellen moeten helder fluorescerend in beide kanalen. Delokalisatie afhankelijk van de grootte en lading van de dendrimeer gebruikt. Vaak een aantal lysosomale lokalisatie (klein perinucleaire blaasjes) aanwezig is als gevolg van endocytose of verkokering. Als het lysosomale lokalisatie overheerst, dus de meeste van de fluorescentie is gelokaliseerd binnen blaasjes en slechte signaal wordt waargenomen in de cytosol, dit betekent toxiciteit en meting worden weggegooid. Verwerven achtereenvolgens de twee kanalen, indien nodig verwerven meerdere afbeeldingen en het gemiddelde van de beelden om de beeldkwaliteit te verbeteren.
4. Voor kalibratie klem cel pH buffers gebruikt met ionoforen bij verschillende pH en ten minste het 20 cellen per pH zoals hierboven beschreven. Voor een gedetailleerde beschrijving van de procedure en samenstelling van de buffers zie Bizzarri en medewerkers. ¹⁶ Wij stellen voor ten minste 5 punten met pH = 5,5 tot pH = 7,5 te meten. pH lager dan 6 zijn giftig voor cellen, maar getolereerd voor korte tijd, raden wij u aan de beelden zo snel mogelijk te verwerven. Als cellentonen tekenen van apoptose, gooi de cellen en opnieuw te starten.
5. Gebruik ImageJ of analoge software voor data-analyse. Importeer de beelden van de groene en rode kanaal, aftrekken achtergrond en maak een pixel per pixel verhouding beeldvorming met de functie "Beeld calculator".
6. Teken een gebied van belang (ROI) de gewenste en meet de intracellulaire groen naar rood verhouding. Analyseren van alle verkregen beelden en dan plot van de verhouding ten opzichte van de pH. In het bereik 5,5-7,5 indien de ontwikkeling lineair. De lineaire regressie van de verkregen punten de ijkcurve die wordt gebruikt om groen naar rood verhouding zetten tot pH geven.
7. Als verdere controle verwerven verschillende onbehandelde cellen (geen ionoforen) en proberen om de pH te berekenen met de verkregen kalibratiecurve. Een waarde tussen 7,2 en 7,4 te worden verkregen.

5. In Vivo Monsterbereiding

1. Experimenten werden uitgevoerd op C57BL/6J (mannen en vrouwen) tussen postnatale day 28 en 70. De muis verdoofd met een intraperitoneale injectie van Urethaan (bijvoorbeeld ethyl carbamaat) (20% g / v in fysiologisch zout, 20 mg / kg urethaan). Dieren werden opgeofferd na experimenteren met een overdosis urethaan gevolgd door een intracardiale injectie van dezelfde verdoving.
2. Voer een intramusculaire injectie dexamethason natriumfosfaat (2 mg / kg lichaamsgewicht) aan de corticale stressrespons en cerebraal oedeem in de chirurgie.
3. Scheren hoofd van het dier en 2,5% lidocaïne gel op de hoofdhuid.
4. Gebruik een schaar om de klep van de huid die de schedel van beide hersenhelften te snijden
5. Was de blootgestelde bot met zout en verwijder voorzichtig het periost behulp van een tang. Dit zal zorgen voor een betere basis voor lijm en tandheelkundige cement te houden met.
6. Breng een op maat gemaakte stalen kop post met een centrale beeldvorming kamer en lijm deze met cyanoacrylaat in een vlak dat ongeveer parallel met de schedel over de corticale regio iBELANG en zet deze vast met witte tandheelkundige cement (Paladur).
7. Bevestig de kop van de muis om een ​​craniotomie van 2-3 mm diameter geboord in het gebied van belang uitgevoerd.
8. Probeer de verwarming van de cortex te minimaliseren tijdens de operatie, durale tranen, of bloeden.
9. Houd de cortex superfused met steriele ACSF (126 mM NaCl, 3 mM KCl, 1,2 mM KH _{2PO 4,} 1,3 mM _MgSO4, 26 mM NaHCO _3, 2,4 mM _CaCl2, 15 mM glucose, 1,2 mM HEPES in gedestilleerd _H2O , pH = 7,4).

6. pH beeldvorming in de hersenen van muizen

1. Tijdens het experiment voor dierlijke ademhaling verstrekken van O _2-verrijkte lucht. Zuurstof wordt verrijkt tot 80%. O ₂ partiële druk en debiet wordt vaak ingesteld om een goede ademhaling steun te verkrijgen. Houd lichaamstemperatuur constant op 37 ° C met een feedback regelbare verwarming deken.
2. Bevestig het dier door de stalen paal kader van de doelstelling van een twee-foton beeldvorming setup.
3. Om de sensor te injecteren in de hersenen cortex plaats een glazen pipet met een AgCl-elektrode (tip diameter 4 mm) met de dendrimeer oplossing (1 uM). De elektrode laten extracellulaire veldpotentialen opnemen.
4. Met een micro-injectie setup steek de pipet in de cortex op ongeveer 150 micrometer diepte. Injecteer gedurende 1-2 minuten bij een druk van 0,5 psi.
5. Optimaliseer de optische opstelling voor de beeldvorming. Laservermogen moet worden aangepast aan photobleaching en photodamage minimaliseren. Typisch laservermogen werken circa 20 mW en PMT versterking werd constant gehouden op 667 V omdat eerdere kalibraties gebleken dat deze spanning geeft de beste S / N verhouding.
6. Voor grafische prikkelen de sensor bij 820 nm en sporen tegelijk fluoresceïne en rhodamine fluorescentie via standaard FITC en TRITC filters.
7. Voor de tijd opgeloste metingen verwerven time lapse serie op 2 Hz.
8. Voor achtergrondinformatie correctie verwerven van een donkere frame met de laser gesloten sluiter om de thermische ruis ontstaan ​​in de PMT's en het voetstuk meestal toegevoegd door de elektronica te meten.
9. Voor data-analyse volgt dezelfde procedure vermeld in hoofdstuk 4.

Resultaten

Figuur 1 toont een schematische weergave van de vervoeging van sensing kleurstoffen aan verschillende dendritische steigers. De resulterende indicatoren kan worden verkregen in een eenvoudige synthetische stap uit in de handel verkrijgbare producten. Amine-dragende dendrimeren reageren met NHS-geactiveerde kleurstoffen in DMSO en gezuiverd door dialyse. Deze algemene procedure is al met succes gebruikt voor het labelen van verschillende dendrimeren: i) PAMAM dendrimeer generatie 2, 4 en 6; ¹²...

Discussie

De kritische stappen voor een succesvolle pH beeldvorming met dendrimeer gebaseerde sensoren zijn: i) het selecteren van de juiste dendritische steiger en het aantal indicatoren geconjugeerd aan het en ii) het optimaliseren van de sensor productietijd protocol in cellen of in vivo.

Het synthetische proces is redelijk eenvoudig en kan praktisch worden toegepast op elk amine dragende hypervertakte polymeer. De sensoren kunnen worden verkregen uit commercieel verkrijgbare dendrimeren e...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
PAMAM G4	Sigma-Aldrich	412449
Carboxyfluorescein NHS ester	Life technologies	C-1311
TMR NHS ester	Life technologies	C-1171
DMSO	Sigma-Aldrich	D8418
Dyalsis bags	Spectrum Labs	132117
WillCo Dishes	WillCo Wells	GWSt-3512
Urethane	Sigma-Aldrich	U2500