Het verbeteren van de slaagkans van eiwitkristallisatie door Random Microseed Matrix Screening

Samenvatting

Hier beschrijven we een algemene methode voor willekeurige microseed matrix screening. Deze techniek is een significante toename van de slaagkans van eiwitkristallisatie screeningsexperimenten, de behoefte aan optimalisatie en een betrouwbare aanvoer van kristallen voor gegevensverzameling en ligand-inweken experimenten.

Samenvatting

Random microseed matrix screening (RMM) is een proteïne kristallisatie techniek waarbij zaad kristallen worden toegevoegd aan willekeurige schermen. Door het verhogen van de kans dat kristallen groeien in de metastabiele zone van een proteïne fasediagram, worden extra kristallisatie leidt vaak verkregen, de kwaliteit van de geproduceerde kristallen worden verhoogd, en een goede kristaltoevoer voor gegevensverzameling en weken experimenten voorzien. Hier beschrijven we een algemene werkwijze voor RMM die kunnen worden toegepast op zowel zittende druppel of opknoping druppel dampdiffusie experimenten, met de hand of met vloeistofverwerking robotica, in 96-well of 24-wells formaat opgesteld.

Inleiding

Vanaf de eerste toepassing ervan door Perutz, Kendrew en collega's bij het bepalen van de structuur van hemoglobine en myoglobine, aan de moderne high throughput geautomatiseerde pijpleidingen van de structurele genomics consortia heeft macromoleculaire X-ray kristallografie ons bood een ongekende structurele kijkje in het eiwit wereld . Deze techniek blijft de meest toepasselijke experimentele methode die de directe visualisatie van eiwitstructuur toelaat op atomaire, of in de buurt van atomaire resolutie (dwz in de 1-3 een Range). Voorwaarde voor röntgendiffractie worden toegepast op een eiwit dat eerst moet worden gekristalliseerd, en het is deze fase van het proces dat zich de grootste snelheidsbeperkende stap in structuurbepaling door diffractiemethodes ^{1, 2} blijft. Ondanks de aanzienlijke vooruitgang in ons begrip van het proces van proteïne kristallisatie, en belangrijke verbeteringen in de kwaliteit en beschikbaarheid van kristallisatie-schermen,laden en aanverwante technologieën blijft het onmogelijk om de kans op succes kristallisatie ³ betrouwbaar voorspellen. Biochemische en biofysische methoden kunnen worden toegepast om te beoordelen of een eiwit van interesse displays gunstige eigenschappen voor kristalkernvorming en groei, dus is het goed gevouwen, homogene, monodispers, enz., maar deze inzichten op geen enkele manier zorgen voor een definitieve voorspeller van kristallisatie geneigdheid.

Kiemen lang beweerd een haalbare werkwijze voor het verbeteren van het aantal, de grootte en kwaliteit van de bestaande kristallen of kristallijn materiaal ^4-7 zijn. Deze benadering is gebaseerd op het uitgangspunt dat een voorwaarde dat nucleatie ondersteunt niet optimaal voor verdere kristalgroei en vice versa kunnen worden. Door de overdracht van een kern materiaal van de ene toestand naar de andere, kan men proberen om effectief te ontkoppelen deze processen, waardoor de toegang tot nieuwe, nog onontgonnen kristallisatie ruimte,en als gevolg een verbetering van de slaagkans van een screening experiment. Gevestigde methoden zijn beschreven voor (i) macroseeding, de overdracht van een enkel kristal in zijn geheel aan een toestand naar de andere ^8, (ii) strook zaaien, de overdracht van kernen materiaal, algemeen verkregen door toepassing van gerichte druk met bijvoorbeeld een kat snorhaar op het oppervlak van een bestaande kristal, gevolgd door achtereenvolgende passage van de snorhaar door een nieuwe kristallisatie druppel ^9, en (iii) "klassieke" microseeding, de overdracht van kristal "zaden", gegenereerd door oogsten gemalen kristallen (of kristallijn materiaal), in soortgelijke omstandigheden dat de zaden ¹⁰ opgeleverd. Met name alle drie van deze methoden zijn tijdrovend en slecht schaalbaar, zeker in vergelijking met wat haalbaar moderne vloeistofverwerking kristallisatie robotica. Deze factoren hebben bijgedragen, op een bepaald niveau althans de perceptie dat zaading is een methode om alleen te bezoeken wanneer andere methoden hebben gefaald vruchten af ​​te werpen.

Random matrix microseeding (RMM) is een recente methodologische innovatie die de voordelen van de traditionele microseeding met die van high throughput screening en schaalbaarheid ^11-13 combineert. Deze aanpak berust op het genereren van een uitgangsmateriaal, uit kernhoudende kristallijn materiaal, dat kan worden verdeeld in / op elke sub-well/coverslip bij een standaard 96-toestand kristallisatie scherm. Deze methode is van toepassing op zowel zittend of opknoping druppel dampdiffusie experimenten, met de hand of met behulp van liquid handling robotica, in 24-well of 96-wells formaat vastgesteld. RMM is experimenteel aangetoond aanzienlijk te verhogen kristallisatie succes en produceren kristallen groter diffractie kwaliteit en kwantiteit ^{11, 13, 14,} en vormt een innovatief hulpmiddel in het arsenaal van de kristallografen "benaderingen in de oNgoing streven naar kristallisatie succes. Hier beschrijven we een algemene werkwijze voor RMM en zorgen voorbeeldgegevens illustreert de effectiviteit van deze techniek.

Protocol

1. Strategische overwegingen

1. De keuze van zaad kristallen voor microseeding experimenten zal variëren afhankelijk van het doel van het experiment. Aan het begin van een project is het nuttig om verschillende kristallisatie hits die alternatieve aanknopingspunten kan bieden voor optimalisatie kristal te vinden. RMM reduceert de noodzaak van kristal optimalisatie omdat goede kwaliteit kristallen hebben meer kans om te groeien in de metastabiele zone van het fasediagram, dat wil zeggen in het gebied waar volgende verstoring of nucleatie keert het systeem terug naar evenwicht. We stellen daarom middels RMM routinematig zodra de eerste kristallen verkregen (of, nauwkeuriger, zodra de eerste kristallen stoppen met groeien).
2. Voor de eerste ronde van RMM moet een uitgangsmateriaal worden met zoveel kristallijn materiaal mogelijk. Als slechts een putje beschikbaar die kristallen bevat, of indien de kristallen klein zijn, kan het nuttig zijn om meerdere herhalingen van deoriginele hit (zonder enten) de levering van kristallen verhogen. Indien echter meerdere treffers worden verkregen, kunnen entkristallen worden verzameld van diverse aandoeningen en samen gemengd.
3. Fasescheiding te voorkomen, moet kristallen gekweekt in high-zout omstandigheden afzonderlijk worden geoogst van kristallen gegroeid in high-PEG omstandigheden. Als kristallen uit verschillende bronnen worden gemengd, moet een reservoir oplossing die minder waarschijnlijk zoutkristallen geven worden geselecteerd zaaizaad suspensie. Zo moeten hoge concentraties fosfaat, sulfaat, calcium en magnesium worden vermeden.
4. Later in een project kan het belangrijk zijn om te zoeken naar kristallen met verschillende eenheidscellen ter verbetering diffractie, gekoppelde kristallen voorkomen en kristallen die geschikt zijn voor binding liganden verkrijgen. In dit stadium alleen de meest geschikte kristallen (bijv. die het best breken) worden gebruikt om het uitgangsmateriaal te maken. Soms herhaalde rondes van microseeding nodig zijn, waar alleen de "beste"Kristallen worden gebruikt om het uitgangsmateriaal te maken voor de volgende ronde. Indien mogelijk, een" moet neutraal "neerslagmiddel zoals PEG 3000 worden gebruikt om de kiemkristallen in slaapstand naar nieuwe kristal contacten stimuleren en complexen die onstabiel in hoge kristalliseren -zoutoplossingen ^12.
5. Klassieke microseeding experimenten, waar een enkele kristallisatie conditie wordt toegepast, zijn vaak nuttig na de identificatie van een veelbelovende conditie en tijdens verdere optimalisatie. Het is vaak noodzakelijk om het uitgangsmateriaal te verdunnen om het gewenste aantal kristallen per omlaag halen. Een "combinatorische" microseeding experiment (waar een reeks zaadvoorraden van toenemende verdunning worden toegevoegd aan een kristallisatie voorwaarde) is een snelle methode voor het vinden van de optimale verdunning van het uitgangsmateriaal. Deze benadering wordt hieronder beschreven.

2. Voorbereiding van het Zaad Stock

1. Maak een ronde glazen sonde uit een glas Pasteur pipet met een bunsenvlam.
   1. Verhit de pipet in de buurt van het midden tot het zacht wordt, dan snel uit het vuur verwijderen en trek hem door elkaar te trekken de uiteinden. Streef ernaar de glazen tot een diameter van minder dan 0,25 mm te trekken.
   2. Breek het glas bij het punt waar het ongeveer 0,25 mm en kort dompelen de gebroken uiteinde in de vlam. Herhaal dit tot een halve bol van glas met een diameter van ~ 0,75 mm is gevormd op het einde. Deze sonde is handig voor het breken kristallijn materiaal als het op de juiste wijze is gedimensioneerd voor het slaan van vaste voorwerpen op de 0,01-1,0 mm schaal en het niet het plastic oppervlak van een kristallisatie tray sub-goed of dekglaasje beschadigen. Grotere sondes (~ 1,0 mm) kunnen kleine kristallen effectiever verpletteren omdat de kristallen worden gevangen tussen het glas en plastic.
2. Plaats een 1,5 ml microcentrifugebuis met een Seed Bead op ijs.
3. Inspecteer een vooraf vastgesteld kristallisatie lade met behulp van een binoculair microscoop of kristal imaging-systeem en selecteer een of meer appropriate putten uit de lade van waaruit kristallijn materiaal voor uitgangsmateriaal generatie oogsten. Elk materiaal kan worden gebruikt, waaronder fijne naalden, sferulieten, microkristallen en onregelmatige, slecht gevormde kristallen. Het uitgangsmateriaal moet zo snel mogelijk na het stoppen met groeien kristallen worden gemaakt, aangezien oudere materiaal is waarschijnlijk gedeeltelijk verknoopt, waardoor de geschiktheid ervan voor gebruik bij het zaaien proeven verminderen. Bij twijfel of het kristallijne materiaal te oogsten is zout of eiwit de put kan worden gevisualiseerd met UV-fluorescentie microscoop of beeldvormend systeem voor het openen of het kristallijne materiaal kan worden onderworpen aan in situ röntgendiffractie analyse in de lade. Bij gebruik van de vroegere aanpak eiwitkristallen zullen fluoresceren onder UV-bestraling, zal zoutkristallen verschijnen kleurloos.
4. Open de geselecteerde kristallisatie lade goed. Voor de 96-well zitten druppel trays, foutje in de bovenste plastic verzegeling vel rond de put geselecteerde using een scalpel. Voor de 24-well opknoping druppel Verwijder laden het dekglaasje met behulp van een pincet. Keren de dekglaasje en plaats het op een stabiele schoon oppervlak. Verwijder 50 pl van de oplossing reservoir en breng deze vloeistof aan de microcentrifugebuis met het zaad Bead zodat de buis blijft op ijs in.
5. De kristallen grondig verpletteren in de subwell (96-well tray) of dekglaasje (24-well tray) daalt, met behulp van de glazen sonde opgesteld in paragraaf 2.1, het bekijken van de resultaten onder een microscoop. Kleine kristallen kan enkele minuten duren om grondig te verpletteren. Deze stap kan de experimentator om te controleren of de kristallen gemakkelijk worden fijngemaakt worden derhalve niet verknoopt, en dat zij niet zoutkristallen. Zoutkristallen produceren een onderscheidend klik die kunnen worden gehoord en gevoeld wanneer ze worden geplet. Als de kristallen zijn taai en moeilijk om te proberen te verpletteren te verkrijgen en te gebruiken frisser materiaal.
6. Verwijder 5 ul van de oplossing van het reservoir Seed Bead buis en transfer om het equivalent sub-goed (zittend druppel experiment), of dekglaasje (opknoping druppel experiment) dat het kristallijne materiaal te worden geoogst. Pipet deze vloeistof op en neer 5-6 keer om zoveel mogelijk van de sub-goed of dekglaasje inhoud mogelijk opnieuw in suspensie. De terugkeer van de schorsing van de Seed Bead buis en twee keer herhaal deze stap, ervoor te zorgen dat zo veel kristallijn materiaal wordt geoogst mogelijk.
7. Vortex de Seed Bead voor twee minuten, stoppen elke 30 seconden aan de buis op ijs te koelen.
8. Voeg een verdunningsreeks, verdunnen van de uitgangsmateriaal in reservoiroplossing met een factor 4 tot 10 in elk stadium. Meestal zal te veel kristallen zijn verkregen bij gebruik van een onverdund uitgangsmateriaal, dus gebruik het verdunde zaaivoorraden het aantal kristallen per putje controleren. In de eerste ronde van RMM, is het belangrijk de zaad voorraadoplossing te verdunnen, aangezien hoe groter de concentratie van de zaden meer kristallisatie bezoeken zullen worden verkregen.
9. Als het niet wordt gebruikt onmiddellijklijk, de overdracht van het zaad voorraad schorsing en de verdunde uitgangsmateriaal een -20 ° C of -80 ° C vriezer voor opslag. Voor herhaalde vries-dooi cycli te voorkomen die de werkzaamheid van het uitgangsmateriaal kan verminderen, dit materiaal op in klein volume fracties, namelijk 10-20 pl. Eenmaal bevroren, kan zaadvoorraden onbeperkt houdbaar totdat het nodig is.

3. Oprichting van Kristallisatie laden

1. Afhankelijk van de beschikbaarheid van kristallisatie faciliteiten en de voorkeuren van de experimentator, kan RMM kristallisatie screening worden uitgevoerd met behulp van 24-wells trays in dienst van de opknoping diffusie daling damp methode, of 96-well laden met behulp van de zittende druppel dampdiffusie methode. Kristallisatie bakken voor RMM kan ofwel worden vastgesteld door de hand met vloeistofverwerking apotheekrobot, of een combinatie van beide.
2. Een typische RMM experiment opgezet met de hand zal bestaan, 1,0 ul eiwit-oplossing, 1,0 ul kristallisatie staat, en0,5 pl uitgangsmateriaal. Een typisch experiment ingesteld met behulp van een kristallisatie-robot zal bestaan, 0,3 ul eiwit-oplossing, 0,2 ul kristallisatie conditie, en 0,1 pl uitgangsmateriaal.
3. Om RMM screening uitvoeren in 24 putjes opknoping druppel laden enerzijds middels een manuele pipet 300 pi van elke aandoening een 96 putjes toestand kristallisatie scherm 10 ml enkele buis formaat in elk putje van 4 x 24 putjes gesmeerde kristallisatie trays.
   1. Breng 1 pl van elk kristallisatie toestand van elk 300 pi reservoir op het oppervlak van een overeenkomstige plastic dekglaasje vertrekpunt voor en achter beschermlaag stroken verwijderd.
   2. De 1 pi van elke kristallisatie aandoening voeg 1 pl eiwitoplossing gevolgd door 0,5 pi kristal uitgangsmateriaal. Omkeren elke dekglaasje zodanig dat de druppel vloeistof naar beneden is gericht en positie boven de juiste goed.
   3. Druk beneden op het dekglaasje, comprimeren de sealing vet en het vormen van een veilige afdichting. Zodra alle 96 druppels worden ingesteld, is de lade overgebracht naar een incubator of kamer met constante temperatuur, gewoonlijk in het bereik 4-18 ° C voor opslag.
4. Om RMM screening uitvoeren in 96-well zitten druppel laden eerst overdragen 20-50 pi van elke toestand van een 96-well voorwaarde kristallisatie scherm in diepe put blokformaat in elk overeenkomende well van de kristallisatie lade. Deze overdracht stap kan worden uitgevoerd met behulp van een kristallisatie robot of handmatig overbrengen met een 8-kanaals pipet.
   1. Transfer reservoir, eiwitten en pootgoed oplossingen voor de druppels met de hand of met een robot met behulp van de volumes beschreven in 3.1. Sommige commercieel verkrijgbaar kristallisatie robots geen contact afzien, en het uitvoeren van het uitgangsmateriaal overdracht met behulp van een dergelijk systeem kan leiden tot verstopping van doseertips of bijbehorende buizen. De volgorde van doseren is variabel: sommige robots afzien alle oplossingen tegelijk. Indiendit niet mogelijk is, afzien eiwit eerst, dan het reservoir, dan zaad voorraad.
   2. Als een contact afgeven robot is niet beschikbaar overdracht de zaden met een laag volume glazen injectiespuit voorzien van een stompe naald. Spoel de naald door het door het reservoir oplossing dan afzien van het zaad voorraad in elke druppel.
   3. Dicht de lade met behulp van een verzegelde doorzichtige plaat en over te dragen aan een broedstoof of constante temperatuur ruimte voor opslag.

4. Inspectie van Kristallisatie laden

1. Visualiseer alle kristallisatie experimenten met behulp van een binoculair microscoop of een kristal imaging systeem. Eerstgenoemde verschaft algemeen de gebruiker meer controle over uitzicht diepte en de mate van vergroting dan de tweede, maar is tijdrovend.
2. Inspecteer elk sub-well/coverslip in volgorde en registratie van alle bewijzen van kristalvorming. Experimenten moeten eenmaal per 24 uur gedurende 5 dagen na vestiging en worden geïnspecteerd den vervolgens eens in de 7 dagen tot 4 weken.
3. Meerdere cycli van RMM's zijn vaak nodig voor een optimale diffractie kwaliteit kristallen worden geproduceerd.

Resultaten

(A) Voorbeeld van een RMM experiment

Om de effectiviteit van RMM screening tonen we aan deze methode toegepast op de kristallisatie van lysozym van kippeneiwit (HEWL) en runderlever catalase (BLC). Beide enzymen zijn bij uitstek kristalliseerbaar en zijn structureel goed gekarakteriseerd doelstellingen ^{15, 16.} Als zodanig bieden beide uitstekende proefpersonen waarmee de verbeterde kristallisatie succes haalbaar met RMM illustreren. Kristallisatie experimenten werden opgericht in 96-...

Discussie

In dit artikel hebben we een algemene methode voor RMM eiwitkristallisatie screening beschreven. We hebben aangetoond middels twee testeiwitten een significante verbetering in kristallisatie succes met deze methode. Diffractie analyse met behulp van synchrotronstraling uit een subset van kristallen gegenereerd met behulp RMM en niet-RMM methoden geopenbaard weinig variatie in kwaliteit tussen diffractie kristallen gegroeid bij procedure, vroegere auteurs rapporteerden dat goede kwaliteit kristallen vaker groeien in RMM ...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
MRC 96 well crystallization trays	Molecular Dimensions Ltd	MD11-00-100	Niet-UV compatibel, voor screens gevestigd door robot
ClearView sealing sheets	Molecular Dimensions Ltd	MD6-01S
Hen egg white lyzozyme	Sigma-Aldrich	L6876	~95% zuiverheid
Bovine liver catylase	Sigma-Aldrich	C9322	>95% zuiverheid
Xylanase	Hampton Research	HR7-104
Thaumatin from Thaumatococcus daniellii	Sigma-Aldrich	T7630
Thermolysin from Bacillus thermoproteolyticus rokko	Sigma-Aldrich	P1512
JCSG-plus HT-96 screen	Molecular Dimensions Ltd	MD1-40	Voor screens gevestigd door robot
PACT premier HT-96 screen	Molecular Dimensions Ltd	MD1-36	Voor screens gevestigd door robot
Morpheus HT-96 screen	Molecular Dimensions Ltd	MD1-47	Voor screens gevestigd door robot
Crystal Ph–nix liquid handling system	Art Robbins Instruments	602-0001-10
Seed bead kit	Hampton Research	HR2-320
Binocular stereo microscope	Leica	M165C
Scalpel blades	Sigma-Aldrich	S2646-100EA
ErgoOne 0.1-2.5 μl pipette	Starlab	S7100-0125
ErgoOne 2-20 μl pipette	Starlab	S7100-0221
ErgoOne 100-1000 μl pipette	Starlab	S7100-1000
JCSG-plus screen	Molecular Dimensions Ltd	MD1-37	Voor screens gevestigd met de hand
PACT premier screen	Molecular Dimensions Ltd	MD1-29	Voor screens gevestigd met de hand
Morpheus screen	Molecular Dimensions Ltd	MD1-46	Voor screens gevestigd met de hand
Tweezers	Sigma-Aldrich	T5415-1EA
CrystalClene coverslips 18 mm	Molecular Dimensions Ltd	MD4-17
2 ml glass Pasteur pipettes	Sigma-Aldrich	Z722669
Vortex mixer	Fisher Scientific	02-215-360
24 well XRL crystallization tray	Molecular Dimensions Limited	MD3-11	Voor screens gevestigd met de hand
30% (w/v) PEG 8000, 0.2 M ammonium sulfate, 0.1 M sodium cacodylate pH 6.5
20% (w/v) PEG 8000, 0.2 M magnesium acetate, 0.1 M sodium cacodylate pH 6.5
20% (w/v) PEG 6000, 100 mM citric acid pH 5.0