Het verbeteren van de slaagkans van eiwitkristallisatie door Random Microseed Matrix Screening

Samenvatting

Hier beschrijven we een algemene methode voor willekeurige microseed matrix screening. Deze techniek is een significante toename van de slaagkans van eiwitkristallisatie screeningsexperimenten, de behoefte aan optimalisatie en een betrouwbare aanvoer van kristallen voor gegevensverzameling en ligand-inweken experimenten.

Samenvatting

Random microseed matrix screening (RMM) is een proteïne kristallisatie techniek waarbij zaad kristallen worden toegevoegd aan willekeurige schermen. Door het verhogen van de kans dat kristallen groeien in de metastabiele zone van een proteïne fasediagram, worden extra kristallisatie leidt vaak verkregen, de kwaliteit van de geproduceerde kristallen worden verhoogd, en een goede kristaltoevoer voor gegevensverzameling en weken experimenten voorzien. Hier beschrijven we een algemene werkwijze voor RMM die kunnen worden toegepast op zowel zittende druppel of opknoping druppel dampdiffusie experimenten, met de hand of met vloeistofverwerking robotica, in 96-well of 24-wells formaat opgesteld.

Inleiding

Vanaf de eerste toepassing ervan door Perutz, Kendrew en collega's bij het bepalen van de structuur van hemoglobine en myoglobine, aan de moderne high throughput geautomatiseerde pijpleidingen van de structurele genomics consortia heeft macromoleculaire X-ray kristallografie ons bood een ongekende structurele kijkje in het eiwit wereld . Deze techniek blijft de meest toepasselijke experimentele methode die de directe visualisatie van eiwitstructuur toelaat op atomaire, of in de buurt van atomaire resolutie (dwz in de 1-3 een Range). Voorwaarde voor röntgendiffractie worden toegepast op een eiwit dat eerst moet worden gekristalliseerd, en het is deze fase....

Protocol

1. Strategische overwegingen

1. De keuze van zaad kristallen voor microseeding experimenten zal variëren afhankelijk van het doel van het experiment. Aan het begin van een project is het nuttig om verschillende kristallisatie hits die alternatieve aanknopingspunten kan bieden voor optimalisatie kristal te vinden. RMM reduceert de noodzaak van kristal optimalisatie omdat goede kwaliteit kristallen hebben meer kans om te groeien in de metastabiele zone van het fasediagram, dat wil zeggen in het gebied waar volgende verstoring of nucleatie keert het systeem terug naar evenwicht. We stellen daarom middels RMM routinematig zodra de eerste kristallen verkr....

Resultaten

(A) Voorbeeld van een RMM experiment

Om de effectiviteit van RMM screening tonen we aan deze methode toegepast op de kristallisatie van lysozym van kippeneiwit (HEWL) en runderlever catalase (BLC). Beide enzymen zijn bij uitstek kristalliseerbaar en zijn structureel goed gekarakteriseerd doelstellingen ^{15, 16.} Als zodanig bieden beide uitstekende proefpersonen waarmee de verbeterde kristallisatie succes haalbaar met RMM illustreren. Kristallisatie experimenten werden opgericht in 96-.......

Discussie

In dit artikel hebben we een algemene methode voor RMM eiwitkristallisatie screening beschreven. We hebben aangetoond middels twee testeiwitten een significante verbetering in kristallisatie succes met deze methode. Diffractie analyse met behulp van synchrotronstraling uit een subset van kristallen gegenereerd met behulp RMM en niet-RMM methoden geopenbaard weinig variatie in kwaliteit tussen diffractie kristallen gegroeid bij procedure, vroegere auteurs rapporteerden dat goede kwaliteit kristallen vaker groeien in RMM .......

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
MRC 96 well crystallization trays	Molecular Dimensions Ltd	MD11-00-100	Niet-UV compatibel, voor screens gevestigd door robot
ClearView sealing sheets	Molecular Dimensions Ltd	MD6-01S
Hen egg white lyzozyme	Sigma-Aldrich	L6876	~95% zuiverheid
Bovine liver catylase	Sigma-Aldrich	C9322	>95% zuiverheid
Xylanase	Hampton Research	HR7-104
Thaumatin from Thaumatococcus daniellii	Sigma-Aldrich	T7630
Thermolysin from Bacillus thermoproteolyticus rokko	Sigma-Aldrich	P1512
JCSG-plus HT-96 screen	Molecular Dimensions Ltd	MD1-40	Voor screens gevestigd door robot
PACT premier HT-96 screen	Molecular Dimensions Ltd	MD1-36	Voor screens gevestigd door robot
Morpheus HT-96 screen	Molecular Dimensions Ltd	MD1-47	Voor screens gevestigd door robot
Crystal Ph–nix liquid handling system	Art Robbins Instruments	602-0001-10
Seed bead kit	Hampton Research	HR2-320
Binocular stereo microscope	Leica	M165C
Scalpel blades	Sigma-Aldrich	S2646-100EA
ErgoOne 0.1-2.5 μl pipette	Starlab	S7100-0125
ErgoOne 2-20 μl pipette	Starlab	S7100-0221
ErgoOne 100-1000 μl pipette	Starlab	S7100-1000
JCSG-plus screen	Molecular Dimensions Ltd	MD1-37	Voor screens gevestigd met de hand
PACT premier screen	Molecular Dimensions Ltd	MD1-29	Voor screens gevestigd met de hand
Morpheus screen	Molecular Dimensions Ltd	MD1-46	Voor screens gevestigd met de hand
Tweezers	Sigma-Aldrich	T5415-1EA
CrystalClene coverslips 18 mm	Molecular Dimensions Ltd	MD4-17
2 ml glass Pasteur pipettes	Sigma-Aldrich	Z722669
Vortex mixer	Fisher Scientific	02-215-360
24 well XRL crystallization tray	Molecular Dimensions Limited	MD3-11	Voor screens gevestigd met de hand
30% (w/v) PEG 8000, 0.2 M ammonium sulfate, 0.1 M sodium cacodylate pH 6.5
20% (w/v) PEG 8000, 0.2 M magnesium acetate, 0.1 M sodium cacodylate pH 6.5
20% (w/v) PEG 6000, 100 mM citric acid pH 5.0