Methodenartikel

Onderzoek van de synaptische vesikel Recycling FM Kleurstoffen Tijdens Evoked, Spontaan, en Miniature Synaptic Activiteiten

20.8K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/50557

⸱

31 maart 2014

 ,  ,  ,  , 
1Department of Molecular Physiology & Biophysics, University of Iowa Carver College of Medicine, 2Department of Biology & Biochemistry, University of Bath

In dit artikel

Samenvatting

We beschrijven het gebruik van styrylkleurstoffen FM kleurstoffen aan het synaptische blaasje recycling in functionele zenuwuiteinden. Dit protocol kan niet alleen opgeroepen, maar ook spontane en miniatuur synaptische activiteiten worden toegepast. Het protocol breidt het aantal synaptische gebeurtenissen die effectief kan worden geëvalueerd.

Samenvatting

Synaptische blaasjes in functionele zenuwuiteinden ondergaan exocytose en endocytose. Deze synaptische vesikel recycling effectief kan worden geanalyseerd met behulp FM styryl kleurstoffen, die membraan omzet onthullen. Gebruikelijke protocollen voor het gebruik van FM kleurstoffen zijn ontworpen voor het analyseren neuronen na gestimuleerde (opgeroepen) synaptische activiteit. Onlangs zijn protocollen beschikbaar voor het analyseren van de FM-signalen die zwakker synaptische activiteiten, zoals spontane of miniatuur synaptische gebeurtenissen gevoegd worden. Analyse van deze kleine veranderingen FM signalen vereist dat het beeldvormingssysteem is voldoende gevoelig voor kleine veranderingen in intensiteit detecteren, maar dat kunstmatig veranderingen van grote amplitude worden onderdrukt. Hier beschrijven we een protocol dat kan worden toegepast opgeroepen, spontaan en miniatuur synaptische activiteiten en gebruik gekweekte hippocampale neuronen als voorbeeld. Dit protocol omvat ook een middel bepalen van de omvang van fotobleken FM kleurstoffen, aangezien dit een belangrijkebron van artefacten wanneer beeldvorming kleine veranderingen in de intensiteit.

Inleiding

De functionaliteit van synaptische blaasjes is een belangrijke determinant van synaptische transmissie. Deze blaasjes vrijkomen neurotransmitters als ze fuseren met de presynaptische plasmamembraan (exocytose), en worden ze klaar voor een nieuwe cyclus van vrijlating na wordt geregenereerd uit het plasmamembraan (endocytose) en herladen met neurotransmitter. Onderzoek naar de dynamiek van en de onderliggende mechanismen van synaptische blaasje recycling is sterk versneld door de invoering van styrylkleurstoffen FM kleurstoffen 1. Deze amfipatische moleculen, die positief hebben geladen hydrofiele kopgroepen en hydrofobe staarten (meerdere kleurstoffen in figuur 1A, stereoview van FM1-43 in Figuur 1B), kunnen reversibel invoeren en lipide membranen verlaten zonder doordringt hen. Groepen van FM kleurstoffen onderlinge overeenkomsten vertonen dat het bereik van het licht dat ze uitstralen beïnvloeden. Bijvoorbeeld, FM2-10, FM1-43, en FM1-84 hebben een dubbele binding tussen twee cyclische verbindingen en show groene emissie. Het verschil tussen hen is de lengte van de hydrofobe staart, die haar hydrofobiciteit bepaalt en daarmee de snelheid van uitgang uit het membraan (departitioning). In het geval van FM5-95 en FM4-64, drie dubbele bindingen verbinden de cyclische verbindingen, en ze tonen rode emissie. Deze kleurstoffen verschillen met betrekking tot hun hydrofiele delen. In alle FM kleurstoffen, de fluorescentie-intensiteit toeneemt wanneer ze worden ingebracht in biologische membranen, door een toename in de quantum opbrengst in de hydrofobe omgeving ten opzichte van de hydrofiele omgeving. Dus de veranderingen in de FM-intensiteit geven de veranderingen in de membraan omzet. De verschillende kleuren (emissie spectra) en hydrofobiciteiten maken van de FM-kleurstoffen een veelzijdig onderzoeksinstrument in synaptische blaasje recycling.

Op basis van deze eigenschappen worden de FM kleurstoffen meestal gebruikt volgens het volgende schema bij het ​​analyseren synaptische vesikel recycling (figuur 2). Neurons baden in een extracellulaire oplossing die het FM kleurstof, waardoor het worden opgenomen in synaptische blaasjes (SV) aangezien zij via endocytose (kleuring). De kleurstof wordt vervolgens weggewassen door een kleurstof vrij extracellulaire oplossing, dit toont de functionele zenuwuiteinden, namelijk alleen die actief ondergaan endocytose wordt een cluster van synaptische blaasjes die worden geladen met de kleurstof (figuur 2 beneden) bevatten. Na exocytose leidt tot verlies van de FM kleurstof aan de extracellulaire ruimte en een gelijktijdige verlies van fluorescentie (ontkleuren, door zowel de departitioning een hydrofiel milieu en diffusie vanaf de plaats van exocytose). Daarom zijn de veranderingen in de FM-fluorescentie-intensiteit zijn indicatoren van synaptische blaasjes exo-en endocytose.

FM kleurstoffen zijn gebruikt om vlekken en Destain de synaptische blaasjes in verschillende organismen en preparaten 2,3. Voorbeelden zijn zoogdieren neuronale culturen 4-9, zoogdierbrein plakjes 10,11, neuromusculaire verbindingen 12,13, retinale bipolaire neuronen 14,15 en haarcellen van slakkenhuis 16.

Meestal in dergelijke experimenten, zowel kleuren en ontkleuren worden getriggerd door uitvoerig stimuleren van de neuronen (opgeroepen activiteit). Onlangs echter synaptische vesikel recycling reactie op zwakke stimulatie ook geanalyseerd, evenals recycling in afwezigheid van een externe stimulus (spontane en miniatuur synaptische activiteit) 9,17-19. Spontane en miniatuur synaptische activiteiten worden gedefinieerd als die die in afwezigheid van externe stimuli, met de voormalige waarbij spontane afvuren van actiepotentialen (figuur 3). Deze zwakke synaptische activiteiten geassocieerd met kleinere veranderingen FM signalen dan die veroorzaakt door uitgebreide stimulatie. De meting vereist dat de veranderingen in de FM-tllingen intensiteit nauwkeurig weergeven synaptische vesikel exocytose of endocytose maar niet artefactuele veranderingen in intensiteit. Een oorzaak van het artefact is de aanwezigheid van niet-specifieke kleuring van de plasmamembraan door FM kleurstoffen. Geleidelijke uitspoeling van deze component leidt tot een geleidelijke verandering in de gemeten fluorescentie-intensiteit die ten onrechte wordt toegeschreven aan synaptische activiteiten. Deze factor kan worden verminderd door geschikte methoden (zie Protocol). De meest opvallende oorzaak van het artefact is de photobleaching van FM kleurstof vastgehouden binnen synaptische blaasjes. De photobleaching gerelateerde veranderingen in FM intensiteit moet klein zijn in vergelijking met de biologische (synaptische) veranderingen die worden gemeten. De recente ontwikkeling van gevoelige camera's, zoals het elektronen vermenigvuldigen ladingsgekoppelde inrichting (EMCCD) camera maakt het mogelijk fotobleken door het verkorten belichtingstijd en verzwakking van de intensiteit van het licht gebruikt om de fluorofoor wekken minimaliseren. Een andere oorzaak van het artefact is een drift in de nadruk niveau van de lichtmicroscoop. De focus drift tijdens een opnamesessie kan worden veroorzaakt door mechanische of thermische effecten, en ten onrechte leiden tot een verandering in de gemeten fluorescentie-intensiteit.

Hier beschrijven we protocollen en apparatuur die het mogelijk maken FM kleurstoffen om synaptische vesikel recycling analyseren zelfs in het kader van zwakke of geen stimulatie met name de miniatuur synaptische activiteit. We tonen voorbeelden van de kleuren en ontkleuren van blaasjes tijdens opgewekte en spontane synaptische gebeurtenissen, met behulp van gekweekte knaagdier hippocampus neuronen, en beeldvorming van het ontkleuren fase. We tonen ook hoe de mate van FM kleurstof fotobleking evalueren, bij het ontbreken van een FM-kleurstof verlies als gevolg van synaptische activiteiten.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

1. Primaire Cultuur van neuronen van de hersenen van zoogdieren

Alle dierlijke procedures uitgevoerd in deze studie worden goedgekeurd door de Institutional Animal Care en gebruik Comite van de Universiteit van Iowa.

  1. Bereid de gedissocieerde celkweek van de CA3-CA1 regio van hippocampus van muizen of ratten op postnatale dagen 0-1 19,20. Plate hippocampale cellen op 12-mm dekglaasjes (dikte getal 0) preseeded de ratten gliale feeder-laag, in 24 putjes en met een dichtheid van 12.000 cellen / putje.
  2. Cultuur de hippocampus neuronen gedurende minstens 8 dagen voor functionele zenuwuiteinden te ontwikkelen 21. We maken gebruik van neuronen van 11-14 dagen in vitro als individuele zenuwuiteinden zijn relatief geïsoleerd zonder veel clustering. Neuronen kunnen worden gebruikt voor experimenten tot ongeveer 21-28 dagen in vitro bijvoorbeeld Willig et al.. 22 en Nosyreva en Kavalali 23.
  3. Voorfunctionele studies, beoordelen dekglaasjes (voor kleuring) voor indicatoren van gezonde neuronen met behulp van doorvallend licht microscopie (bijvoorbeeld fase-contrast optiek bij een vergroting van 10-20x). De indicatoren van een goede gezondheid zijn onder meer: ​​een uniforme gliale cellaag, een duidelijke cellulaire marge rond de neuronen, dendrieten verlengd zonder kralen structuren, een gebrek aan geclusterde somata, en een gebrek aan gebundelde neurites.

2. Het laden van de synaptische blaasjes met de FM-Dye (kleuring)

  1. Vlekken als gevolg van synaptische activiteit opgewekt door elektrisch veld stimulatie (betreft actiepotentialen)
    1. Bereid kleuring oplossing 1 door toevoeging van de FM-kleurstof een HEPES-based-dye gratis oplossing, bijvoorbeeld Tyrode's oplossing (zie SOLUTIONS voor details). De concentratie van FM kleurstof 10 uM FM1-43 en 2,5 uM FM4-64. Typische concentratiebereiken zijn: 2-15 uM FM1-43, of 2,5-20 pM FM4-64 3,6. Voor experimenten waarbij onderdrukking van recidiverendeglutamaat synaptische activiteit en de inductie van synaptische plasticiteit, verder antagonisten van ionotrope glutamaat receptoren te voegen: AMPA receptoren (bijv. 10 uM CNQX) en NMDA-receptoren (bijvoorbeeld 50 uM AP5).
    2. Transfer een dekglaasje met cellen uit het kweekmedium om de beeldvorming kamer ingevuld met oplossing vlakte Tyrode. We gebruiken een imaging kamer met de stimulatie elektroden op de zijwanden (platinadraden gescheiden door 6,3 mm, RC-21BRFS). Deze kamer is ontworpen als een gesloten beeldvorming kamer, maar we gebruiken het als een open ruimte (dwz zonder een top dekglaasje), met een bad volume van ~ 200 pi. Tijdens de overdracht, niet de gekweekte cellen bloot te stellen aan de lucht, en vermijd het afklemmen van de gekweekte cellen met de pincet (kies de dekglaasje uit de perimeter plaats nabij het centrum).
    3. Perfuse de beeldvorming kamer met oplossing vlakte Tyrode bij kamertemperatuur (23-25 ​​° C).
    4. Solliciteer kleuring oplossing 1 door constant perfusie.
    5. Roepen synaptische activiteit door het toepassen van elektrische pulsen. Voor maximale kleuring van de totale recycling pool van synaptische blaasjes in hippocampale neuronen, het stimuleren van de culturen bij 10 Hz voor 60-120 sec 24. Wanneer het proberen om een ​​maximale efficiëntie van veldstimulatie bereiken, houden verschillende functies in het achterhoofd. 1) De hoogte van het bad oplossing moet zo laag mogelijk zijn, terwijl de neuronen en stimulatie-elektroden volledig ondergedompeld in een dunne laag van Tyrode's oplossing (om de neuronen in leven en een homogeen elektrisch veld te verkrijgen). 2) Stroomsterkte en duur moeten worden geoptimaliseerd met behulp van een indicator van neuronale exciteerbaarheid zoals fluorescerende Ca2 + imaging, in ons geval een constante stroom van 30 mA intensiteit en 1 msec duur geeft betrouwbare resultaten. 3) De badoplossing worden toegepast bij constante stroom tijdens stimulatie, elektrische stimulatie leidt tot elektrolyse, waardoor protonen (H +) te accumuleren bij de positief geladen anode en de pH bij de anode snel af in een statisch bad. Controleer de verzuring in een afzonderlijk experiment door het passeren meer dan een paar honderd pulsen door een oplossing die een pH-indicator (bijv. Hanks 'gebalanceerde zoutoplossing met fenolrood) bevat.
    6. Laat de neuronen in kleuroplossing 1 voor een extra 60 seconden na veldstimulatie wordt beëindigd, zodat de post-stimulus endocytose zal worden afgerond 25.
    7. Was de kleuring oplossing uit de beeldvorming kamer te doorstromen met spoelen oplossing 1, oplossing van een kleurstof vrij Tyrode plus antagonisten van AMPA receptoren en NMDA-receptoren (zie paragraaf 2.1.1), en een blokker van spanningsafhankelijke Na + kanalen ( bv. 0,5-1 uM tetrodotoxin, TTX). De combinatie van blokkers zal het verlies van de FM-kleurstof onderdrukken door spontane synaptische activiteit. Om het wassen efficiëntie te maximaliseren, vergroten de perfusiesnelheid ( bijvoorbeeld tot 5-6 ml / min) gedurende 1-2 min en voeg een bolus (bijv. 1 ml) van spoeloplossing 1 rechtstreeks naar de open beeldvorming kamer handmatig pipetteren. Controle van de sterkte en richting van handmatige infusie, om niet de gekweekte neuronen verstoren.
  2. Vlekken als gevolg van synaptische activiteit opgewekt door hoge-K +-oplossing (niet actiepotentialen te betrekken).
    1. Bereid kleuroplossing 2, door de FM kleurstof hoog K + Tyrode's oplossing. Specifiek, bereiden een gemodificeerde Tyrode oplossing met 45 mM KCl, door equimolaire substitutie van KCl voor NaCl. Indien nodig, voeg antagonisten van AMPA en NMDA-receptoren. Deze high-K +-oplossing zal neuronen continu depolariseren, staat Ca 2 + instroom in zenuwuiteinden en initiëren synaptische vesikel exocytose aan de maximale omvang 26. Hogere concentraties (70-90 mM) werden ook gebruikt in andere verslagen bijv. Klingauf et al.. 27 eend Richards et al.. 28
    2. Transfer een dekglaasje met gekweekte neuronen uit het kweekmedium om de beeldvorming kamer ingevuld met oplossing vlakte Tyrode.
    3. Vlekken de neuronen bij kamertemperatuur gedurende 1-2 minuten door toepassing kleuroplossing 2 tegen constante perfusie of met een pipet 26,28. In het laatste geval moet de uiteindelijke kleurstof concentratie worden geregeld door toevoeging van een bekende hoeveelheid kleuroplossing 2 een bekende hoeveelheid kleurstof oplossing.
    4. Was de kleuring oplossing uit de beeldvorming kamer, zoals beschreven in paragraaf 2.1.7.
  3. Vlekken als gevolg van spontane en miniatuur synaptische activiteit.
    1. Voorverwarmen bicarbonaat gebaseerde oplossing (bijv. Minimum Essential Medium, MEM) tot 37 ° C door in de incubator gedurende meer dan 60 minuten.
    2. Voor kleuring op basis van spontane synaptische activiteit, bereid kleuroplossing 3 door toevoeging van de FM kleurstof MEM. Voor kleuring op basis van miniature synaptische activiteit, bereiden kleuroplossing 4 door toevoeging TTX om de kleuring oplossing 3.
    3. Stain neuronen door het overdragen van een dekglaasje met gekweekte neuronen van kweekmedium oplossing 3 of 4 vlekken, en waardoor ze in dezelfde kleuroplossing bij 37 ° C gedurende 10 minuten.
    4. Spoel de dekglaasje kort spoelen oplossing 1.
    5. Breng de dekglaasje te spoelen oplossing 1 in een beeldvorming kamer. Houd rekening met de volgende. 1) De cellen moeten niet worden blootgesteld aan lucht, indien nodig, de overdracht van het dekglaasje rechtstreeks aan de beeldvorming kamer zonder spoelen. 2) Neuronen kunnen bij kamertemperatuur worden gekleurd door het vervangen kleuroplossing 3 of 4 met HEPES-gebaseerde oplossing. 3) Neuronen kunnen worden gekleurd voor uitgelokte synaptische activiteit in de context van hoge-K + oplossing met deze werkwijze door het vervangen kleuroplossing 3 of 4 met kleuroplossing 2 en uitvoeren van de resterende stappen bij kamertemperatuur.
    6. Was de kleuring oplossing uit de beeldvorminggeplaatst zoals beschreven in paragraaf 2.1.7.

3. Uitwassen van de FM-Dye

  1. Na neuronale kleuring en eerste wasbeurt door een van de hierboven beschreven werkwijzen (hoofdstuk 2.1.7), blijven de beeldvorming kamer perfuseren met spoeloplossing 1 gedurende 5-10 minuten bij kamertemperatuur. Dit zal de FM kleurstof uit het plasmamembraan en de extracellulaire oplossing. Bij onze beeldvorming kamer, het bad perfusiesnelheid is 600-1,200 pl / min. Wassen kunnen ook in afwezigheid van extracellulair Ca2 + FM kleurstof verlies onderdrukken vanwege synaptische activiteiten 17 worden uitgevoerd. Het wassen kan worden verbeterd door toepassing van een korte Advasep-7, een gemodificeerde cyclodextrine dat dient als een binder van FM kleurstoffen uit de plasmamembraan 29-31. Het is cruciaal om elke Advasep-7 kortdurende (bijvoorbeeld 5 seconden in het geval van een monolaagcultuur) te houden om te voorkomen dat zowel het verminderen van de intensiteit van de FM puncta 31 en afbreuk te doen aan de health van de cellen. De fluorescentie van FM1-43 in het plasmamembraan kan worden onderdrukt door een toepassing van een quencher sulforhodamine 101 (50-100 uM) dat synaptische blaasjes 32 kan binnendringen.

4. Op zoek naar een optimaal beeld Field tijdens het wassen

  1. Controleer of de cellen in het veld te beelden gezond, met doorvallend licht microscopie met een hoge vergroting en hoge numerieke apertuur-objectief (bijv. 40X). Vanuit dit gedeelte, blijven we een omgekeerde microscoop (Eclipse Ti, Nikon) uitgerust met fase-contrast of differentieel interferentie contrast optiek gebruiken. Deze microscoop is ook uitgerust met Perfect Focus System (PFS) die continue, real-time scherpstelling, waarbij de microscoop nadruk drift overwint maakt. Deze functie is essentieel voor time-lapse imaging tijdens ontkleuren met dezelfde aandacht vliegtuig.
  2. Controleer kleuring was effectief met fluorescentie optiek. Avoid aggregaten van FM puncta tenzij ze het doelwit van onderzoek, omdat individuele boutons moeilijk te onderscheiden zijn. Besteed aandacht aan de vormen van de FM puncta: als de meeste van de gebrandschilderde Boutons verschijnen als snaren van ronde kralen, konden ze ongezond zenuwuiteinden vertegenwoordigen. De blootstelling van de neuronen sterke fluorescentie excitatie minimaliseren om fotobleken voorkomen.

5. Lossen FM Dye uit de synaptische blaasjes (Ontkleuroplossing)

  1. Ontkleuren door synaptische activiteit opgewekt door elektrisch veld stimulatie.
    1. Wash TTX door perfunderen de neuronen uitgebreid met een spoeling oplossing 2 (zelfde als spoeloplossing 1 maar zonder TTX). Bevestigen de doeltreffendheid van TTX verdwijnen in afzonderlijke experimenten, met dezelfde parameters wassen (perfusie frequentie en duur), bijvoorbeeld door fluorescente Ca2 + beeldvorming van cytoplasmatisch Ca2 + transiënten opgewekt door veldstimulatie of door de patch-clamp registratie van voltleeftijd-afhankelijke Na + stromen.
    2. Start beeldvorming van de FM kleurstoffen. Voor beeldvorming FM1-43 of FM4-64, gebruikt 520 nm of 650 nm lange pass emissie filters, respectievelijk en een 490 nm excitatie filter. Acquire beelden elke 1-2 sec, met een korte belichtingstijd (bijv. 10-20 msec), zwak excitatie-intensiteit (bijv. 5-10% van LED-vermogen), en een hoge gevoeligheid (bijv. met EM winst). Minimaliseren fotobleken van de FM kleurstoffen door het verminderen van de blootstelling tijd en de intensiteit van fluorescentie excitatie. Minimaliseer de microscoop nadruk drift door het inschakelen van de Perfect Focus System.
    3. Stimuleren van de neuronen in het spoelen oplossing 2, met behulp van veld-stimulatie (bijvoorbeeld bij 10 Hz voor 120 sec) 20.
    4. Werken met meerdere rondes van de stimulatie, met tussenliggende perioden rest van 1-2 minuten, tot alle recycling synaptische blaasjes van FM kleurstof afbreken. Dit is van belang bij de beoordeling van de omvang van de totale recycling pool van synaptische blaasjes die werden gekleurd met FM kleurstoffen in the voorafgaande toestand 20,33.
  2. Ontkleuren vanwege synaptische activiteiten opgeroepen in de afwezigheid van actiepotentialen.
    1. Start beeldvorming van de FM-kleurstof.
    2. Breng de stimulerende reagentia opgelost in spoeloplossing 1 of 2. Dergelijke reagentia omvatten: KCl (hoog K +-oplossing, bijvoorbeeld 45 mM) 26, ionomycine (a Ca2 + ionofoor die de intracellulaire Ca2 +-concentratie verhoogt doordat Ca2 + influx in de cel vanuit de extracellulaire oplossing, bijvoorbeeld gebruikt bij 5 uM) 20,34, en sucrose (een hypertone oplossing die de afgifte van synaptische blaasjes van gemakkelijk afgeefbare zwembad, bijvoorbeeld gebruikt op 500 mm) 35,36 stimuleert. Gebruik een snelle, lokale perfusie-systeem voor een betrouwbare tijdelijke controle bij de toepassing van de reagentia, zoals de SF-77B systeem van Warner Instruments 37, of Y-buis systeem 38-40.
  3. Ontkleuren wijten aan spontane en miniature synaptische activiteit.
    1. Voor ontkleuren vanwege spontane synaptische activiteit, wassen TTX zoals hierboven beschreven (paragraaf 5.1.1), met behulp van spoelen oplossing 2. Start de beeldvorming van de FM-kleurstoffen terwijl perfunderen neuronen met spoelen oplossing 2. Voor ontkleuren vanwege miniatuur synaptische activiteiten, beginnen de beeldvorming van de FM-kleurstoffen, terwijl het voortdurend om de neuronen perfuseren met spoeloplossing 1 (met TTX).
    2. Na ontkleuren op basis van hetzij spontane of miniatuur activiteit, het identificeren van de functionele zenuwuiteinden door ontkleuren via opgeroepen synaptische activiteit. Activiteit kan worden opgewekt door een van de hierboven beschreven procedures. Deze zoektocht is nodig omdat de gekleurde structuren zijn die verschilt van de functionele zenuwuiteinden (bijv. langzaam recycling endosomen of astrocyten blaasjes) en een grote hoeveelheid ontkleuren door de opgewekte activiteit helpt bij dit proces.

6. Het beoordelen van de Fotobleken Rate of FM Kleurstoffen

  1. Vlekken op de zenuwuiteinden met aldehyde-fixable FM kleurstof (bijv. FM1-43FX, FM4-64FX). Dit kan gebeuren met behulp van de gemeten, spontane of miniatuur kleuring hierboven beschreven, en door het vervangen FM kleurstof met een fixeerbaar FM kleurstof.
  2. Spoel de fixable FM kleurstof zoals beschreven in paragraaf 2.1.7.
  3. Chemisch neuronen lossen door overdracht van het dekglaasje te fixeeroplossing: 4% paraformaldehyde en 4% sucrose in Tyrode's oplossing gedurende 30 minuten bij 4 ° C. De fluorescentie intensiteit van de vastzetbaar FM kleurstof na chemische fixatie behouden.
  4. Spoel de fixeermiddel gedurende 10 min in Tyrode oplossing, door de overdracht van de dekglaasje aan oplossing verse Tyrode tweemaal.
  5. Breng de dekglaasje in oplossing verse Tyrode in de beeldvorming kamer.
  6. Start de beeldvorming van de fixable FM kleurstof met behulp van dezelfde set van imaging parameters als voor live-neuronen. Het is belangrijk om de beeldvorming kamer spoel goed na het gebruik van chemisch vast monster, aangezienresterende fixatief kan beïnvloeden daaropvolgende live cell imaging experimenten die in dezelfde kamer worden uitgevoerd. Als alternatief voor de vaste cell imaging, kan de gekleurde levende cellen worden afgebeeld voor de beoordeling van de photobleaching tarief. Het is echter de moeite waard in gedachten houden dat het moeilijk is om de miniatuur synaptische activiteit acuut blokkeren, bijvoorbeeld, kan de frequentie van miniatuur activiteit ~ 50% te reduceren door het extracellulair Ca2 + 23, maar het is niet een compleet blokkade.
  7. Aan het einde van elke opnamesessie een achtergrondafbeelding beoordeling van de absolute waarde van de FM fluorescentie-intensiteit te verkrijgen. De intensiteit van FM puncta niet alleen het ware signaal van de FM kleurstoffen in zenuwuiteinden, maar ook de achtergrondruis van 1) gliacellen die de neuronale monolaag cultuur, 2) het dekglaasje en optische componenten (bijv. objectieflens, filters en grondslag spiegels), en 3) de detector (EMCCD camera). Achtergrond geluid is assessed in nonstained regio's van het afgebeelde veld. Wanneer dergelijke regio's zijn beperkt in ruimte of heterogeen in intensiteit, vervang het met een beeld met de camera sluiter gesloten en het lawaai van de detector te verwerven, maar het is niet een ideale methode. Acquire ongeveer 10 beelden met dezelfde imaging parameters.

7. Beeldanalyse

  1. Importeer de verkregen gegevens in het beeld-analyse software als een stapel tijd-serie beelden. Wij gebruiken ImageJ (WS Rasband, NIH) en de bijbehorende plug-ins, zoals Image Stabilizer plug-in (Kang Li) voor het corrigeren van een kleine mate van beweging onder FM puncta en Time Series Analyzer V2.0 (Balaji Jayaprakash) voor het analyseren de tijdreeks.
  2. Bereken de verandering in FM intensiteit aan het begin en einde van de reeks (ΔFM). Daartoe gemiddelde van de beelden voorafgaand aan ontkleuren en na afloop van ontkleuroplossing (bijv. 5 beeldframes elk), en het verschil genereren door subtractinG hen.
  3. Identificeer de potentieel functionele zenuwuiteinden door het toepassen van een intensiteit drempel op de foto het verschil, en detecteren pixels waarvan de intensiteiten hoger zijn dan de drempel. Een berekening van de drempelwaarde de standaardafwijking van de achtergrondintensiteit verkregen uit de naakte dekglaasje gebied kiezen.
  4. Identificeer de geïsoleerde, functionele zenuwuiteinden als de aangrenzende pixels die werden ontdekt en die voldoen aan een deeltjesgrootte (minimale en maximale aantal pixels in contiguïteit). Dit proces elimineert achtergrondgeluid en geaggregeerde zenuwuiteinden van de analyse.
  5. Wijs regio-of-interest (ROI) op de gedetecteerde pixelclusters (met afzonderlijke clusters overeenkomt met het individuele zenuwuiteinden). De totale verandering in intensiteit tijdens ontkleuren (ΔFM) is een typische parameter analyse. Dit is het cumulatieve bedrag van opgewekte, spontane of miniatuur synaptische activiteit. ROI uitsluiten indien zij vertonen een van de volgendeveranderingen in intensiteit, afhankelijk van doel van de experimenten: een stijging tijdens de opname, een plotselinge afname voor stimulatie, of een lange latentietijd na stimulatie.
  6. Beoordeel de snelheid van fotobleken door het importeren van de verworven tijdreeksen in het beeld-analyse software. Het gemiddelde van de achtergrond beelden (bv. met een gesloten sluiter), en het aftrekken van de afzonderlijke beelden. ROI's toewijzen aan FM puncta die vermoedelijk overeenkomen met zenuwuiteinden, en veranderingen in ROI intensiteit te meten in de tijd.

Oplossingen

  1. Tyrode's oplossing
    • Samenstelling (mM): 125 NaCl, KCl 2, 2 CaCl2, 2 MgCl2, 30 glucose, 25 HEPES, 310 mOsm, pH 7,4.
  2. Kleuroplossing 1
    • Tyrode's oplossing plus de FM kleurstof.
    • Deze oplossing wordt gebruikt voor de kleuring op basis van synaptische activiteit opgewekt door elektrische stimulatie.
    • Voeg de antagonisten van AMPA receptoren en NMDA receptors indien nodig.
  3. Kleuroplossing 2
    • Hoge-K + Tyrodes oplossing plus de FM kleurstof.
    • Deze gemodificeerde Tyrodes oplossing wordt bereid door het verhogen van de KCl concentratie 45 mM, bij equimolaire vervanging van KCl voor NaCl.
    • Deze oplossing wordt gebruikt voor de kleuring op basis opgeroepen synaptische activiteit door continue depolarisatie.
    • Voeg de antagonisten van AMPA receptoren en NMDA receptoren indien nodig.
  4. Kleuroplossing 3
    • MEM oplossing plus de FM-kleurstof.
    • Deze oplossing wordt gebruikt voor de kleuring, gebaseerd op spontane synaptische activiteit.
  5. Kleuroplossing 4
    • MEM oplossing plus de FM-kleurstof en TTX.
    • Deze oplossing wordt gebruikt voor de kleuring, gebaseerd op miniatuur synaptische activiteit.
  6. Spoelen oplossing 1
    • Tyrode's oplossing plus de antagonisten van AMPA receptoren en NMDA-receptoren en TTX.
  7. Spoeloplossing 2
    • Tyrode's oplossing plus de antagonisten van AMPA receptoren en NMDA-receptoren, maar zonder TTX.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

Als voorbeeld tonen wij representatieve resultaten voor de ontkleuroplossing tijdsverloop van synaptische vesicles (figuur 4). Gekweekte hippocampale neuronen gekleurd met FM4-64 met de spontane synaptische activiteit (stap 2.3) en gewassen met kleurstofvrije oplossing (spoeloplossing 2). De beeldvorming toont de initiële ontkleuroplossing tijdsverloop behulp van spontane activiteit (stap 5.3) (eerste onderdeel van de continue lijn, figuur 4A). Dit wordt gevolgd door de ontkleuroplossin...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

We hebben protocollen beschreven voor het kleuren en ontkleuren synaptische blaasjes in reactie op opgewekte, spontane en miniatuur synaptische activiteit en voor het afbeelden in de ontkleuroplossing fase. Naast de bestaande protocollen, hebben we een nieuw protocol observeren de FM ontkleuroplossing basis van miniatuur synaptische activiteit inbegrepen. Met deze protocollen we eerder geïdentificeerde afwijkingen in gekweekte neuronen van een muismodel van de beweging dystonie. In vergelijking met hun tegenhangers in w...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs verklaren geen concurrerende financiële belangen.

Dankbetuigingen

De auteurs danken de leden van de harata lab voor nuttige discussies tijdens de uitvoering van dit werk. Dit werk werd gefinancierd door subsidies van de American Heart Association, de Dystonie Medical Research Foundation, de Edward Mallinckrodt, Jr Foundation, de National Science Foundation, en de Whitehall Stichting NCH

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
PulsgeneratorAMPIMaster-8
Geïsoleerde stimulatorfigure-materials-1 DigitimerDS3
Omgekeerde microscoopNikonEclipse TS100Deze wordt gebruikt voor het beoordelen van de celmorfologie bij een lage vergroting.
Omgekeerde microscoopNikonEclipse TiEDeze wordt gebruikt voor fluorescentie- en transmissielichtbeeldvorming met een hoge resolutie en minimale focusdrift.
ObjectiefNikonEen waterimmersielens wordt aanbevolen. Een olieimmersielens kan worden gebruikt, tenzij een afgebeelde structuur zich diep onder het oppervlak van het dekglas bevindt (bijv. >10 μm).
FilterkubusNikon77032509490/20-nm ex, 510-nm dclp, 520-nm-LP em voor FM1-43
FilterkubusNikon77032809490/420 nm ex, 510 nm dclp, 650 nm LP em voor FM4-64. 
EMCCD-cameraAndor TechnologyiXon EM+ DU-860Deze EMCCD-camera wordt gebruikt voor hooggevoelige detectie van fluorescentie.
Vloeistofrecirculerende koelerSolid State Cooling SystemsOasis 160Deze wordt gebruikt voor het continu perfunderen van de camera met gekoeld water om een temperatuur van -80°C te handhaven, waardoor ruis wordt verminderd.
LEDCoolLED-Custom Interconnect490 nmDeze lichtbron wordt gebruikt voor snelle aan/uit-besturing van fluorescentie-excitatie.
BeeldacquisitiesoftwareAndor TechnologySolis
BeeldvormingskamerWarner InstrumentsRC-21BRFS
Snel perfusiesysteemWarner InstrumentsSF-77B
CNQXTocris Bioscience1045
D,L-AP5Tocris Bioscience0106
TetrodotoxineTocris Bioscience1069Waarschuwing: toxisch reagens. Voorzichtig hanteren.
FM1-43InvitrogenT35356
Aldehyde-fixeerbare FM1-43 (FM1-43FX)InvitrogenF35355
FM4-64InvitrogenT13320
Aldehyde-fixeerbare FM4-64 (FM4-64FX)InvitrogenF34653
IonomycineSigma-AldrichI0634
Hanks’ gebalanceerde zoutoplossingSigma-AldrichH2387
Minimum Essential MediumInvitrogen51200-038Deze oplossing bevat geen fenolrood, wat de fluorescentiebeeldvorming zou verstoren.
ParaformaldehydeElectron Microscopy Sciences15710Waarschuwing: toxisch reagens. Voorzichtig hanteren.
SucroseSigma-AldrichS7903

Referenties

  1. Betz, W. J., Bewick, G. S. Optical analysis of synaptic vesicle recycling at the frog neuromuscular junction. Science. 255, 200-203 (1992).
  2. Gaffield, M. A., Betz, W. J. Imaging synaptic vesicle exocytosis and endocytosis with FM dyes. Nat. Protoc. 1, 2916-2921 (2006).
  3. Hoopmann, P., Rizzoli, S. O., Betz, W. J. Imaging synaptic vesicle recycling by staining and destaining vesicles with FM dyes. , Cold Spring Harb Protoc. 77-83 (2012).
  4. Newton, J., Murthy, V. Measuring exocytosis in neurons using FM labeling. J. Vis. Exp. , (2006).
  5. Evans, G. J., Cousin, M. A. Simultaneous monitoring of three key neuronal functions in primary neuronal cultures. J. Neurosci. Methods. 160, 197-205 (2007).
  6. Cousin, M. A. Use of FM1-43 and other derivatives to investigate neuronal function. Curr. Protoc. Neurosci. 2, (2008).
  7. Clayton, E. L., Cousin, M. A. Quantitative monitoring of activity-dependent bulk endocytosis of synaptic vesicle membrane by fluorescent dextran imaging. J. Neurosci. Methods. 185, 76-81 (2009).
  8. Cheung, G., Cousin, M. A. Quantitative analysis of synaptic vesicle pool replenishment in cultured cerebellar granule neurons using FM dyes. J. Vis. Exp. , (2011).
  9. Welzel, O., Tischbirek, C. H., Kornhuber, J., Groemer, T. W. Pool-independent labelling of synaptic vesicle exocytosis with single vesicle resolution in rat hippocampal neurons. J. Neurosci. Methods. 205, 258-264 (2012).
  10. Winterer, J., Stanton, P. K., Muller, W. Direct monitoring of vesicular release and uptake in brain slices by multiphoton excitation of the styryl FM 1-43. Biotechniques. 40, 343-351 (2006).
  11. Kay, A. R. Imaging FM dyes in brain slices. Cold Spring Harb. Protoc. , (2007).
  12. Verstreken, P., Ohyama, T., Bellen, H. J. FM 1-43 labeling of synaptic vesicle pools at the Drosophila neuromuscular junction. Methods Mol. Biol. 440, 349-369 (2008).
  13. Amaral, E., Guatimosim, S., Guatimosim, C. Using the fluorescent styryl dye FM1-43 to visualize synaptic vesicles exocytosis and endocytosis in motor nerve terminals. Methods Mol. Biol. 689, 137-148 (2011).
  14. Guatimosim, C., von Gersdorff, H. Optical monitoring of synaptic vesicle trafficking in ribbon synapses. Neurochem. Int. 41, 307-312 (2002).
  15. Joselevitch, C., Zenisek, D. Imaging exocytosis in retinal bipolar cells with TIRF microscopy. J. Vis. Exp. , 1305(2009).
  16. Griesinger, C. B., Richards, C. D., Ashmore, J. F. FM1-43 reveals membrane recycling in adult inner hair cells of the mammalian cochlea. J. Neurosci. 22, 3939-3952 (2002).
  17. Sara, Y., Virmani, T., Deak, F., Liu, X. An isolated pool of vesicles recycles at rest and drives spontaneous neurotransmission. Neuron. 45, 563-573 (2005).
  18. Wilhelm, B. G., Groemer, T. W., Rizzoli, S. O. The same synaptic vesicles drive active and spontaneous release. Nat. Neurosci. 13, 1454-1456 (2010).
  19. Kakazu, Y., Koh, J. Y., Iwabuchi, S., Gonzalez-Alegre, P., Harata, N. C. Miniature release events of glutamate from hippocampal neurons are influenced by the dystonia-associated protein torsinA. Synapse. 66, 807-822 (2012).
  20. Kakazu, Y., Koh, J. Y., Ho, K. W., Gonzalez-Alegre, P., Harata, N. C. Synaptic vesicle recycling is enhanced by torsinA that harbors the DYT1 dystonia mutation. Synapse. 66, 453-464 (2012).
  21. Kavalali, E. T., Klingauf, J., Tsien, R. W. Activity-dependent regulation of synaptic clustering in a hippocampal culture system. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 96, 12893-12900 (1999).
  22. Willig, K. I., Rizzoli, S. O., Westphal, V., Jahn, R., Hell, S. W. STED microscopy reveals that synaptotagmin remains clustered after synaptic vesicle exocytosis. Nature. 440, 935-939 (2006).
  23. Nosyreva, E., Kavalali, E. T. Activity-dependent augmentation of spontaneous neurotransmission during endoplasmic reticulum stress. J. Neurosci. 30, 7358-7368 (2010).
  24. Ryan, T. A., Smith, S. J. Vesicle pool mobilization during action potential firing at hippocampal synapses. Neuron. 14, 983-989 (1995).
  25. Ryan, T. A., Smith, S. J., Reuter, H. The timing of synaptic vesicle endocytosis. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 93, 5567-5571 (1996).
  26. Harata, N., et al. Limited numbers of recycling vesicles in small CNS nerve terminals: implications for neural signaling and vesicular cycling. Trends Neurosci. 24, 637-643 (2001).
  27. Klingauf, J., Kavalali, E. T., Tsien, R. W. Kinetics and regulation of fast endocytosis at hippocampal synapses. Nature. 394, 581-585 (1998).
  28. Richards, D. A., Bai, J., Chapman, E. R. Two modes of exocytosis at hippocampal synapses revealed by rate of FM1-43 efflux from individual vesicles. J. Cell Biol. 168, 929-939 (2005).
  29. Kay, A. R., et al. Imaging synaptic activity in intact brain and slices with FM1-43 in C. elegans, lamprey, and rat. Neuron. 24, 809-817 (1999).
  30. Darcy, K. J., Staras, K., Collinson, L. M., Goda, Y. An ultrastructural readout of fluorescence recovery after photobleaching using correlative light and electron. 1, 988-994 (2006).
  31. Moulder, K. L., Jiang, X., Taylor, A. A., Benz, A. M., Mennerick, S. Presynaptically silent synapses studied with light microscopy. J. Vis. Exp. , (2010).
  32. Pyle, J. L., Kavalali, E. T., Choi, S., Tsien, R. W. Visualization of synaptic activity in hippocampal slices with FM1-43 enabled by fluorescence quenching. Neuron. 24, 803-808 (1999).
  33. Harata, N. C., Choi, S., Pyle, J. L., Aravanis, A. M., Tsien, R. W. Frequency-dependent kinetics and prevalence of kiss-and-run and reuse at hippocampal synapses studied with novel quenching methods. Neuron. 49, 243-256 (2006).
  34. Piedras-Renteria, E. S., et al. Presynaptic homeostasis at CNS nerve terminals compensates for lack of a key Ca2+ entry pathway. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101, 3609-3614 (2004).
  35. Rosenmund, C., Stevens, C. F. Definition of the readily releasable pool of vesicles at hippocampal synapses. Neuron. 16, 1197-1207 (1996).
  36. Pyle, J. L., Kavalali, E. T., Piedras-Renteria, E. S., Tsien, R. W. Rapid reuse of readily releasable pool vesicles at hippocampal synapses. Neuron. 28, 221-231 (2000).
  37. Kawano, H., et al. Long-term culture of astrocytes attenuates the readily releasable pool of synaptic vesicles. PLoS ONE. 8, (2012).
  38. Harata, N., Katayama, J., Takeshita, Y., Murai, Y., Akaike, N. Two components of metabotropic glutamate responses in acutely dissociated CA3 pyramidal neurons of the rat. Brain Res. 711, 223-233 (1996).
  39. Kira, T., Harata, N., Sakata, T., Akaike, N. Kinetics of sevoflurane action on GABA- and glycine-induced currents in acutely dissociated rat hippocampal neurons. Neuroscience. 85, 383-394 (1998).
  40. Harata, N., Katayama, J., Akaike, N. Excitatory amino acid responses in relay neurons of the rat lateral geniculate nucleus. Neuroscience. 89, 109-125 (1999).
  41. Albeanu, D. F., Soucy, E., Sato, T. F., Meister, M., Murthy, V. N. LED arrays as cost effective and efficient light sources for widefield microscopy. PLoS ONE. 3, e2146(2008).
  42. Neves, G., Lagnado, L. The kinetics of exocytosis and endocytosis in the synaptic terminal of goldfish retinal bipolar cells. J. Physiol. 515, 181-202 (1999).
  43. Mazzone, S. B., et al. Fluorescent styryl dyes FM1-43 and FM2-10 are muscarinic receptor antagonists: intravital visualization of receptor occupancy. J. Physiol. 575, 23-35 (2006).
  44. Gale, J. E., Marcotti, W., Kennedy, H. J., Kros, C. J., Richardson, G. P. FM1-43 dye behaves as a permeant blocker of the hair-cell mechanotransducer channel. J. Neurosci. 21, 7013-7025 (2001).
  45. Li, D., Herault, K., Oheim, M., Ropert, N. FM dyes enter via a store-operated calcium channel and modify calcium signaling of cultured astrocytes. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106, 21960-21965 (2009).
  46. Crumling, M. A., et al. P2X antagonists inhibit styryl dye entry into hair cells. Neuroscience. 161, 1144-1153 (2009).
  47. Zhu, Y., Stevens, C. F. Probing synaptic vesicle fusion by altering mechanical properties of the neuronal surface membrane. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 18018-18022 (2008).
  48. Thiagarajan, T. C., Lindskog, M., Tsien, R. W. Adaptation to synaptic inactivity in hippocampal neurons. Neuron. 47, 725-737 (2005).
  49. Miesenböck, G., De Angelis, D. A., Rothman, J. E. Visualizing secretion and synaptic transmission with pH-sensitive green fluorescent proteins. Nature. 394, 192-195 (1998).
  50. Li, H., et al. Concurrent imaging of synaptic vesicle recycling and calcium dynamics. Front. Mol. Neurosci. 4, 34(2011).
  51. Raingo, J., et al. VAMP4 directs synaptic vesicles to a pool that selectively maintains asynchronous neurotransmission. Nat. Neurosci. 15, 738-745 (2012).
  52. Martens, H., et al. Unique luminal localization of VGAT-C terminus allows for selective labeling of active cortical GABAergic synapses. J. Neurosci. 28, 13125-13131 (2008).
  53. Hua, Y., Sinha, R., Martineau, M., Kahms, M., Klingauf, J. A common origin of synaptic vesicles undergoing evoked and spontaneous fusion. Nat. Neurosci. 13, 1451-1453 (2010).
  54. Hua, Y., et al. A readily retrievable pool of synaptic vesicles. Nat. Neurosci. 14, 833-839 (2011).
  55. Groemer, T. W., Klingauf, J. Synaptic vesicles recycling spontaneously and during activity belong to the same vesicle. 10, 145-147 (2007).
  56. Moulder, K. L., et al. A specific role for Ca2+-dependent adenylyl cyclases in recovery from adaptive presynaptic silencing. J. Neurosci. 28, 5159-5168 (2008).
  57. Crawford, D. C., Jiang, X., Taylor, A., Moulder, K. L., Mennerick, S. Differential requirement for protein synthesis in presynaptic unmuting and muting in hippocampal glutamate terminals. PLoS ONE. 7, (2012).
  58. Henkel, A. W., Lubke, J., Betz, W. J. FM1-43 dye ultrastructural localization in and release from frog motor nerve terminals. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 93, 1918-1923 (1996).
  59. Harata, N., Ryan, T. A., Smith, S. J., Buchanan, J., Tsien, R. W. Visualizing recycling synaptic vesicles in hippocampal neurons by FM 1- 43 photoconversion. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 98, 12748-12753 (2001).
  60. Opazo, F., Rizzoli, S. O. Studying synaptic vesicle pools using photoconversion of styryl dyes. J. Vis. Exp. , (2010).
  61. Schikorski, T. Monitoring rapid endocytosis in the electron microscope via photoconversion of vesicles fluorescently labeled with FM1-43. Methods Mol. Biol. 657, 329-346 (2010).
  62. Hoopmann, P., Rizzoli, S. O., Betz, W. J. FM dye photoconversion for visualizing synaptic vesicles by electron microscopy. Cold Spring Harb. Protoc. 2012, 84-86 (2012).
  63. Schote, U., Seelig, J. Interaction of the neuronal marker dye FM1-43 with lipid membranes. Thermodynamics and lipid ordering. Biochim. Biophys. Acta. 1415, 135-146 (1998).
  64. Harata, N. C., Aravanis, A. M., Tsien, R. W. Kiss-and-run and full-collapse fusion as modes of exo-endocytosis in neurosecretion. J. Neurochem. 97, 1546-1570 (2006).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

FM kleurstofbeeldvormingopgewekte synaptische activiteitspontane synaptische activiteitminiature synaptische gebeurtenissenmembraanomzetingsanalysefotoblekingbeoordelinggekweekte hippocampale neuronenstyryl FM kleurstoffenendocytose van synaptische blaasjes

Gerelateerde artikelen