MR kanker moleculaire beeldvorming aantonen met een kleine peptide gerichte MRI-contrastmiddel specifiek voor clotted plasma-eiwitten in tumor stroma in een muizen prostaatkanker model.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
MR Molecular imaging van prostaatkanker met een kleine moleculaire CLT1 Peptide Gerichte contrastmiddel
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Tumor extracellulaire matrix overvloed aan kanker gerelateerde eiwitten die kunnen worden gebruikt als biomarkers voor kanker moleculaire beeldvorming. In dit werk hebben we aangetoond effectief MR kanker moleculaire beeldvorming met een kleine moleculaire peptide gerichte Gd-DOTA monoamide complex als een gerichte MRI-contrastmiddel specifiek voor clotted plasma-eiwitten in de tumor stroma. We voerden het experiment van de doeltreffendheid van het middel voor niet-invasieve detectie van prostate tumor met MRI in een muis orthotope PC-3 prostaatkanker model. De beoogde contrastmiddel effectief was aanzienlijke verbetering tumor contrast produceren tegen een lage dosis van 0,03 mmol Gd / kg. De peptide gerichte MRI-contrastmiddel is veelbelovend voor MR moleculaire beeldvorming van de prostaat tumor.
Inleiding
Effectieve beeldvorming van kanker-gerelateerde moleculaire doelen is van groot belang om de nauwkeurigheid van vroegere opsporing en diagnose van kanker te verbeteren. Magnetic resonance imaging (MRI) is een krachtige klinische beeldvormende modaliteit met een hoge ruimtelijke resolutie en geen ionisatie straling 1. Er zijn echter geen gerichte contrastmiddel is beschikbaar voor klinische MR kanker moleculaire beeldvorming. Innovatief ontwerp en de ontwikkeling van gerichte MRI-contrastmiddelen zou in grote mate bij de toepassing van MR kanker moleculaire beeldvorming. Aanzienlijke inspanningen geleverd om gerichte contrastmiddelen voor MRI van de biomarkers op het oppervlak van kankercellen. Door de relatief lage gevoeligheid van MRI en lage concentratie van deze biomarkers, het is een uitdaging om voldoende contrast enhancement te genereren voor een effectieve MR moleculaire beeldvorming met behulp van kleine moleculaire gerichte contrastmiddelen 2,3. Om voldoende versterking te verkrijgen, verschillende afgiftesystemen such als liposomen, nanodeeltjes en polymeerconjugaten met een hoog laadvermogen van paramagnetische Gd (III) chelaten zijn opgesteld om de lokale concentratie van contrastmiddelen verhogen op het doel plaatsen 4,5. Hoewel deze systemen konden significante tumor verbetering in diermodellen genereren hun grote afmetingen resulteerde in langzame en onvolledige verwijdering uit het lichaam, waardoor langdurige accumulatie van toxische Gd (III)-ionen, wat kan leiden tot ernstige veiligheidsproblemen 6. Onlangs hebben sommige studies aangetoond dat de beperkingen van MRI voor moleculaire beeldvorming kan worden overwonnen door selectie van de juiste moleculaire biomarkers met hoge lokale expressie in de laesies en met kleine moleculaire middelen die gemakkelijk kunnen worden uitgescheiden 7,8. Het belangrijkste kenmerk van deze middelen is dat ze gericht moleculaire merkers overvloedig aanwezig is in de aangetaste weefsels met weinig aanwezigheid in normale weefsels. Een hoge concentratie contrastmiddelen kunnen binden aan deze doelstellingen, resulterend in voldoendedoende contrast enhancement voor een effectieve MR moleculaire beeldvorming. Omdat de afmetingen ervan kleiner dan de renale filtratie drempel kan ongebonden contrastmiddelen gemakkelijk worden uitgescheiden uit het lichaam met verminderde achtergrondruis. We hebben een universele kanker-gerelateerde biomarker, clotted plasma-eiwitten, die overvloedig aanwezig in tumorstroma geselecteerd, en zijn zelden aanwezig in normale weefsels 9. We gesynthetiseerd gerichte contrastmiddel met een kleine gericht peptide CGLIIQKNEC (CLT1), die een sterke specifieke binding aan de PC3 prostaat tumormodel 10, en vier Gd-DOTA monoamide chelaten toonde. Hier bieden we een methodologie voor MR kanker moleculaire beeldvorming om tumoren op te sporen bij muizen.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
Protocol aangepast van een voorafgaande studie 11.
1. Vervoeging van Gd-DOTA naar CLT1 Peptide
- Met behulp van standaard vaste fase peptidesynthese, synthetiseren CLT1 peptide (CGLIIQKNEC) van Fmoc-beschermde aminozuren op een 2-chloortritylchloridehars (1,0 mmol).
- Na toevoeging laatste aminozuur, gecycliseerd het lineaire peptide op hars met thallium (III) trifluoracetaat (1,09 g, 2,0 mmol, 2 equivalenten) in DMF (20 ml) bij 0 ° C gedurende 2 uur.
- Vervolgens conjugaat PEG en lysine achtereenvolgens aan de N-terminus van CLT1 peptide (1,0 mmol) van hars door reactie met achtereenvolgens Fmoc-NH-PEG-COOH (3,0 mmol), Fmoc-Lys (Fmoc)-OH (3.0 mmol) en een tweede partij van Fmoc-Lys (Fmoc)-OH (6 mmol).
- Verwijder Fmoc met piperidine. Add DOTA-tris (t-Bu) (4,58 g, 8,0 mmol, 2 equivalenten aan elke aminogroep) reageren met de vier vrije aminen van de lysine dendrimeer op de hars gedurende 2 uur.
- Tot slot, klieven en bescherming te ontdoen van het productvan de hars door behandeling met een cocktail van trifluorazijnzuur, water en triisobutylsilane (TIS) (20 ml, 95/2.5/2.5) gedurende 8 uur bij kamertemperatuur. Verwijder de hars door filtratie gevolgd door wassen met trifluorazijnzuur (TFA). Voeg de gecombineerde filtraten druppelsgewijs koude ethylether (200 ml), centrifuge, en wassen met ethylether 4x. Droog onder vacuüm om een kleurloze vaste stof (1,99 g, 61% opbrengst).
- Zuiver het ruwe product met preparatieve HPLC met een gradiënt van 0-40% oplosmiddel B (0.1% TFA in acetonitril) in oplosmiddel A (0,1% TFA waterige oplossing) gedurende 20 min en 40-90% oplosmiddel B in oplosmiddel A gedurende 10 minuten .
- Los CLT1-dl-(DOTA) 4 (250 mg, 0.077 mmol) in gedeïoniseerd water (15 ml) en op pH 6 met 1 M NaOH. Voeg Gd (OAc) 3 0,4 H2O (472 mg, 0.462 mmol, 1,5 equivalenten aan DOTA monoamide) in porties aan de oplossing, terwijl de pH op 6 met 1 M NaOH. Roer de reactie-oplossing bij kamertemperatuur gedurende 48 uur.
- Complexer de resterende Gd (III) met ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) (90 mg, 0,31 mmol), en zuiver het ruwe product met een grootte-uitsluiting het eindproduct CLT1-dl-(Gd-DOTA) 4 (169 mg, 57%).
2. Karakterisering van Contraststoffen
- Meet Gd (III) tevreden met inductief gekoppeld plasma-optische emissie spectroscopie.
- Acquire matrix-geassisteerde laser desorptie / ionisatie time-of-flight (MALDI-TOF) massaspectra lineaire modus met 2,5-dihydroxybenzoëzuur (2,5-DHB) als matrix.
- Meet relaxatietijden van de waterige oplossing van de contrastmiddelen van CLT1-dl-(Gd-DOTA) 4 en een nontargeted controlestof sCLT1-dl-(Gd-DOTA) 4 in verschillende concentraties op 60 MHz (1,5 T) met een relaxometer bij 37 ° C. Gebruik een inversie-recovery pulssequentiewaarde T 1 en een Carr-Purcell-Meiboom-Gill sequence meten met 500 echo's naar T 2 te meten. Bereken T 1 en T 2 relaxiviteiten van the agenten van de hellingen van de percelen van 1 / T 1 en 1 / T 2 versus de Gd concentraties.
3. Cel Cultuur en Ontwikkeling van Animal Model met Orthotope PC3 Prostaat Tumor
- Cultuur PC3-prostaatkankercellen met constitutieve expressie van groene fluorescentie eiwit (GFP) in RPMI medium aangevuld met 5% foetaal runderserum en penicilline / streptomycine / fungizone, oogst door trypsine en resuspendeer in dichtheid van 2,5 x 10 4 cellen / ul PBS.
- Handhaaf mannelijke NIH athymische naakt muizen (4-5 weken oud) bij de Athymische Animal Core Facility, Case Western Reserve University (CWRU) volgens een dier protocol door de CWRU Institutional Animal Care en gebruik Comite.
- De chirurgische vlakken werden besproeid met 2% chloorhexidine-oplossing en vervolgens bedekt met absorberende doeken. Steriele chirurgische handschoenen werden gedragen tijdens de procedure. Voor dier chirurgie, ip geïnjecteerd Avertin (250 mg / kg) aan anesthetize de muizen. Als alternatief kan ketamine / xylazine / acepromazine worden gebruikt bij een concentratie van 50/5/1 mg / kg. Ofthalmische zalf werd aangebracht op de muis om voldoende vocht tijdens de anesthesie te handhaven.
- Start de operatie door het snijden van een kleine incisie door de huid en het buikvlies langs de onderste middellijn bij een lengte van ongeveer 1 cm met een steriele scalpel. Een steriele chirurgische laken werd rond de incisie die tijdens survival operaties.
- Voorzichtig exterioriseren en stabiliseren de prostaat dorsale lobben aan de prostaat bloot te leggen. De suspensie injecteren van PC3-GFP cellen in PBS (20 pl) in de prostaat met een naald van 30 gauge. Tenslotte sluit de incisie met gewikkelde Autoclip 12.
- Voor post-procedure monitoring, bewaken dieren tweemaal per dag gedurende 1 week. Tekenen van ziekte zijn gebrek aan eten, donkere urine verzamelen rond urethra, en onvaste gang die infectie of occlusie van de blaas kunnen worden aangegeven in de nietjes.
- Na 10 dagen, te verwijderen thij nietjes met een ontnieter. Controleer de dieren dagelijks tumorgrootte en enig bewijs van pijn zoals gewichtsverlies, gedrags-afwijkingen en motorische gebreken beoordelen. Euthanaseren van de dieren die een tumorgrootte groter dan het ethisch toegestane limiet of het bewijs van pijn tijdens tumorgroei toonde.
4. Bevestiging van Tumor Binding Specificiteit van de peptiden met fluorescentie beeldvorming en histologie
- Na tumorcel inoculatie, zodat ongeveer 4 weken van tumorgroei voor het begin van de beeldvorming. Vóór injectie van het peptide probes verwerven GFP fluorescentie beelden met levende muizen op een fluorescentie imager de aanwezigheid van tumor controleren.
- Iv injecteren Texas rood gemerkte peptiden aan de tumor dragende muizen in een dosis van 10 nmol / muis.
- Offer de muizen 2 uur later door cervicale dislocatie, het verzamelen van de tumor en de belangrijkste organen, en meteen beeld op een fluorescentie imager. Gebruik groen licht filters voor GFP (excitatie: 444-490 nm, emissie: 515 nm lange pass filter, de verwerving instellingen: 500-720 in 10 nm stappen) en rood licht filters voor Texas Red (excitatie: 576-621 nm, emissie: 635 nm lange pass filter, de verwerving instellingen: 630-800 in 10 nm stappen). 10 msec belichtingstijd voor GFP en 150 msec voor Texas Red.
- Onmiddellijk na het meten van hele weefsel fluorescentie, verzamel tumor weefsel, vast met formaline en cryosection in 5-micrometer plakjes.
- Na spoelen met PBS, monteren met 1 druppel montage medium met 4 ',6-diamidino-2-fenylindool (DAPI), foto onmiddellijk op een confocale laser scanning microscoop.
5. Magnetic Resonance Imaging (MRI)
- Ongeveer 4 weken na tumorcelinoculatie, zodat de tumoren groeien tot 0,3-0,6 cm in diameter. Gebruik een 7 T MRI scanner met een volume radiofrequentie (RF) spoel voor MRI onderzoek.
- Verdoven van de muis met een 2% isofluraan-zuurstof mengsel in een isofluraan inductie kamer. OPHthalmic zalf werd aangebracht op de muis om voldoende vocht tijdens de anesthesie te handhaven.
- Steek een 30 gauge naald in een 1,0 m lange buis gevuld met gehepariniseerde zoutoplossing. Plaats de self-made katheter in de muis staart ader.
- Plaats de muis in de magneet en houdt onder inhalatie-anesthesie met 1,5% isofluraan en zuurstof via een neuskegel.
- Plaats een respiratoire sensor aangesloten op een systeem van toezicht op de buik om snelheid en diepte van de ademhaling te controleren. Houd de lichaamstemperatuur op 37 ° C door het blazen van hete lucht in de magneet via een teruggekoppeld regelsysteem.
- Begin met sagittale doorsnede beelden met behulp van een lokaliserend volgorde om de tumor locatie (TR / TE = 200/3.7 msec, FOV = identificeren 3,0 cm, slice dikte = 2,2 mm, slice nummer = 16, gemiddelde = 2, flip hoek = 45 °, matrix = 128 x 128).
- Gebruik een 2D T1-gewogen gradiënt vet onderdrukking volgorde om 2D axiale beelden voor CE-MRI (TR / TE = 151.2/1.9 msec, FOV = 3,0 cm x 3,0 cm, verwerven sluizen dikte = 1,2 mm, slice nummer = 12, gemiddelde = 1, flip hoek = 80 °, matrix = 128 x 128).
- Na pre-injectie beeld basislijn MR verwerving begint de beoogde middel of middel voor het regelen injecteren in een dosis van 0,03 mmol Gd / kg door spoelen met 200 pl zoutoplossing.
- Doorgaan naar CE-MRI-beelden te verwerven op verschillende tijdstippen voor maximaal 30 minuten.
6. Beeldverwerking en analyse
- Gebruik imaging software voor beeldanalyse.
- Teken de gebieden van belang (ROI) over de gehele tumor en de nieren in de tweedimensionale beeldvlak en meet de gemiddelde signaalintensiteit.
- Om de CE-MRI data te kwantificeren, meten tumor of nier contrast enhancement (ΔSNR) door berekening van de stijging van de post-contrast SNR dan pre-contrast SNR met behulp van de volgende vergelijking: ΔSNR = (S t / σ t) - (S 0 / σ 0), waarbij S 0 en S t geven het signaal in de tumof of de nieren voor en na contrast en σ 0 en σ t zijn de standaardafwijking gemeten ruis van de achtergrond lucht voor en na contrast.
- Bereken de p-waarden met behulp van twee-tailed t-test van de student, uitgaande van statistische significantie bij p <0,05.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
Figuur 1 toont de synthese van de gerichte contrastmiddel CLT1-dl-(Gd-DOTA) 4 en de algemene opzet van het experiment. CLT1-dl-(Gd-DOTA) 4 shows veel hoger relaxatie dan klinische Gd-DOTA (tabel 1). Op 1,5 T, de T1 relaxiviteit per gadolinium van CLT1-dl-(Gd-DOTA) 4 in PBS (pH 7,4) is ongeveer 3 maal hoger dan die van Gd-DOTA 10. Maestro beeldvorming bevestigt de sterke specifieke binding van met Texas rood gemerkte CLT1 (CLT1-TR) naar tumor met wei...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
Kritische stappen
Selectie van de juiste Biomarker en Targeting Kleine Peptide
Met succes te ontwikkelen een gerichte contrastmiddel met kleine grootte, moet twee belangrijke punten te worden beschouwd. Ten eerste is het belangrijk om een goede moleculaire biomarkers die overvloedig aanwezig in zieke weefsels met weinig aanwezigheid in normale weefsels te selecteren. Onze geselecteerde kanker-gerelateerde biomarker, clotted plasma-eiwitten, voldoe...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
Geen belangenconflicten verklaard.
Dankbetuigingen
Dit werk wordt mede ondersteund door de American Heart Association GRA Lente 09 Postdoctoraal Fellowship (09POST2250268) en het NIH R01 CA097465. We waarderen ten zeerste Dr Wen Li en Dr Vikas Gulani voor MRI-protocol testen en setup, en mevrouw Yvonne Parker voor haar hulp op tumorimplantatie.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| REAGENTS | |||
| Fmoc beschermde aminozuren | EMD Chemicals Inc | ||
| DOTA-tris(t-Bu) | TCI America | ||
| PyBOP, HOBt, HBTU | Nova Biochem | ||
| DIPEA, Thallium(III) trifluoracetaat, TIS | Sigma-Aldrich Corp. | ||
| Texas Red, succinimide-ester, enkele isomeer | Invitrogen | T20175 | |
| EQUIPMENTS | |||
| Agilent 1100 HPLC-systeem | Agilent | ||
| ZORBAX 300SB-C18 PrepHT-kolom | Agilent | ||
| ICP-–S Optima 3100XL | Perkin-Elmer | ||
| MALDI-TOF-massaspectrometer | Bruker | AutoflexTM Speed | |
| Maestro FLEX In Vivo Beeldvormingssysteem | Cambridge Research Instrumentation, Inc. | ||
| Biospec 7T MRI-scanner | Bruker |
Referenties
- Brown, M. A., Semelka, R. C. MRI Basic Principles and Applications. , 3rd, John Wiley & Sons, Inc. Hoboken, New Jersey. (2003).
- Artemov, D. Molecular magnetic resonance imaging with targeted contrast agents. J. Cell. Biochem. 90, 518-524 (2003).
- Kalber, T. L., Kamaly, N., et al. A low molecular weight folate receptor targeted contrast agent for magnetic resonance tumor imaging. Mol. Imaging Biol. 13, 653-662 (2011).
- Schmieder, A. H., Winter, P. M., et al. Molecular MR imaging of melanoma angiogenesis with alphanubeta3-targeted paramagnetic nanoparticles. Magn. Reson. Med. 53, 621-627 (2005).
- Mulder, W. J., Strijkers, G. J., et al. MR molecular imaging and fluorescence microscopy for identification of activated tumor endothelium using a bimodal lipidic nanoparticle. FASEB J. 19, 2008-2010 (2005).
- Wang, S. J., Brechbiel, M., Wiener, E. C. Characteristics of a new MRI contrast agent prepared from polypropyleneimine dendrimers, generation 2. Invest. Radiol. 38, 662-668 (2003).
- Amirbekian, V., Aguinaldo, J. G., et al. Atherosclerosis and matrix metalloproteinases: experimental molecular MR imaging in vivo. Radiology. 251, 429-438 (2009).
- Overoye-Chan, K., Koerner, S., et al. EP-2104R: a fibrin-specific gadolinium-Based MRI contrast agent for detection of thrombus. J. Am. Chem. Soc. 130, 6025-6039 (2008).
- Pilch, J., Brown, D. M., et al. Peptides selected for binding to clotted plasma accumulate in tumor stroma and wounds. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 103, 2800-2804 (2006).
- Rohrer, M., Bauer, H., Mintorovitch, J., Requardt, M., Weinmann, H. J. Comparison of magnetic properties of MRI contrast media solutions at different magnetic field strengths. Invest. Radiol. 40, 715-724 (2005).
- Wu, X., Burden-Gulley, S. M., et al. Synthesis and evaluation of a peptide targeted small molecular Gd-DOTA monoamide conjugate for MR molecular imaging of prostate cancer. Bioconjugate Chem. 23, 1548-1556 (2012).
- Burden-Gulley, S. M., Gates, T. J., et al. A novel molecular diagnostic of glioblastomas: detection of an extracellular fragment of protein tyrosine phosphatase mu. Neoplasia. 12, 305-316 (2010).
- McBride, J. D., Birgit, H., Leatherbarrow, R. J. Resin-coupled cyclic peptides as proteinase inhibitors. Protein and Peptide. 3 (3), 193-198 (1996).
- Cline, D. J., Thorpe, C., Schneider, J. P. General method for facile intramolecular disulfide formation in synthetic peptides. Anal. Biochem. 335 (1), 168-170 (2004).
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
