Methodenartikel

Cel dood in verband met abnormale Mitosis Waargenomen door confocale Imaging Live kankercellen

14.9K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/50568

⸱

21 augustus 2013

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Cancer Research Center, Sheba Medical Center, 2The Neufeld Cardiac Research Institute, Tel-Aviv University, 3Department of Physiology and Pharmacology, Tel-Aviv University, 4Imaging Unit, Sackler Faculty of Medicine, Tel-Aviv University, 5Biotechnology and Cell Signaling, Ecole Superieure de Biotechnologie Strasbourg, 6Department of Human Molecular Genetics and Biochemistry, Tel-Aviv University

In dit artikel

Samenvatting

De cytotoxische activiteit van de fenanthridine PJ-34 in kankercellen ondergaan mitose werd in real time gedocumenteerd door levende confocale beeldvorming. PJ-34 uitgeroeide menselijke borstkanker MDA-MB-231 cellen die extra-centrosomes in mitose. In tegenstelling tot normale bifocale mitose, werden de extra-centrosomes niet geclusterd in de twee polen spil in aanwezigheid van PJ-34.

Samenvatting

Fenantreen derivaten die als krachtige PARP1 remmers voorkomen de bifocale clustering van boventallige centrosomes in multi-centrosomal menselijke kankercellen in de mitose. De phenanthridine PJ-34 was de meest potente molecule. Ontclustering van extra-centrosomes veroorzaakt mitotische falen en celdood in multi-centrosomal cellen. Meest solide menselijke kankers hebben hoge voorkomen van extra-centrosomes. De activiteit van PJ-34 werd in real-time gedocumenteerd door confocale beeldvorming van levende menselijke borstkanker MDA-MB-231-cellen getransfecteerd met vectoren die coderen voor fluorescente γ-tubuline, dat veel voorkomt in de centrosomes en fluorescerende histone H2b aanwezig de chromosomen. Afwijkende chromosomen regelingen en de-geclusterde γ-tubuline foci die declustered centrosomes werden gedetecteerd in de getransfecteerde MDA-MB-231-cellen na behandeling met PJ-34. Un-geclusterde extra-centrosomes in de twee polen spindel voorafgegaan hun celdood. Deze resultaten gekoppeld for het eerst onlangs ontdekt exclusieve cytotoxische activiteit van PJ-34 in humane kankercellen met extra centrosomes de-clustering in mitose en mitotische storing die tot celdood. Volgens eerdere bevindingen waargenomen door confocale beeldvorming van vaste cellen, PJ-34 uitsluitend uitgeroeid kankercellen met multi-centrosomes zonder afbreuk normale cellen ondergaan mitose met twee centrosomes en bi-focale spindels. Deze cytotoxische activiteit van PJ-34 werd niet gedeeld door andere krachtige PARP1 remmers, en werd waargenomen in PARP1 deficiënte MEF herbergen extracentrosomes, suggereert haar onafhankelijkheid van PARP1 remming. Wonen confocale beeldvorming bood een nuttig instrument voor het identificeren van nieuwe moleculen uitroeien van cellen tijdens mitose.

Inleiding

Fenantreen afgeleid PARP1 remmers, waaronder PJ-34, werden ontworpen om latente cellen van apoptotische celdood geïnduceerd door de energieverbruikende PARP1 gemedieerde DNA-reparatie onder stress-omstandigheden (beroerte of myocardinfarct) te beschermen 1. Echter, recent ontdekten we dat PJ-34, twee keer hogere concentratie dan dat inducerende PARP1 remming, kan uitsluitend leiden tot celdood in menselijke kankercellen 2,3. De snellere van de proliferatie van de cel was, hoe efficiënter de uitroeiing van de cellen was. De cytotoxische activiteit van de PJ-34 werd toegeschreven aan extra-centrosomes de-clustering in mitose 2. Veel menselijke kankercellen haven multicentrosomes 4,5. Incubatie van menselijke borstkankercellen MDA-MB-231, die boventallige centrosomen haven, met 20 uM PJ-34 efficiënt uitgeroeid deze cellen binnen 72-96 uur zonder afbreuk rustende cellen of een goedaardige delende cellen die twee centrosomes in mitose 2,3. Goedaardige cellen opgenomen menselijke mammaire epitheelcellen MCF-10, menselijke endotheelcellen (HUVEC) en primaire mesenchymale cellen bereid uit humane thymus. Deze cellen waren resistent voor de cytotoxische activiteit van PJ-34. PJ-34 niet bemoeien met hun celcyclus gedurende 96 uur incubatie of invloed op hun centrosomes en bi-focale spindel vorming van 2,3.

Bipolaire centrosome montage is cruciaal voor bipolaire vorming spil in mitose 4,5. Daarom hebben cellen met meer dan twee centrosomes een nauwelijks begrepen moleculaire mechanisme ontwikkeld clustering hun extra centrosomes tweepolig 4-9. Falen van een bipolaire assemblage van hun centrosomes kan multipolaire vervormde spindels en afwijkende chromosomen segregatie dat de arrestaties de cel-cyclus in de G2 / M arrestatie, en leidt tot celdood toegeschreven aan mitotische mislukking 4,5 veroorzaken. De moleculaire mechanismen die ten grondslag liggen aan extra-centrosomes de-clustering worden intensief onderzocht 10. Inzicht in dit mechanisme dood zal exclusieve uitroeiing van kankercellen in staat stellen terwijl sparen gezonde weefsels 5,10.

Aldus verbindingen die mitotische catastrofe celdood activeren bieden een nieuwe manier van een selectieve kankertherapie, die efficiënt kan in een breed spectrum van menselijke vaste cancers.Our resultaten suggereren dat confocale beeldvorming kan worden gebruikt om moleculen die extra-centrosomes clustering worden geïdentificeerd mitose 2,3, waardoor deze verbindingen kanker targeting kandidaat-geneesmiddelen.

We hebben de cytotoxische activiteit van de fenanthridine PJ-34 gedocumenteerd door het scannen van vaste en levende menselijke kankercellen (met een hoog voorkomen van extra-centrosomes in mitose) versus normale cellen. Een stapsgewijze beschrijving van de beeldvormende procedures voor de cytotoxische activiteit van PJ-34 in menselijke kankercellen te identificeren is hieronder opgenomen.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

1. Cel Cultuur Voorbereiding

MDA-MB-231-cellen werden gekocht bij ATCC (American Type Culture Collection) en opgeslagen in vloeibare stikstof.

  1. Seed 10 6 MDA-MB-231-cellen in 92 mm Petri-schaal in 10 ml compleet medium bevattende Dulbeco Modified Eagle Medium (DMEM), 10% paardenserum, 1% L-glutamine en 1% Penstrep-Amfotericine B. Laat cellen te prolifereren tot 80-100% confluentie.
  2. Verwijder kweekmedium uit schotel en gooi.
  3. Spoel even de cellaag met 0,25% (w / v) Trypsine-EDTA-oplossing om alle sporen van serum te verwijderen.
  4. Voeg 2,0 ml trypsine-EDTA-oplossing voor te schotelen en te observeren cellen door omgekeerde microscoop totdat cellaag wordt verspreid (meestal binnen 5 tot 15 min).
  5. Voeg 18 ml compleet groeimedium Zuig de cellen door pipet. Transfer naar een buis.
  6. Centrifugeer de celsuspensie bij 1200 rpm.
  7. Resuspendeer de cel pellet in 24 ml culture medium.
  8. Voeg 2 ml celsuspensie tot 35 mm glazen bodem gerechten (ongeveer 25% confluentie) en plaats in de incubator (5% CO 2, 37 ° C).
  9. Oplossingen:
    1. Compleet Medium voor celproliferatie: DMEM met 10% FBS, 1% antibiotica (100 eenheden / ml penicilline G, 100 ug / ml streptomycine, Pen-Strep-Ampho oplossing) en 2 mM L-glutamine.
    2. Trypsine-EDTA-oplossing die 0,25% trypsine-EDTA.
  10. Gerechten:
    92 mm diameter petrischalen.
    35 mm diameter poly-D-lysine gecoate glazen bodem cultuur gerechten.

2. Voorbereiding van de Cellen voor Live confocale Imaging

  1. Zaad 2 x 10 5 MDA-MB-231 cellen in glazen bodem cultuur gerechten in 2 ml compleet medium zoals vermeld in paragraaf 1. Wanneer celcultuur samenvloeiing van 60-70% (ongeveer 3-4 x 10 5 cellen per schaaltje) bereikt, verder met transfectie.
  2. Transfecteren de cellen met twee plasmiden encoding van de fusie-eiwitten γ-tubuline-GFP (voor fluorescentie detectie van centrosomes) en histon-RED (H2b-RED, voor fluorescerende detectie van chromosomen) met behulp van de liposomaal transfectiereagens Jet-PI, na de vervaardiging protocol. Kort mix 2 ug van elk plasmide in een buis met 100 ul NaCl (150 mM). Meng de transfectie reagens (100 pl) met 100 ul NaCl (150 mM) in een tweede buis en incubeer 5 min bij kamertemperatuur (RT). Dan combineer de twee oplossingen, mix (met een milde vortex) en spin-down. Incubeer gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur.
  3. Tijdens de incubatie van de transfectie mengsel, was de cellen eenmaal met PBS en vervang het celmedium met 2 ml warm DMEM zonder supplementen (37 ° C).
  4. Voorzichtig voeg de transfectie aan de cellen in DMEM en vervolgens terug de cellen aan de incubator (37 ° C, 5% CO2) gedurende 8 uur.
  5. Na 8 uur incubatie vervangen DMEM met 2 ml compleet medium en incubeer de cellen in de incubator gedurende 24hr.
  6. 24 uur na transfectie vervangen medium van de cellen met 2 ml compleet medium dat 20 uM PJ-34.
  7. Incubeer de cellen gedurende nog 18 uur (37 ° C, 5% CO2).
  8. Behoudens de cellen confocale beeldweergave ten minste 16 uur in beeldkamer houden van de cellen in 5% CO2 en 37 ° C.
  9. Parallel, onderzoekt transfectie werkzaamheid 36 uur na transfectie met behulp van fluorescentie microscopie als volgt:
    1. Seed 2 x 10 5 MDA-MB-231 cellen in 6-wells plaat met 1 dekglaasje per putje in 2 ml compleet medium.
    2. Transfecteren de cellen zoals vermeld in paragrafen 2.2-2.5.
    3. 36 uur na transfectie stellen de getransfecteerde cellen gemonteerd op een dekglaasje door incubatie in koude methanol: aceton (1:1) oplossing, 7 min, -20 ° C.
    4. Zuig het fixatie-oplossing en laat het dekglaasje met de gemonteerde cellen te drogen in een chemische kap.
    5. Solliciteer ProLong Gold antifade reagens met DAPI en laat stee dekglaasje te drogen in het donker gedurende 6 uur.
    6. Onderzoek de schuif onder fluorescentiemicroscoop en bereken het percentage van de getransfecteerde cellen (rode en groene signalen) van de totale populatie van cellen (DNA kleuring door DAPI). De gewenste transfectie levert dat ongeveer 20-40% bij 100-200 cellen geteld.

3. Technische parameters van de Live confocale Imaging Scanner Instellingen

  1. ScanMode xyzt; Pinhole [luchtige] 1.00; Zoom 3,5; Resolutie 8 bits; Laser DPSS 561 nm; Argon, zichtbare laser 488 nm; Laser Hij / Ne zichtbaar 633 nm; Doelstelling HCX PL APO CS 63X 1,40 OIL UV; Numerieke diafragma 1.4; Scan snelheid 700 Hz; Brekingsindex 1.52.
  2. Afbeelding 3-D presentatie werden bereid door Imaris imaging software 7.0.

4. Confocale Imaging van mitose in vaste cellen

  1. Zaad 2 x 10 5 MDA-MB-231 borstkankercellen (ATCC), normale muis embryonale fibroblasten (MEF), of PARP1 gebrekkige MEF (PARP - / -, bereid door Dr Francoise Dantzer) op glazen dekglaasjes in 6-well plaat in 2 ml compleet medium. Dekglaasjes werden gewassen met 96% ethanol, gevolgd door wassen met steriel DD water, gedroogd gedurende 2 uur, en geplaatst in elk putje van de 6-well schotel.
  2. Voeg PJ-34 (10-30 uM) aan het medium en incubeer de cellen gedurende de vereiste periode (meestal maximaal 96 uur).
  3. Was de dekglaasjes eenmaal met PBS (fosfaat gebufferde zoutoplossing), en zet de cellen middels incubatie in ijs-koude methanol: aceton (1:1) oplossing, 7 min, -20 ° C.
  4. Zuig het fixatie-oplossing en laat de dekglaasjes te drogen in chemische hood (in dit stadium, de dekglaasjes worden op -20 ° C gedurende enkele weken bewaard).
  5. Was de dekglaasjes eenmaal met PBST (PBS aangevuld met 0,1% Tween-20) aan de celmembranen doorlaatbaar en blokkeren de cellen met 10% NDS (normaal Ezel Serum) in PBST (blokkerende oplossing) gedurende 1 uur bij kamertemperatuur.
  6. Incubeer de gepermeabiliseerde vaste cellen met primaire antibodies gedurende 2 uur bij kamertemperatuur (voor spillen centrosomes kleuring). De antilichamen worden verdund in de blockingbuffer als volgt: anti-α tubuline (1:250 verdunning) en anti-γ tubuline (1:200 verdunning). Primaire antilichamen worden als volgt toegepast: toepassing 100 pl (een druppel) van een mengsel van de antilichamen in blokkerende oplossing per dekglaasje op 6-plaatafdekking (het deksel ondersteboven). Voorzichtig zet de dekglaasje op de antilichamen druppel, gezaaide cellen tegenover de druppel. Incubeer de dekglaasjes naar de antilichamen gedurende 2 uur bij kamertemperatuur geroerd.
  7. Plaats de dekglaasjes terug in de putjes en spoel de cellen 3 maal met PBST. Maak dan gebruik van dezelfde procedure in 4.6 beschreven voor het labelen van cellen op de dekglaasjes met de fluorescerende secundaire antilichamen. Incubeer de cellen op dekglaasjes met de secundaire antilichamen gedurende 1 uur, kamertemperatuur, in het donker. De antilichamen worden verdund in het blokkeren van oplossing als volgt: Alexa Fluor 488 (1:1000 verdunning, groen) en Alexa Fluor 568 (1:1000 verdunning;red).
  8. Monteer de dekglaasjes met ProLong Gold antifade reagens met DAPI (voor chromosomen kleuring) en incubeer overnacht bij kamertemperatuur in het donker te drogen.
  9. Onderzoekt de dekglaasjes door confocale microscopie.

5. Levensvatbaarheid van de cellen gemeten door ATP Production

ATP productie wordt gemeten door een luminescerende ATP detectietest kit.

  1. Zaad de cellen in 96-well plaat, ongeveer 20.000 cellen in 800 ul medium in elk putje. Drie blanco's moeten worden gebruikt voor de bepaling van de achtergrond luminescentie van het medium.
  2. Bereid ATP standaard verdunningsreeks van ongeveer 10 uM tot 100 uM en blijf op ijs.
  3. Voeg 50 ul van detergent aan elk putje en schud de plaat gedurende 5 min in orbitaalschudder, 700 rpm.
  4. Elke injectieflacon van de 'gevriesdroogde substraat' met 5 ml 'substraatbuffer' in de kit.
  5. Voeg 50 ul van de bereide substraatoplossing aan de putjes en schudde plaat gedurende 5 minuten op orbitaalschudder, 700 rpm.
  6. Houd de plaat in het donker gedurende 10 minuten.
  7. Meet luminescentiesignalen van elk putje met ELISA microplaatlezer.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

PJ-34 is een stabiele water oplosbare fenantridine 1 (figuur 1). Onze eerdere resultaten lieten celdood en de-geclusterde extra-centrosomes in verschillende soorten vaste multi-centrosomal kankercellen die behandeld werden met PJ-34. Daarentegen werden de normale delende cellen niet aangetast 2,3. Centrosomes werden geïdentificeerd door dubbele etikettering met antilichamen gericht tegen centrine1 en γ-tubuline in de vaste extra-centrosomal cellen 2.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

Wonen confocale beeldvorming voorzien van een real-time documentatie van het cytotoxische effect van PJ-34 in levende multi-centrosomal cellen tijdens mitose (Figuur 3 en aanvullende informatie). Dit was de eerste levende documentatie toeschrijven de cytotoxiciteit van PJ-34 in menselijke kankercellen extra centrosomes de-clustering en celdood, suggereert inductie van mitotische catastrofe celdood door PJ-34 5-9. Daarentegen werd bifocale clustering van super-numerary centrosomes waargenomen ...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs verklaren dat zij geen concurrerende financiële belangen.

Dankbetuigingen

Financieringsbronnen van dit onderzoek: een gezamenlijk fonds van de Universiteit van Tel Aviv overdracht van technologie bedrijf, RAMOT en het Sheba Medical Center (M. CA en SI.), ICRF - Israëlische Cancer Research Foundation (M. CA.) En Israel Science Foundation ( SI).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
REAGENTS
DMEMInvitrogen (GIBCO)41965 
FBS (Fetaal bovien Serum)Invitrogen (GIBCO)12657 
Pen-Strep-Ampho oplossingBiological Industries, Israel03-033-1B 
L-glutamineInvitrogen (GIBCO)25030-024 
0,25% Tripsin-EDTAInvitrogen (GIBCO)25200 
92 mm Petri schotelsNunc,Thermo scientific150350 
35 mm poly-D-lysine gecoate glazen bodem kweekschotelsMatTek Corporation, USAP35GC-0-14-C 
Luminescent ATP detectie assay kitAbcamab113849 
NDS (Normaal Donker Serum)Jackson ImmunoResearch017-000-121 
Anti α-tubulin antilichaamSigmaT90261:250 verdunning (IF)
Anti γ-tubulin antilichaamSigmaT51921:200 verdunning (IF)
Alexa Fluor 488 Goat Anti-Mouse IgGInvitrogenA-110171:1.000 verdunning (IF)
Alexa Fluor 568 Donkey Anti-Rabbit IgGInvitrogenA-100421:1.000 verdunning (IF)
ProLong Gold antifade reagens met DAPI (montage)InvitrogenP36935 
JetPEI (liposomale transfectie reagens)Polyplus101-10 
APPARATUUR
Confocale microscoopLeica (Mannheim, Duitsland)TCS SP5II 

Referenties

  1. Jagtap, P., et al. Novel phananthridine inhibitors of poly(adenosine 5'-diphosphate-ribose) synthetase: Potent cytoprotective and antishock agents. Crit. Care Med. 30, 1071-1082 (2002).
  2. Castiel, A., et al. A small molecule exclusively eradicates human cancer cells: Extra-centrosomes de-clustering agent. BMC Cancer. 11 (1), 412(2011).
  3. Inbar-Rozensal, D., et al. A selective eradication of human nonhereditary breast cancer cells by phenanthridine -derived polyADP-ribose polymerase inhibitors. Breast Cancer Res. 11 (6), R78(2009).
  4. Gergely, F., Basto, R. Multiple centrosomes: together they stand, divided they fall. Genes Dev. 22, 2291-2296 (2008).
  5. Godinho, S. A., Kwon, M., Pellman, D. Centrosomes and cancer: how cancer cells divide with too many centrosomes. Canc. Met. Rev. 28, 85-98 (2009).
  6. Doxsey, S. Re-evaluating centrosome function. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 2, 688-698 (2001).
  7. Walczak, C. E., Heald, R. Mechanisms of mitotic spindle assembly and function. International Rev. of Cytology. 265, 111-158 (2008).
  8. Ogden, A., Rida, P. C. G., Aneja, R. Let's huddle to prevent a muddle: centrosome declustering as an attractive anticancer strategy. Cell Death Differ. 19, 1255-1267 (2012).
  9. Kramer, A., Anderhub, S., Maier, B. Mechanisms and Consequences of centrosomes clustering in cancer cells. The Centrosome: Cell and Molecular mechanisms of functions and disfunctions in disease. Schatten, E. , Humana Press Springer. 255-277 (2012).
  10. Galimberti, F., et al. Anaphase Catastrophe Is a Target for Cancer Therapy. Clin. Cancer Res. 17, 1218-1222 (2011).
  11. Kanai, M., et al. Haploinsufficiency of poly(ADP-ribose) polymerase-1-mediated poly(ADP-ribosyl)ation for centrosome duplication. Biochem. Biophys. Res. Commun. 359, 426-430 (2007).
  12. Gartner, E. M., Burger, A. M., Lorusso, P. M. Poly(ADP-ribose) polymerase inhibitors: a novel drug class with a promising future. Cancer J. 16, 83-90 (2010).
  13. Wahlberg, E., et al. Family-wide chemical profiling and structural analysis of PARP and tankyrase inhibitors. Nature Biotechnology. 30, 283-288 (2012).
  14. Rouleau, M., Patel, A., Hendze, M. J., Kaufmann, S. H., Poirier, G. G. PARP inhibition: PARP1 and beyond. Nature Rev. Cancer. 10, 293-301 (2010).
  15. Leber, B., et al. Proteins Required for Centrosome Clustering in Cancer Cells. Sci. Transl. Med. 2 (33), 33-38 (2010).
  16. Kwon, M., et al. Mechanisms to suppress multipolar division in cancer cells with extra centrosomes. Gene Dev. 22, 2189-2203 (2008).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

PJ 34ontclustering van centrosomenlive confocale beeldvormingmitotisch falenceldood van kankercellengamma tubulinehiston H2bmulticentrosomale cellenPARP1 remmingMDA MB 231

Gerelateerde artikelen