Methodenartikel

Genetische Manipulatie in

18.2K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/50598

⸱

12 juli 2013

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Microbiology and Immunology, The Geisel School of Medicine at Dartmouth

In dit artikel

Samenvatting

Hier beschrijven we een werkwijze voor het gebruik van type I en type II Δku80 Stammen Toxoplasma gondii Om efficiënt genereren van gerichte gendeleties en gen vervangingen voor functionele genomische analyse.

Samenvatting

Gerichte genetische manipulatie met behulp van homologe recombinatie is de methode van keuze voor functionele genomische analyse van een gedetailleerde weergave van gen-functie en fenotype (s) te verkrijgen. De ontwikkeling van mutante stammen met gerichte gendeleties gerichte mutaties, aangevuld genfunctie en / of gelabeld genen biedt krachtige strategieën om genfunctie te pakken, met name als deze genetische manipulaties efficiënt kunnen worden gericht op het gen locus plaats middels integratie gemedieerd door dubbel cross over homologe recombinatie.

Vanwege de zeer hoge homologe recombinatie, functionele genomische analyse van Toxoplasma gondii is eerder beperkt door de afwezigheid van efficiënte werkwijzen voor het richten gendeleties en gen vervangingen specifieke genetische loci. Onlangs hebben we schafte de belangrijkste route van homologe recombinatie in type I en type II stammen van T. gondii door het schrappen van het gen encoding de Ku80 eiwit 1,2. De Δku80 stammen zich normaliter in tachyzoite (acute) en bradyzoite (chronische) Stadium vitro en in vivo vertonen en in wezen een 100% frequentie van homologe recombinatie. De Δ Ku80 stammen maken functionele genomische studies haalbaar op de enkel gen, alsmede op het genoom schaal 1-4.

Hier rapporteren we methoden voor het gebruik van type I en type II Δku80Δhxgprt stammen te gentargeting benaderingen in T. vooruit gondii. We schetsen efficiënte methoden voor het genereren van gendeleties, gen vervangingen, en gelabeld genen door gerichte insertie of deletie van het hypoxanthine-xanthine-guanine fosforibosyltransferase (HXGPRT) selecteerbare merker. De beschreven gerichte mutagenese protocol kan worden gebruikt in een verscheidenheid van manieren Δku80 stammen functionele analyse van de parasiet genoom bevorderen en enkele stammen die dragen ontwikkelenmeerdere gerichte genetische manipulaties. De toepassing van deze genetische methode en volgende fenotypische testen onthullen fundamentele en unieke aspecten van de biologie van T. gondii en aanverwante belangrijke humane pathogenen die malaria (Plasmodium sp.) en cryptosporidiosis (Cryptosporidium) veroorzaken.

Inleiding

Toxoplasma gondii is een obligate intracellulaire protozoaire voorkomende parasiet die vaak en chronisch infecteert een breed scala aan dieren en mensen 5. Er wordt geschat dat meer dan 1 miljard mensen zijn en chronisch besmet met deze ziekteverwekker. Naast het belang van ziekte veroorzaakt door T. gondii infectie, de toenemende beschikbaarheid van experimentele instrumenten, krachtige genomics middelen 6, het gemak van in vitro groei en uitstekende muismodellen T. gemaakt gondii een toonaangevende modelsysteem voor de bredere studie van intracellulaire eukaryote pathogenen en andere belangrijke apicomplexa parasieten die verwoestende ziekten zoals malaria (Plasmodium sp.) en Cryptosporidiosis (Cryptosporidium) 5,7 veroorzaken. Een belangrijke beperking van Toxoplasma gondii als modelorganisme is de inefficiënte herstel van nageslacht dat carry gerichte genetische manipulaties. Deze problematischem gene targeting door een lage frequentie van homologe recombinatie opzichte van het hoge frequentie van homologe recombinatie in wild-type stammen van T. gondii zelfs wanneer uitgebreide DNA homologie wordt in DNA doelmoleculen gebruikt in genetische studies 2.

We hebben onlangs genetisch blokkeerde de belangrijkste route van homologe recombinatie in type I en type II stammen van Toxoplasma gondii door verwijderen van het gen dat voor het eiwit Ku80 1,2. De resulterende type I en type II Δ Ku80 stammen vertonen normale groeisnelheid, grootte en de werking zowel in vitro als in vivo tijdens tachyzoite en bradyzoite Stadium vitro en in vivo, maar deze stammen vertonen in wezen een 100% frequentie van homologe recombinatie en dit fenotype verhoogt de kans op snel isoleren gewenste nakomelingen van gerichte genetische manipulaties van enkele honderden tot enkele thoUSand-voudige 1,2,4. Recente community-breed gebruik van type I en type II Δ Ku80 stammen is aanzienlijk opgevoerd tot het tempo, het ras, evenals de mate van succes van doelgerichte genetische benaderingen in T. gondii 1-4,8-13. Hier een uitgebreid protocol voor gerichte gendeletie, genvervanging, en gen-tagging in Δ Ku80 stammen van T. beschrijven we gondii. We laten zien hoe het ontwerpen en betrouwbaar richten genetische manipulaties om specifieke genen of genetische loci in Δ Ku80 stammen van Toxoplasma gondii.

Protocol

1. Gen Targeting om een ​​gen van belang Delete

Dit protocol is bedoeld voor het efficiënt genereren van een mutante stam die een gerichte gen deletie in een bepaalde genetische locus heeft. De eerder beschreven T. gondii hypoxanthine-xanthine-guanine fosforibosyltransferase (HXGPRT) selecteerbare marker wordt gebruikt in dit protocol voor veilige en betrouwbare marker invoegen na mycofenolzuur en xanthine (MPA + X) selectie 14-16. Dit protocol maakt gebruik van een gevalideerd en kosteneffectieve werkwijze voor het construeren van DNA doelmoleculen basis van gist recombinatorisch kloneren 17,18. Verscheidene alternatieve protocollen zijn commercieel verkrijgbaar voor het construeren van recombinante doelmoleculen met bacteriële recombinatorische kloneringswerkwijzen, in vitro recombinatie kloneringsmethoden, of fusie PCR. Het protocol hieronder beschreven levert de hoogste totale rendement en de betrouwbaarheid van het herstellen van gekloonde par.ieten bezit van een gerichte gendeletie in Δ Ku80 stammen van T. gondii.

1.1 Bereiding van DNA targeting

  1. Nog ToxoDB 6 ( http://www.toxodb.org ) naar genomische sequenties te verkrijgen voor het gen van belang (GOI).

Opmerking: Genomische sequenties worden verkregen van het type I, II of III genoomsequentie in de ToxoDB database die het dichtst bij de stam gemanipuleerd. Bijvoorbeeld: GT1 voor RH en ME49 voor Pru.

  1. Ontwerp specifieke overlap primers amplificeren dat de 5 'en 3' genomic gericht flanken van het gen van belang (GOI) waarin een 33 bp overlap met de gist shuttle vector pRS416 (of alternatief pRS426) en bevatten een 33 bp overlap met de selecteerbare merker ( HXGPRT) (figuren 1A-B). Voeg een unieke restrictie-enzym site in elke primer aan beide einden van de 5 'and 3 'genomic targeting flanken, geplaatst tussen de 33 bp overlap en de T. gondii-specifieke primer sequentie (s) (Figuren 1A-B).

Opmerking: A groter dan 30 bp overlap is vereist voor efficiënte gist recombinatie klonering. De 5 'en 3' genomic targeting flanken voor specifieke DNA-fragmenten te amplificeren tussen 800 en 1400 bp dat een gerichte deletie definiëren. Wees ervan bewust dat korter flanken aanzienlijk zal verminderen targeting-efficiëntie in de Δ Ku80 Δ hxgprt achtergrond 2.

  1. PCR versterken de 5 'target flank met behulp van primers F1 en R1, en ​​PCR versterken de 3' target flank met primer F2 en R2 (figuren 1A-C) van genomisch DNA 3. Afzonderlijk PCR amplificeren the ~ 2 Kbp HXPGRT gen inclusief de bijbehorende 5 'en 3' flankerende gebieden van dhfr de HXGPRT cDNA pminiHXGPRT cassette 14 met primers HXF en HXR(Figuren 1B-C).

Opmerking: Amplify doel flanken met genomisch DNA van de ouderstam te transfecteren.

Opmerking: Plaats de HXGPRT marker in de voorwaartse richting ten opzichte van de 5 'en 3' DNA targeting flanken latere efficiënte genetische manipulaties, zoals het gericht verwijderen van HXGPRT van de verstoorde locus te vergemakkelijken.

  1. Correcte PCR product valt door agarose gelelektroforese en schat de concentratie DNA fragment middels agarosegel normen of andere methode voor het bepalen van DNA-concentratie.
  2. Genereer bevoegde gist monsters zoals beschreven in Gietz en Schiestly 17.
  3. Combineer 50 ng 5 'genomic targeting flank, 50 ng 3'genomic targeting flank, 100 ng HXGPRT selectiemerker en 50 ng gelineariseerde shuttlevector met steriel H2O op een eindvolume van 10 bereiken -20 pl. Transformeren bevoegde gist met de drie PCR-producten en gist-E. coli shuttle vector voor recombinationele klonen met behulp van het protocol beschreven door Gietz en Schiestly 17. Plaat getransformeerde gist op uracil-minus minimaal medium agar platen en incubeer bij 30 ° C gedurende 2-3 dagen.

Opmerking: De bestelde samenstel van het plasmide, het 5 'target flank, de HXGPRT marker, en de 3' target flank wordt vergemakkelijkt door de gemanipuleerde 33 bp overlap tussen de DNA-fragmenten (figuren 1A-B) en wordt gemedieerd door homologe recombinatie in gist.

  1. Oogst gist door toevoeging van 2 ml 2x YPAD aan de uracil-min platen en voorzichtig schrapen om kolonies verjagen zonder verstoring van de agar. Centrifugeer de gist oplossing 5 minuten bij 5000 xg Verwijder de bovenstaande vloeistof.
  2. Resuspendeer de pellet gist in 250 ui van een resuspensie buffer die RNaseA en voeg 50-100 ul van eencid gewassen glasparels aan de oplossing. Vortex gedurende 5 minuten op de hoogste snelheid om de gistcellen te breken.
  3. Laat de glasparels naar de bodem van de buis en breng het supernatant naar een 2 ml Eppendorf buisje.
  4. Isoleer gist DNA met een miniprep DNA isolatie kit, opnieuw suspenderen in een eindvolume van 100 pi ~.
  5. Meng 2 pl gist DNA (~ 50 ng) met 40 ul van DH10B elektroporatie competente E. coli op ijs bewaard.
  6. Breng de oplossing voor een gekoelde 2 mm gat elektroporatie cuvette en electroporate de bacteriële cellen op 2,4 kV en 129 Ω.
  7. Redding cellen door toevoeging van 0,8 ml SOC bouillon aan elke cuvet en de overdracht oplossing voor een 14 ml snap-cap Falcon buis. Incubeer cellen bij 37 ° C op een wals trommel voor 40 - 60 minuten.
  8. Plaat E. coli op 2XYT + ampicilline (AMP) platen en incubeer de platen bij 37 ° C geïncubeerd.
  9. Selecteer ~ 6-8 afzonderlijke kolonies en groeien in 3 ml 2XYT + AMP voor ~ 16 uur bij 37 ° C.
  10. Bereid een 30% glycerol vriezer voorraad van elk E. coli kloon.
  11. Isoleer plasmide pΔGOI uit E. coli klonen met een miniprep kit, opnieuw suspenderen in een eindvolume van 100 pi ~.
  12. Valideert de pΔGOI met restrictie-enzym verteert aan het DNA-plasmide maat te meten en verifiëren van de verwachte pΔGOI DNA bandenpatronen.
  13. Afronden validatie van pΔGOI door DNA sequentie van de 5 'en 3' genomic targeting flanken 100% DNA-sequentie gebaseerd op genoom sequentie gegevens controleren http://www.ToxoDB.org .

Opmerking: Bij perfect sequentiehomologie is essentieel voor het maximaliseren van gen-targeting efficiency 3 aangezien elk basenpaar verschil vormt een overeenkomstige verlaging van de lengte van perfecte homologie.

Opmerking: Het genoom sequentie van het type II Δku80 stam op basis van de Pru ouderlijke stregen is op dit moment niet beschikbaar. Dit werk wordt de type II ME49 genoomsequentie als surrogaat genoom voor het type II Δ Ku80 stam. Op basis van sequentiegegevens op verschillende genetische loci, wordt geschat dat het genoom ME49 en Pru genoom vertonen single nucleotide polymorfismen bij een frequentie van ~ 1 per 10.000 nucleotiden of minder.

  1. Genereer> 200 ug pΔGOI voorraad door het enten van een ~ 250 ml 2XYT + AMP overnachtcultuur met glycerol voorraden van een gevalideerde E. coli miniprep kloon.
  2. Isoleer pΔGOI plasmide-DNA van de grote kweek met een maxiprep DNA isolatie kit, opnieuw suspenderen in een eindvolume van 1000 pi ~.
  3. Herhaal restrictie-enzymdigesten of DNA-sequentiebepaling van de DNA pΔGOI maxiprep de juiste targeting DNA-molecuul voor transfectie controleren.
  4. Lineariseren ~ 15 ug pΔGOI aan het 5 'uiteinde met het unieke restrictie-enzym X (RE.X)digest website ingebouwd in de 5 'target flank (figuren 1B).

Opmerking: Gene targeting in T. gondii vereist minimaal ~ 10 ug targeting DNA efficiënt frequentie van gebeurtenissen richten op het gen-locus plaats 2 vinden.

  1. Valideer linearisatie van pΔGOI en bepaal de DNA concentratie agarose gelelektroforese of een alternatieve methode.

Opmerking: Als restrictie-enzym digestie op de 5 'flank levert geen volledige linearisatie, de ontworpen 3'kunnen unieke RE.Y digest plaats worden gebruikt als een alternatieve plaats voor linearisatie van pΔGOI.

Opmerking: Een volledig lineair targeting DNA molecule is essentieel voor een succesvolle gentargeting door homologe recombinatie in het Δ Ku80 stammen.

  1. Neutraliseren het restrictie-enzym door incubating bij 68 ° C gedurende 15-20 minuten.
  2. Maak minstens 15 ug gelineariseerd plasmide in 100 ui steriel H2O WINKEL gelineariseerde pΔGOI bij -20 ° C tot het moment van transfectie.

1.2 Voorbereiding van T. gondii parasieten, transfectie, selectie, subkloning, validatie, archivering en onderhoud van genetisch gemanipuleerde stammen

Algemene werkwijzen voor de kweek en manipulatie van T. gondii in humane voorhuid fibroblasten (HFF) cellen worden 19-21 beschreven. De Ku80 Δ Δ hxgprt stammen repliceren normaal in parasietinfectie medium (Eagles minimaal essentieel medium (EMEM) kweekmedium aangevuld met 1% foetaal runderserum (FBS) en 1% Anti-schimmel antibioticabehandeling verdund uit een voorraad 100x) 1,2. Alle werkzaamheden met Toxoplasma gondii moet worden uitgevoerd met bioveiligheidsniveau 2 procedures. De T. gondii RHΔ Ku80 2 parental stam werd gegenereerd uit de RHΔ hxgprt stam van de Roos Lab 14. De PruΔku80 1 ouderstam gerealiseerd met PruΔhxgprt (Pru gniaud stam BSG-4 22) die een stabiel geïntegreerde CAT selecteerbare marker en een groen fluorescerend eiwit (GFP) reporter onder de controle van de bradyzoite stadium specifieke promoter LDH2 bevat.

  1. Inoculeren een 25 cm 2 kolf met samenvloeiing HFF cellen met 1 x 10 6 levensvatbare type I RH Δ Ku80 Δ hxgprt parasieten, of enten twee 25 cm 2 flessen met 2 x 10 6 levensvatbare type II Prugniaud (Pru) Δ Ku80 Δ hxgprt parasieten.

Opmerking: Levensvatbare parasieten worden gedefinieerd als extracellulaire parasieten die vers zijn gelyseerd uit.

Opmerking: Deze schaal verschaft een voldoende aantal levensvatbare parasieten drie transfectie-experimenten.

  1. Inspecteer de Δ Ku80 Δ hxgprt besmet culturen ~ 68-72 uur na infectie. Controleer de aanwezigheid van levensvatbare parasieten ~ 90-95% lysis van HFF cellen tot het exacte tijdstip van de transfectie plannen.

Opmerking: De isolatie van vers egressed parasieten is essentieel voor het succes van dit protocol, omdat lage levensvatbaarheid parasiet zal gene-targeting efficiëntie af te schaffen.

  1. Schud levensvatbare parasieten in oplossing door het sluiten van de plug-afdichting deksel op de 25 cm 2 kolf en krachtig schudden de kolf heen en weer om de parasieten ageren af van de groei oppervlak zonder spatten vloeistof op de binnenkant van het deksel of de hals van de kolf .

Opmerking: Parasite oogst heeft een spuit-naald vrijgave protocol voor het type I of niet nodigTyp II Δ Ku80 stammen.

  1. Breng de parasiet oplossing een 10 ml injectiespuit bevestigd aan een filterhouder met een 3 urn membraan en zet de filtereenheid op de top van een open 15 ml schroefdop tube. Spuit filter instellen voor het parasieten in de 15 ml schroefdop buis.

Opmerking: filteren van de parasieten door het membraan verwijdert geïnfecteerde cellen en celresten.

  1. Bepaal de parasiet concentratie (tachyzoite formulieren per ml) met behulp van een hemocytometer.

Opmerking: Optioneel: Met behulp van de parasiet oplossing, het opzetten van een plaque-vormende eenheid (PFU) test 21 die zal worden gelezen 7-8 dagen later om voldoende levensvatbaarheid van de getransfecteerde parasieten (PFU naar verhouding van ≥ 0,2 tachyzoite) te bepalen.

  1. Pellet parasieten gedurende 7 min bij 1400 xg en zuig supernatant tot ~ 0,4 ml zonder verstoring van de parasiet pellet. Spin gedurende 2 min bij 1,400 xg en aspireren resterende supernatant tot ~ 0,01 ml zonder verstoring van de parasiet pellet.
  2. Resuspendeer de pellet parasiet door de bodem van de buis en voeg onmiddellijk flicking cytomix 23 buffer (1,33 x concentratie) van de parasiet pellet een parasiet concentratie van 4 vinden - 5 x 10 7 parasieten / ml cytomix.

Opmerking: Laat de toevoeging van ATP en glutathion cytomix aangezien deze toevoegingen niet de efficiëntie van gen targeting.

  1. Ontdooi de 100 pi aliquot van het gelineariseerde pΔGOI van protocol 1.1 (stap 26).
  2. Breng 0,3 ml van de parasiet cytomix oplossing (~ 1,3-1,6 x 10 7 parasieten) de 100 pi gelineariseerde pΔGOI van protocol 1.1 (stap 26), en onmiddellijk over de volledige 0,4 ml parasiet + pΔGOI mix een gekoelde 2 mm gap elektroporatie cuvette.
  3. Electroporate de parasieten bij 1,4 kV en 24 Ω.
  4. Rest de transfectie cuvet bij kamertemperatuur gedurende ca. 5 min. breng de gehele inhoud van de transfectie cuvette in een 150 cm2 kolf die HFF confluente cellen met 30 ml infectiemedium en incubeer de geïnfecteerde cultuur overnacht.
  5. Begin selectie in mycofenolzuur + xanthine (MPA + X) ~ 20 uur na transfectie (Figuur 2A) door vervanging van de infectiemedium met MPA + X selectiemedium (MPA (25 pg / ml) en xanthine (50 ug / ml) in infectie gemiddeld).

Opmerking: het incuberen MPA + X selectie kolf niet storen.

  1. Schat het aantal pfu in de MPA + X winkelwagentje kolf ~ 8 dagen na transfectie door visuele inspectie van de monolaag. Controleer de aanwezigheid van het ontwikkelen pfu en gezonde zones van besmetting met lichtmicroscopie.

Opmerking: Als plaques niet zichtbaar op dag 8, handhaven de selectie en toezien op tekenen van infectieion sinds mutante stammen kunnen een verminderde replicatie-tarief.

Opmerking: De Δ Δ Ku80 hxgprt parasietenstammen een zeer lage achtergrond van ongewenste nontargeted gebeurtenissen, waardoor de succesvolle isolatie van mutante stammen met zeer ernstig, maar niet dodelijk groeistoornis. Als een gen essentieel en kan niet worden verwijderd, de primaire transfectie, of daarna doorgegeven parasietenpopulatie kan een fenotype waarin de parasieten langer repliceren tijdens de selectie als de bevolking lost gerichte knockouts onthullen.

  1. Schud de fles als in stap 3 tot en met extracellulaire parasieten te verjagen uit de monolaag [na zichtbare plaques hebben ontwikkeld] om een ​​parasiet oplossing te genereren. Transfer ~ 0.5 ml van de oplossing uit de parasiet MPA + X selectie kolf een 25 cm 2 MPA + X winkelwagentje confluente kolf met HFF-cellen (duiden deze cultuur door 1A).
  2. Verjagen parasiets in de oorspronkelijke 150 cm 2 MPA + X selectie kolf ~ 3 dagen later en overdracht ~ 0,5 ml parasiet oplossing voor een tweede 25 cm 2 MPA + X selectie kolf met samenvloeiing HFF cellen (duiden deze cultuur pas 1B).
  3. Laat zones van de infectie te ontwikkelen in pas 1A en / of doorgeven 1B kolven voor ~ 5 dagen. Visueel te controleren door lichtmicroscopie dat pas 1A en 1B kolven bevatten minimaal 25 levensvatbare pfu's met gezonde zones van de infectie.
  4. Kies voor de pas 1A of 1B pas kolf voor voortgezet passage in MPA + X selectie medium in 25 cm 2 flessen. Behouden doorgang onder MPA + X selectie.

Opmerking: Parasieten worden gekweekt gedurende een voldoende aantal generaties nonintegrated aanhoudende episomen voor subklonering verwijderen uit de populatie. Niet subkloning voorafgaand aan 20 dagen na transfectie voeren voor type I RH Δ Ku80 Δ hxgprt, of voorafgaand aan 25 dagen na transfectie voortype II Pru Δ Ku80 Δ hxgprt parasieten voldoende tijd om niet-geïntegreerde episomen verdunnen 1,2 toestaan.

  1. Subkloon parasieten in een 96-well tray met daarin samenvloeiing HFF cellen met MPA + X selectie medium. Bereid een bakplaat concentratie van 1 parasiet / putje en een tweede bak bij een concentratie van 2 parasieten / putje.

Opmerking: Subkloneer parasieten die onlangs gelyseerd (~ 90-95% van HFF cellen in 25 cm2 kolf), zodat de parasieten een hoge levensvatbaarheid.

Opmerking: De optimale tijd na transfectie voor subklonering werd vastgesteld door te meten hoe snel succes gericht parasieten ontstaat op een hoge frequentie in de geselecteerde populatie 1.

  1. Blijven om de passage van de primaire bevolking van getransfecteerde parasieten in MPA + X selectie medium met behulp van een wekelijkse passage schema te besmetteneen 25 cm2 kolf met HFF 10 ul van de oplossing parasiet.

Opmerking: Als klonen die het doelwit gen deletie (knockouts) niet zijn verkregen uit de eerste subkloneren in stap 18, resubclone de parasieten van het permanent gehandhaafd bevolking ~ 10 - 12 weken na transfectie.

Opmerking: Een van de redenen een gen deletie wordt niet verkregen voort uit de episomale persistentie van bepaalde pΔGOI plasmiden. Episomale persistentie wordt bepaald door de sequenties in de 5 'en 3' genomic targeting flanken en lijkt niet voort uit de HXGPRT genetisch element. Ongeveer 5-10% van targeting plasmiden bestaan ​​aanzienlijke episomale persistentie die later subklonering van de parasietenpopulatie maken een voldoende aantal malen om de generatie aanhoudende episomen verdunnen en oplossen van de bevolking hoofdzakelijk stabiele integranten noodzakelijk.

  1. Score de 96-wells 6-7 dagen na subkloneren (type I parasieten) of 7-8 dagen na subkloneren (type II parasieten) voor putten die een PFU, als een enkel gebied van infectie in lichtmicroscopie bij bevatten ofwel 40X of 60X macht. Markeer een kleine stip op het 96-putdeksel lade naar de locatie van het PFU in de put wijzen.
  2. Meng de inhoud van elk putje met een enkele PFU met een pipet vastgesteld op 50 pl (200 ul tip) door het richten van de vloeistofstroom over de PFU om parasieten verspreiden in de put.

Opmerking: Het mengen van de goed versnelt parasiet lysis van de HFF monolaag. Type I RH stammen zal lyseren de goed ~ 4 dagen na het mengen, zal type II Pru parasieten te lyseren de goed ~ 5 dagen na het mengen.

  1. Selecteer een dozijn lyseerden putten (klonen) en kras over de bodem van elk van deze gelyseerde putten met behulp van een 0,5-10 ul pipet terwijl tegelijkertijd opstelling van 6 pi parasiet oplossing. Transfer de 6 pl parasiet oplossing voor een goed in een 24-well tray met daarin samenvloeiing HFF cellen in 1 ml MPA + X selectie medium.

Opmerking: Het is essentieel om krassen op de bodem van de put te houden van de opening van de boring pipetpunt in constant contact met parasieten wonende de bodem van de put.

  1. Toezien op de 24-well tray voor lysis van de HFF cellen.

Opmerking: Type I RH parasieten zal doorgaans lyseren het goed in de 24-well formaat in ~ 4 dagen. Type II Pru parasieten zal doorgaans lyseren het goed in ~ 5 dagen.

  1. Breng 2 ui levensvatbare parasieten oplossing gekrast vanaf de bodem van elk putje in de 24-well formaat met de overeenkomstige putje van een nieuwe 24-wells bevattende confluente HFF cellen en 1 ml MPA + X selectiemedium per well.

Opmerking: Alle parasieten klonen en lijnen kan worden continu belangrijkstevervat door het passeren van 2 pl levensvatbare parasiet oplossing om de 7 dagen in deze 24-well tray formaat.

  1. Controleer of parasieten werden met succes overgebracht naar een nieuwe 24-well tray door visuele controle met lichtmicroscopie ~ 18 uur na passage.
  2. Oogst parasieten uit de gelyseerde putjes van de 24-well tray uit stap 23-24 met behulp van een 1 ml of 10 ml pipet en breng de parasiet oplossing voor een Eppendorf buis.
  3. Pellet de parasieten bij 1.400 x g gedurende 7 minuten, eenmaal in 1 ml fosfaat-gebufferde zoutoplossing spoelen (PBS), en de pellet opnieuw bij 1.400 x g gedurende 3 minuten.
  4. Aspireren PBS uit de pellet, voeg dan 200 ul PBS om de pellet aan de parasieten opnieuw in suspensie. Bevries de parasiet oplossing bij -80 ° C tot DNA isolatie.
  5. Isoleer parasiet DNA van elke kloon met een tissue DNA-isolatie MINIKIT.
  6. Bevestigen de doelgen deletie (knockout) van PCR met primers validatie (figuren 2A-C). Test voor deAangezien de functionele coderende gebied van het gen van belang en met de stroomopwaartse en stroomafwaartse CxF cxr genomisch DNA primers (figuren 2A-B) test op de aanwezigheid van PCR-producten die de genomische richten flanken HXGPRT overspannen aantonen juiste 5 'en 3 "gerichte integratie van de HXGPRT gen in het verwijderde gen locus.

Opmerking: Primers voor de validatie die uniek het gen van belang of een vals positief resultaat worden verkregen. Primer ontwerp kan worden gevalideerd http://www.toxodb.org door explosieven primersequenties het genoom (s) nagaan primers uniek.

  1. Passage parasiet klonen wekelijks schema zoals beschreven in stap 24. Zodra het gericht wissen is gevalideerd, voortdurende selectie in MPA + X is optioneel.
  2. Archief parasiet klonen door diepvriezer voorraden bereiden. Pellet extracellulaire parasietenuit gelyseerde HFF cellen in een 25 cm 2 kolf, resuspendeer parasiet pellet te verwijderen media en voorzichtig in celcultuur bevriezing medium bij een parasiet concentratie> 4 x 10 7 parasieten per ml. Overdracht hoeveelheden aan cryoflesjes en opslag parasieten onbeperkt in vloeibare stikstof of bij -80 ° C.

2. Schrapping van HXGPRT

Dit protocol is ontworpen voor het verwijderen van HXGPRT marker van de integratieplaats in het genoom van een genetisch gemanipuleerde Δ Ku80 stam. Verwijdering van HXGPRT maakt marker herstel en het genereren van stammen met meerdere genetische manipulaties met alleen selecties op basis HXGPRT 1-3. Terwijl het protocol hieronder beschreven wordt de werkwijze opnieuw te richten op een locus HXGPRT verwijderen, moet worden opgemerkt dat de verwijdering van HXGPRT op het gen-locus van belang maakt ook gelijktijdige re-integratie van het wild-type gen (complementation), re-integratie van een mutant gen, en re-integratie van een gelabeld gen (N-of C-terminale GFP, HA tag, enz.), waardoor een verscheidenheid van genetische manipulaties. De werkingsmechanismen 24 en targeting protocollen met 6-thioxanthine selecties zijn eerder beschreven 1-3,15.

2.1 Verwijderen HXGPRT

  1. Accijnzen de HXGPRT selecteerbare merker van pΔGOI door verteren met RE.Z te snijden op de unieke restrictie-enzym plaatsen aan weerszijden van de HXGPRT (Figuur 1B).
  2. Controleer volledige digestie van DNA door agarose gel elektroforese. Isoleer de grootste van de twee banden van de agarose gel.

Opmerking: De grootste van de twee banden bevat het plasmide met de 5 'en 3' DNA-doelmateriaal flanken, maar niet de HXGPRT gen.

  1. Plaats de sectie agarose met de grotere DNA band in een spin kolom laying van de gel plat op het membraan. Draai de kolom bij 13.000 x g gedurende 4 min. bij kamertemperatuur. Voeg steriel H2O de doorstroming om het volume op 100 ui te brengen.

Opmerking: Andere commerciële methoden beschikbaar om DNA uit agarose te isoleren.

  1. Concentreer DNA door precipitatie met EtOH, opnieuw suspenderen van het DNA in een eindvolume van 18 pi steriel H2O
  2. Meng 1 gl geconcentreerde DNA met 7 ml H2O, 1 pl 10x ligatiebuffer en 1 gl T4 DNA ligase (5 eenheden) en plaats de reactie bij 4 ° C gedurende de nacht pΔGOIc (pΔGOIclean) (figuur 3A) te genereren.

Opmerking: DNA-fragmenten met RE.Z die DNA uiteinden kunnen worden ontworpen en opgenomen in deze stap om plasmiden geschikt voor gerichte re-integratie van de wild-type gen (complementatie), gerichte re-integratie van een mutant gen te maken en gerichte re-integratie van een gen gelabeld(N-of C-terminale GFP, HA tag, etc.).

  1. Verdun het reactiemengsel 2x met steriel H2O voor elektroporatie.
  2. Transformeren pΔGOIc in E. coli zoals in protocol 1.1 te subkloneren, isoleren, en valideren van de targeting plasmide. Dan lineariseren pΔGOIc in voorbereiding voor transfectie (zie stappen 1.1.11 naar 1.1.26).
  3. Herhaal de parasiet transfectieprotocol zoals beschreven in het protocol 1.2 (stap 1 tot 11).

Opmerking: Voorafgaand aan het uitvoeren van de stappen 1 tot 8, te controleren of gerichte verwijdering van HXGPRT haalbaar is in de mutante stam. Infecteren van een 150 cm 2 kolf van samenvloeiing HFF cellen met 1 x 10 6 tachyzoïeten van de mutante stam met 6-thioxanthine (6TX) selectie medium (200 ug / ml 6TX in infectiemedium) en zet de kolf in een PFU assay. Inspecteer de kolf 8 dagen later om te controleren of er geen (of zeer weinig; <10) PFU zijn zichtbaar, wat essentieel is om vast te stellen dat de potentiëletieel gentargeting efficiëntie zal eventuele spontane terugkeer van de mutante stam overschrijden om een fenotype met verminderde HXGPRT expressie (een 6TX weerstand fenotype).

Opmerking: Ongeveer 5-10% van HXGPRT integratielocaties vertonen een significante en frequentie van spontane 6TX weerstand terwijl de HXGPRT marker nog geïntegreerd op de doelplaats (zie Representatieve resultaten sectie voor een uitleg).

  1. Begin 6TX selectie ~ 20 uur na transfectie door het veranderen van het medium in de 150 cm2 kolf 6TX selectiemedium.

Opmerking: sluit de kolf gedurende ~ 10 dagen na transfectie niet storen.

  1. Inspecteer de kolf gedurende PFU vorming op dag 10 - 12 na transfectie (type I parasieten) of dag 10-16 na transfectie (type II parasieten).

Opmerking: Parasites worden gericht voor het schrappen van HXGPRT zal niet beginnen te groeien onder 6TX selectie totdat het HXGPRT gen en mRNA wordt verwijderd, en de overblijvende HXGPRT eiwit wordt geïnactiveerd.

  1. Schud de kolf om een selectie parasiet oplossing en overdracht creëren 0.5 - 1.0 ml van de parasiet oplossing in nieuw 25 cm2 kolf die confluente HFF cellen en 5 ml 6TX selectiemedium. Herhaal de overgang van de primaire 150 cm 2 nieuwe 25 cm2 flessen een keer per dag gedurende twee dagen.

Opmerking: Meervoudige bemonstering verhoogt de kans op het vastleggen van levensvatbare gerichte parasieten die de HXGPRT gen hebben verloren.

  1. Inspecteer de 25 cm2 flessen ~ 5 dagen na infectie de aanwezigheid van pfu ontwikkelen met zones van gezonde replicerende parasieten. Kies een of twee kolven die zones van infectie.

Opmerking: Parasieten verwijderd van de HXGPRT gen repliceren op een normaal groeipercentage in 6TX selectie.

  1. Blijven om de passage van de parasieten in 6TX selectie medium.
  2. Subkloneren de parasiet populatie na 25 - 30 dagen van de selectie. Instellen van een 96-well tray met ~ 1 parasiet / goed en een andere met ~ 2 parasieten / goed.
  3. Bereid parasiet DNA van geïsoleerde klonen en klonen in een 24-well formaat cultuur te behouden volgens protocol 1.2 (stappen 19-29).
  4. Valideer verwijdering van HXGPRT door PCR met de in figuren 3A-B strategie.

3. C-eindstandige Tagging of Proteins

Dit protocol is bedoeld voor C-terminale tagging van eiwitten door je op de tag voor integratie via dubbele kruis over homologe recombinatie bij de genomische locus van het gen met MPA + X selectie 2,4. Dit protocol werkt efficiënt omdat de 5 'sequentie van het dhfr HXGPRT merker een volledig gevalideerde functionele 3 'onvertaalde regio van andere genen 2,4.

3.1 Direct C-terminale tagging eiwitgehalte bij endogene genetische loci

  1. Maak pΔGOItag targeting plasmide constructie door middel van gist recombinatorisch kloneren (figuur 4) en methoden 1.1 beschreven protocol. De 5 'genomic targeting flank bevat de laatste 800 tot 1200 bp van de coderende regio (of genomisch DNA) van de Indiase overheid, met uitzondering van het stopcodon wordt verplaatst naar een positie 3' van de tag naar keuze (HA-tag, Myc-tag, His-tag enz.)
  2. Maak de gerichte insertie van het C-terminale tag aan het endogene locus van het eiwit-coderende gen door het volgen van de stappen in het protocol 1.1 en 1.2 met behulp van de geschetste (figuur 4) strategie.
  3. Controleer de insertie van de C-terminale label de endogene gen locus met behulp van een PCR-strategie.
  4. Retarget het gen locus met behulp van in protocol 1 en protocol 2 bij delete de HXGPRT selecteerbare merker aan een nauwkeurig gereguleerde endogeen gen locus dat een gelabeld eiwit expressie te creëren. Dit protocol herstelt ook HXGPRT selecteerbare merker die opnieuw kunnen worden gebruikt om een andere locus in het gelabelde stam (zie protocol 1) richten.

Resultaten

Een gedetailleerde template voorzien voor het construeren van een targeting plasmide een gen te verwijderen, met de plaatsing van restrictie-enzymplaatsen en het genereren van de primers die vergemakkelijken genetische richten en validatie van gen targeting, en plasmide constructie voor de daaropvolgende verwijdering van HXGPRT in een single-stap-proces (figuren 1A-C, Figuur 2A, figuur 3A). Een algemeen schema is weergegeven voor het maken van een gerichte gen deletie (figuur 2A), de primerparen gebruikt voor het verwijderen van een knockout valideren, worden bijvoorbeeld type I ROP18 (figuur 2B), en de representatieve resultaten van de PCR validatie (Figuur 2C). Deze vertegenwoordiger resultaat wordt het bereik van de resultaten die zijn te verkrijgen op genetische loci die relatief moeilijk doel te illustreren. Een succesvol gerichte gen deletie resulteert in de afwezigheid van het gen inlangstelling PCR product (PCR 1), de aanwezigheid van de 3'genomische targeting flank (PCR2), en de aanwezigheid van de selecteerbare merker HXGPRT goed geïntegreerd tussen de 5 'en 3' genomic gericht flanken de deletie define (PCR3 en pCR4) . Klonen 3, 4, 5, 6, 8, 9 en 11 worden gevalideerd gericht genschrappingen (knockouts) indien HXGPRT vervangt het GOI (figuur 2C).

Een kloon die een gen deletie niet bevat kan worden weergegeven door verschillende bandenpatronen. Meestal zal een kloon zonder gendeletie de ouderstam (ouderlijk patroon) spiegel met banden waargenomen voor PCR1 en PCR2, maar niet PCR3 of pCR4 gezien op klonen 1 en 2 (figuur 2C). Deze "ouderlijke patroon" komt voort uit een paar mogelijke mechanismen. Af en toe, MPA bestand geselecteerd parasieten dragen nonintegrated aanhoudende episomen van de pΔGOI targeting plasmide, en merken we op dat de aanhoudende selectie dwingt vaak deze episomente integreren. We zien ook zeldzame achtergrond van type I Δ Ku80 stam door onbedoelde integratie van de pΔGOI targeting plasmide dat een cDNA expressie HXGPRT via DHFR 5 'en 3' promoter elementen, in hetzij de DHFR locus of in de gedeeltelijk verwijderde HXGPRT bevat locus 14. Hoewel deze zeldzame gebeurtenis is een gerichte integratie, het niet de beoogde integratie en dient als een belangrijk punt om te onthouden in het ontwerpen van een gen vervangingsstrategie. DNA-homologie van meer dan 120 bp uitgevoerd op uw pΔGOI targeting plasmide kan zorgen voor een alternatieve locatie voor de recombinatie in Δ Ku80 stammen 2 die terug kon geven een ongewenste achtergrond. In het type II Pru Δ Ku80 stam deze achtergrond wordt verminderd of onbestaand vergeleken met type I omdat HXGPRT selecteerbare marker is gebaseerd op type I-sequenties die nucleotide polymorfismen in vergelijking met type II DNA datvermindert dit zeldzame achtergrond in experimenten met het type II Pru Δ Ku80 stam 1. Als een gen locus is van essentieel belang (kunnen niet worden verwijderd), of heeft een extreem lage gentargeting frequentie op de locus of als aanhoudende [nonintegrated] episomen zijn niet gemakkelijk geëlimineerd via groei en selectie, zal deze ouderlijke patroon het patroon waargenomen in MPA domineren resistente klonen. Alternatief wordt de richtende DNA molecule soms waargenomen wordt geïntegreerd op alleen de 5 'of 3' genomic gericht flank en een band wordt waargenomen voor zowel PCR3 of pCR4 (maar niet beide) met PCR1 en PCR2 gezien voor kloon 10 (5 'integratie) en kloon 7 (3' integratie) (figuur 2C). Deze patronen suggereren het zeldzame optreden van een kruis over integratie van het doel richtend plasmide op de locus die HXGPRT integreert maar doelgerichte integratie wordt het gen van belang niet verwijderen. Dit patroon (lanen 7 & 10 in figuur 2C) emphasizes de noodzaak PCR gegevens aan te gaan of gerichte integratie plaatsvond in plaats van een enkele homologe oversteken en een tweede homologe integratie van het doel richtend molecuul. Zelden zien we een genetische mix vertegenwoordigd door kloon 12 (figuur 2C) dat zowel een ouderlijke patroon en een gerichte verwijdering patroon vertegenwoordigt. Dit patroon ontstaat waarschijnlijk bij gelegenheid van twee genotypen parasiet die zich op dezelfde locatie in een kloneringsvector goed zijn.

Een algemeen schema voor het verwijderen van HXGPRT van Δ ku80Δgoi :: HXGPRT aan HXGPRT van de stam verwijderd wordt (Figuur 3A). Het primerpaar gebruikt voor de verwijdering van HXGPRT valideren van Ku80 Δ Δ gra2 :: HXGPRT (figuur 3B) amplificeert een unieke ~ 1,2 kb band in PCR5 gezien in klonen 4, 7, 9, 11 en 12 (figuur 3C). Als HXGPRT niet uit de locus, een ~ 3.4 Kbp band wordt waargenomen (klonen 1, 2, 3, 6, 8, 10, en de ouderlijke controle). Verschillende mechanismen handelen om de verwijdering van HXGPRT (6TX selectie) uitdagender en minder efficiënt dan de integratie van HXGPRT (MPA + X keuze) te maken. MPA selectie is gewoon efficiënter dan 6TX selectie 14,16. Bovendien zijn hogere HXGPRT expressie nodig voor 6TX selectie dan MPA selecties 16,24. Derhalve kunnen mutaties die HXGPRT enzymactiviteit of epigenetische mutaties of veranderingen die het expressieniveau van HXGPRT te verminderen bij locus een gen kan verminderen mogelijk de efficiëntie van 6TX selectie schaffen. Zelfs met deze uitdagingen van 6TX selectie, het slagingspercentage van 6TX selectie in Δ Ku80 stammen groter is dan 90% op de eerste poging 1-3.

Een algemeen schema voor directe C-terminale tagging van proteïne-coderende genen (Figuur 4). Dezeregeling maakt gebruik van directe integratie via dubbele cross-over homologe recombinatie van HXGPRT 3 'van de tag-gen en telt ook validatie strategieën, vergelijkbaar met die hierboven beschreven. Wanneer een gen wordt vermoed dat ze een essentieel gen kan worden geverifieerd met behulp van een tweede transfectie met een onafhankelijk geïsoleerd gericht DNA plasmide. Alternatieve werkwijzen, zoals systemen voor gereguleerde genexpressie, zijn beschikbaar voor verdere verifiëren of een gen essentieel 25.

figure-results-1
Figuur 1. Overzicht van het ontwerp van een targeting plasmide DNA. Een. Schematische voor het ontwerpen overlappen primers gebruikt voor PCR versterken de 5 'en 3' target flanken met 33 bp overlapt voor de pRS416 shuttle vector en HXGPRT minigen cassette. Primers afgebeeld in het schema zijngebruikt voor het genereren van de 5 'en 3' target flanken van pΔROP18 10. B. Algemene strategie voor het ontwerpen van een DNA-molecuul richten. De ruggengraat van pΔGOI is de pRS416 shuttle vector bevattende uracil (URA) en ampicilline (AMP) selecteerbare merkers. Ingevoegd in pRS416 is ~ 1 Kbp 5 'DNA-doel flank geamplificeerd uit genomisch DNA met overlappingen van de HXGPRT minigen cassette en pRS416 met de primers F1 en R1, a ~ 1 Kbp 3' doelwit DNA flankeren geamplificeerd uit genomisch DNA met overlappingen de HXGPRT minigen cassette en pRS416 met de F2 en R2 primers en HXGPRT minigen cassette. De volgende unieke restrictie-enzym digestie sites worden toegevoegd aan de primers: RE.X (restrictie-enzym X gesneden ter) in de F1 primer het plasmide gesneden aan het 5 'uiteinde van de 5' DNA-doel flank, RE.Y in de R2 primer aan het 3'-uiteinde van het 3'-DNA-doel flank en RE.Z het plasmide te snijden in de R1 en F2 primers voor het uitsnijden van de HXGPRT minigene cassette. C. Primersequenties gebruikt om de targeting construct voor de verwijdering van ROP18 genereren. De vetgedrukte gebieden overeenkomen met T. gondii genomische sequentie en de nonbold's overeenkomen met de restrictie-enzymplaatsen en sequenties die overlappen met pRS416 en HXGPRT minigen cassette. De HX_F en HX_R primerpaar versterkt het HXGPRT minigen cassette 14. Primers gelezen van 5 'naar 3'. Tabel aangepast van Fentress et al. 10. Klik hier om een grotere afbeelding te bekijken .

figure-results-2
Figuur 2. Overzicht van het protocol voor de verwijdering van een gen met behulp HXGPRT. A. Disruption van de Indiase overheid in de Δ ku80Δhxgprt stam door een dubbele crossover homologe recombinatie met een ~ 1 Kbp 5 'DNA doelwit flank en een ~ 1 Kbp 3' DNA doelwit flank op plasmide pΔGOI. Een PCR-strategie met PCR1, PCR2, PCR3, en pCR4 (niet op schaal) wordt aangetoond dat genotype verificatie mogelijk maakt om klonen te valideren met gerichte integratie van HXGPRT en verwijdering van de Indiase overheid locus. B. Vertegenwoordiger primerparen ontworpen om de verwijdering van ROP18 valideren . ROP18_DF en ROP18_DR versterken PCR1, ROP18_ExF en ROP18_CxR versterken PCR2, ROP18_CxF en DHFR_CxR versterken PCR3 en DHFR_CxF en ROP18_CxR versterken pCR4 (zie figuur 2A). Primers gelezen van 5 'naar 3'. Tabel aangepast van Fentress et al. 10. C. Representatieve resultaten van de validatie van een gerichte gendeletie (ROP18) met HXGPRT. Na transfectie van plasmide pΔROP18 in Δ ku80Δhxgprt en selectie in MPA +X, MPA + X resistente klonen werden getest op de verwijdering van ROP18. De ouderlijke stam controle positief is voor PCR 1 (~ 400 bp) en PCR 2 (~ 650 bp) product en negatief voor PCR 3 (~ 1200 bp) en PCR 4 (~ 1300 bp) product. Een gerichte Indiase overheid knockout is positief voor de PCR2, PCR3 en pCR4 producten en is negatief voor de PCR-1 product (zie figuur 2A). Getoond zijn representatief panelen van de resultaten van PCR1 en PCR2 (bovenste paneel), PCR3 (middelste paneel), en pCR4 (onderste paneel). Klonen 3, 4, 5, 6, 8, 9 en 11 vertonen de juiste bandpatroon van PCR 1, PCR2, PCR3 en pCR4 dat een gerichte gen deletie gebeurtenis in de kloon definieert. Klonen 1, 2, 7, 10 en 12 zijn niet gendeleties evenals op andere potentiële representatieve resultaten. (C = ouderlijke controle stam Δ ku80Δhxgprt, M = grootte markers). Klik hier voor een grotere afbeelding te bekijken .

figure-results-3
Figuur 3. Overzicht van het protocol voor het opnieuw richten van het gen van belang HXGPRT verwijderen. A. strategie voor het verwijderen van de HXGPRT selecteerbare marker door een dubbele crossover homologe recombinatie gebeurtenis in de stam Δ ku80Δgoi :: HXGPRT met een ~ 1 Kbp 5 'DNA doelwit flank en een ~ 1 Kbp 3' DNA doelwit flank op plasmide pΔGOIc. De PCR strategie genotype verificatie afgebeeld met een primerpaar assay voor een PCR product (PCR5) dat de deletie omvat (niet op schaal). B. Een representatieve primerpaar om de verwijdering van de HXGPRT selecteerbare merker valideren van gra2 locus in stam Δ ku80Δgra2 :: HXGPRT. Primers GRA2 _CLF en GRA2_CxR versterken PCR5. Primers gelezen van 5 'naar 3'. C. Representatieve paneel 6TX-resistente klonen die kunnen worden verkregen na transfectie van plasmide pΔGOIc in Δ ku80Δgoi :: HXGPRT en selectie in 6TX. Clones 4, 7, 9, 11 en 12 vertonen de juiste bandpatroon van PCR5 dat overeenkomt gerichte deletie van het HXGPRT marker (~ 1,2 Kbp product beroemde en 3 'flank met geringe overlap met de 5' flank en buiten de 3' flank). Klonen 1, 2, 3, 6, 8 en 10 (de band licht) geven de verwachte bandpatroon van ongeveer ~ 3,4 Kbp die overeenkomt met de ouderlijke kloon genotype, hoewel deze klonen vertoonde een mate van weerstand tegen 6TX dat toegelaten hun keuze (dit fenotype kan soms spontaan ontstaan ​​door het stilleggen van HXGPRT expressie (zie toelichting in protocol 2.1 (stap 8) en Representatieve resultaten sectie). (C = ouderlijke controle stam Δ ku80Δgoi :: HXGPRT, M = grootte markers).w.jove.com/files/ftp_upload/50598/50598fig3large.jpg "target =" _blank "> Klik hier om een grotere afbeelding te bekijken.

figure-results-4
Figuur 4. Ontwerp van een targeting DNA molecuul aan de C-terminale uiteinde van een eiwit coderen. De strategie is gebaseerd op het vermogen van de marker HXGPRT ook fungeren als een 3'-stroomafwaartse regulerende regio. De ruggengraat van pΔGOItag is de pRS416 shuttle vector die uracil (URA) en ampicilline (AMP) selecteerbare merkers. Ingevoegd in pRS416 is ~ 1 Kbp 5 'DNA-doel flank geamplificeerd uit genomisch DNA met overlappingen van de HXGPRT minigen cassette en pRS416 met de Fgoi en Rtag primers, een ~ 1 Kbp 3' DNA-doelmateriaal flank wordt geamplificeerd uit genomisch DNA met overlappingen de HXGPRT minigen cassette en pRS416 met behulp van de F2 en R2primers en HXGPRT minigen cassette. De 5 'DNA-doelmateriaal flank vervangt het terminatiecodon met de tag (HA, Myc, His, enz.) gevolgd door een vervangend terminatiecodon. MPA + X selectie integreert de C-terminale label en een stroomafwaartse HXGPRT en verplaatst de 3 'UTR een positie na HXGPRT marker. De volgende unieke restrictie-enzym digestie sites worden toegevoegd aan de primers: RE.X (restrictie-enzym X gesneden ter) in de primer Fgoi het plasmide gesneden aan het 5 'uiteinde van de 5' DNA-doel flank en RE.Y in de R2 primer de HXGPRT minigen cassette gebruikt voor constructie van plasmiden opnieuw richten de gelabelde locus verwijderen het plasmide aan het 3'-uiteinde van het 3'-DNA-doel flank en RE.Z te snijden in de Rtag en F2 primers accijns HXGPRT de merker die de plaatsing van de 3 'UTR zal herstellen.

Discussie

Hier bieden we een protocol voor een efficiënte gen-targeting in Δ Ku80 parasietenstammen om de doeltreffende inning van genetisch gemanipuleerde nageslacht dat gerichte gendeleties, gen vervangingen en / of gelabeld genen bezitten stellen. De sequentiële uitvoering van deze werkwijzen een betrouwbare benadering voor de isolatie van mutanten parasiet die een of meer gerichte genetische manipulaties 1-3 bevatten. Terwijl de generatie van een gerichte deletie afhankelijk van meerdere factoren, het gebruik van de Δ Ku80 stam met de voorgestelde strategie en protocol verhoogt de efficiëntie en het gemak van het maken exact gedefinieerde mutante stammen van T. gondii voor functionele genomische studies.

Het genoom van T. gondii tijdens aseksuele stadia wordt haploïde. Dus een overweging te maken bij het ​​plannen van een gen te verwijderen is dat het gen niet essentieel in vitro moeten zijn. Niettemin, de efficiëntie van targeting gen knockouts in Δ Ku80 stammen is extreem hoog, en dit maakt de isolatie van mutante stammen met een ernstig verminderde replicatie tarieven. Wanneer een gerichte gen essentieel, parasieten vaak langer repliceren tijdens de selectie. Een andere belangrijke factor bij gerichte genetische manipulatie perfecte homologie ten minste 620 bp van het genomische gerichte flank moet detecteerbare gerichte integratie te verkrijgen 2. Langere homologiegebieden geven hogere efficiënties van targeting en targeting DNA flanken van ongeveer 1000 bp is een betrouwbare en efficiënte benadering 1-4. Daarom is het belangrijk dat genomic richten flanken worden gegenereerd uit dezelfde stam van T. gondii (RH, Pru) als de spanning die wordt genetisch gemanipuleerd. Onvoldoende homologie kunnen vaak leiden tot de gerichte integratie van een genomische gerichte flank, maar niet de andere. Onvolledige integratie of het uitblijven van een knock-out ma verkrijgeny ook te wijten zijn aan episomal doorzettingsvermogen. Onmiddellijk na transfectie alle targeting moleculen niet-geïntegreerde episomen, en soms richtmoleculen kunnen aanhouden als episomen vele generaties. Met behulp van doel-DNA flanken van ~ 1 Kbp en blijven parasieten voorafgaand aan re-subkloning rijdt onder selectie vaak lost problemen in verband met episomal doorzettingsvermogen.

Zodra een knock-out wordt gevalideerd en de HXGPRT marker wordt verwijderd, kan de gene targeting strategie worden herhaald op een tweede Indiase overheid om meerdere gendeleties genereren in een enkele parasiet stam 1-3. Het genereren van deleties, vervangingen of gelabeld genen kunnen ook worden bereikt door verschillende selecteerbare merkers (bleomycine, CAT, pyrimethamine resistente DHFR, etc.). Hoewel de CAT selecteerbare merker momenteel aanwezig is in het type II Δ Ku80 Pru genoom 1 is, kan deze markering worden verwijderd met behulp van de HXGPRT selectie hier beschreven protocol. In onze handen, HXGPRT selectie is de veiligste en meest efficiënte marker met het hoogste rendement richten wanneer een losse gerichte insertie voldoende robuust selectie van MPA + X medium. HXGPRT mede het enige nog nuttige benadering voor gerichte deletie van een selecteerbare merker (figuur 3) met 6-thioxanthine (6TX) selectie 2,3. Dit protocol voorziet dus de enige huidige aanpak voor het ontwikkelen van bepaalde mutantstammen met diverse gerichte genetische manipulaties.

Dit protocol biedt een waardevolle en efficiënte methode voor gerichte genetische manipulatie in Δ Ku80 stammen van Toxoplasma gondii en is van toepassing op de analyse van een enkel gen, een familie van genen, of genoom-brede functionele genomische studies. Vóór de beschikbaarheid van Δ Ku80 stammen 1,2, deze benaderingen niet sterk is wegens de ineiciëntie van deze methoden. Bijgevolg is dit protocol is breed toepasbaar voor gerichte genetische manipulatie van Toxoplasma gondii en is toegankelijk voor alle onderzoekers geïnteresseerd zijn in het aanpakken van een reeks vragen op parasiet biologie, gastheer respons, en functionele genomica.

Openbaarmakingen

De auteurs verklaren dat zij geen concurrerende financiële belangen.

Dankbetuigingen

Dit werk werd ondersteund door subsidies van de NIH naar DJB (AI041930, AI073142, AI075931 en AI091461).

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Overlap PrimersIntegrated DNA Technologies4 nmole Ultramer DNA oligos
Validation PrimersIntegrated DNA Technologies100 nmole DNA Oligo
Yeast Strain #90845ATCCDesignation FY834
Shuttle Vector pRS416ATCC87521
DH10B E. coliInvitrogen12033-015SOC bouillon in kit met E. coli
ResuspensiebufferQiagenBuffer P1 in QIAprep Spin Miniprep Kit
Miniprep KitQiagen27104QIAprep Spin Miniprep Kit
GlasperkenScientific IndustriesSI-BG050,5 mm zuurgewassen
Qiacube geautomatiseerde robotwerkstationQiagen
ElectroporatiecuvetUSA Scientific9104-50502 mm-opening
BTX600 electroporatorBTX
Maxiprep KitQiagen12662QIAprep Spin Maxiprep Kit
25 cm2 Canted halsplugafdichtingsflesCorning430168
150 cm2 Canted halsplugafdichtingsflesCorning430823
Human Foreskin Fibroblasts (HFF) cellenATCCSCRC1041
Swin-lok FilterhouderWhatman42020025-mm-diameter
MembraanWhatman110612Nucleopore Track-etched Membraan 3 mm poriëngrootte, 25-mm-diameter
Mycofenolaatzuur (MPA)Sigma
Xanthine (X)Sigma
96-well weefselkweekbakjeCorning Costar
24-well weefselkweekbakjeCorning Costar
MEM Eagle MediaLonza Biowhittaker12-611F
Foetaal runder serumGibco26140-111
Antibioticum-Antimyoticum (Anti-Anti)Gibco15240-062
SpinkolomPrimm LabsPAE-100Easy Clean DNA Extraction Spin Kit
T4 DNA LigaseNew England Biolabs
6-thioxanthineAcros Organics
Weefsel DNA MinikitQiagen51104QIAamp DNA Blood Mini Kit
Weefselkweek vries-/herstelmediaGibco126-48-010
Fosfaat gebufferde zoutoplossingHycloneSH30028.02minus calcium, minus magnesium

Referenties

  1. Fox, B. A., et al. Type II Toxoplasma gondii KU80 knockout strains enable functional analysis of genes required for cyst development and latent infection. Eukaryot. Cell. 10, 1193-1206 (2011).
  2. Fox, B. A., Ristuccia, J. G., Gigley, J. P., Bzik, D. J. Efficient gene replacements in Toxoplasma gondii strains deficient for nonhomologous end joining. Eukaryotic Cell. 8, 520-529 (2009).
  3. Fox, B. A., Bzik, D. J. Avirulent uracil auxotrophs based on disruption of orotidine-5'-monophosphate decarboxylase elicit protective immunity to Toxoplasma gondii. Infection and Immunity. 78, 3744-3752 (2010).
  4. Hortua Triana, M. A., et al. Biochemical and molecular characterization of the pyrimidine biosynthetic enzyme dihydroorotate dehydrogenase from Toxoplasma gondii. Molecular and Biochemical Parasitology. 184, 71-81 (2012).
  5. Kim, K., Weiss, L. M. Toxoplasma gondii: the model apicomplexan. Int. J. Parasitol. 34, 423-432 (2004).
  6. Gajria, B., et al. ToxoDB: an integrated Toxoplasma gondii database resource. Nucleic Acids research. 36, 553-556 (2008).
  7. Kim, K., Weiss, L. M. Toxoplasma: the next 100 years. Microbes and infection / Institut Pasteur. 10, 978-984 (2008).
  8. Butcher, B. A., et al. Toxoplasma gondii rhoptry kinase ROP16 activates STAT3 and STAT6 resulting in cytokine inhibition and arginase-1-dependent growth control. PLoS pathogens. 7, e1002236(2011).
  9. Daher, W., Klages, N., Carlier, M. F., Soldati-Favre, D. Molecular characterization of Toxoplasma gondii formin 3, an actin nucleator dispensable for tachyzoite growth and motility. Eukaryot. Cell. 11, 343-352 (2012).
  10. Fentress, S. J., et al. Phosphorylation of immunity-related GTPases by a Toxoplasma gondii-secreted kinase promotes macrophage survival and virulence. Cell Host Microbe. 8, 484-495 (2010).
  11. Musiyenko, A., Majumdar, T., Andrews, J., Adams, B., Barik, S. PRMT1 methylates the single Argonaute of Toxoplasma gondii and is important for the recruitment of Tudor nuclease for target RNA cleavage by antisense guide RNA. Cellular microbiology. 14, 882-901 (2012).
  12. Straub, K. W., Peng, E. D., Hajagos, B. E., Tyler, J. S., Bradley, P. J. The moving junction protein RON8 facilitates firm attachment and host cell invasion in Toxoplasma gondii. PLos Pathog. 7, e1002007(2011).
  13. Szatanek, T., et al. Cactin is essential for G1 progression in Toxoplasma gondii. Molecular Microbiology. 84, 566-577 (2012).
  14. Donald, R. G., Carter, D., Ullman, B., Roos, D. S. Insertional tagging, cloning, and expression of the Toxoplasma gondii hypoxanthine-xanthine-guanine phosphoribosyltransferase gene. Use as a selectable marker for stable transformation. J. Biol. Chem. 271, 14010-14019 (1996).
  15. Donald, R. G., Roos, D. S. Gene knock-outs and allelic replacements in Toxoplasma gondii: HXGPRT as a selectable marker for hit-and-run mutagenesis. Molecular and Biochemical Parasitology. 91, 295-305 (1998).
  16. Pfefferkorn, E. R., Borotz, S. E. Toxoplasma gondii: characterization of a mutant resistant to 6-thioxanthine. Exp. Parasitol. 79, 374-382 (1994).
  17. Gietz, R. D., Schiestl, R. H. Frozen competent yeast cells that can be transformed with high efficiency using the LiAc/SS carrier DNA/PEG method. Nature Protocols. 2, 1-4 (2007).
  18. Oldenburg, K. R., Vo, K. T., Michaelis, S., Paddon, C. Recombination-mediated PCR-directed plasmid construction in vivo in yeast. Nucleic Acids Res. 25, 451-452 (1997).
  19. Fox, B. A., Gigley, J. P., Bzik, D. J. Toxoplasma gondii lacks the enzymes required for de novo arginine biosynthesis and arginine starvation triggers cyst formation. Int. J. Parasitol. 34, 323-331 (2004).
  20. Roos, D. S. Molecular genetic tools for the identification and analysis of drug targets in Toxoplasma gondii. Curr. Top. Microbiol. Immunol. 219, 247-259 (1996).
  21. Roos, D. S., Donald, R. G., Morrissette, N. S., Moulton, A. L. Molecular tools for genetic dissection of the protozoan parasite Toxoplasma gondii. Methods in Cell Biology. 45, 27-63 (1994).
  22. Singh, U., Brewer, J. L., Boothroyd, J. C. Genetic analysis of tachyzoite to bradyzoite differentiation mutants in Toxoplasma gondii reveals a hierarchy of gene induction. Molecular Microbiology. 44, 721-733 (2002).
  23. vanden Hoff, M. J., Moorman, A. F., Lamers, W. H. Electroporation in 'intracellular' buffer increases cell survival. Nucleic Acids Research. 20, 2902(1992).
  24. Pfefferkorn, E. R., Bzik, D. J., Honsinger, C. P. Toxoplasma gondii: mechanism of the parasitostatic action of 6-thioxanthine. Exp. Parasitol. 99, 235-243 (2001).
  25. Mital, J., Meissner, M., Soldati, D., Ward, G. E. Conditional expression of Toxoplasma gondii apical membrane antigen-1 (TgAMA1) demonstrates that TgAMA1 plays a critical role in host cell invasion. Mol. Biol. Cell. 16, 4341-4349 (2005).

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Genvervanginghomologe recombinatieDelta ku80 stammenHXGPRT markergendelectiegerichte insertiePCR validatietransfectie van parasietenclonale isolatie

Gerelateerde artikelen