Gelijktijdig vastleggen van real-time beelden in Two Emissie Kanalen Met een Dual Camera Emission Splitting Systeem: Toepassingen op Hechting Cell

Summary

Dubbele camera emissie splitsen systemen voor twee-kleuren fluorescentie microscopie genereren real-time beeld sequenties met een uitzonderlijke optische en temporele resolutie, een eis van bepaalde levende cel proeven, waaronder parallelle plaat stroom kamer adhesietesten. Wanneer de software wordt gebruikt om beelden van simultane emissie kanalen samenvoegt, worden pseudocolored beeldsequenties geproduceerd.

Abstract

Multi-color immunofluorescentie microscopie specifieke moleculen te detecteren in de celmembraan kan worden gekoppeld met parallelle plaat stroming kamer assays mechanismen die celhechting onder dynamische stroomomstandigheden te onderzoeken. Zo kunnen kankercellen waarop meerdere fluoroforen worden doorbloed over een mogelijk reactieve substraat mechanismen van kanker metastase model. Echter, multi-kanaals enkele camerasystemen en kleurencamera's tekortkomingen vertonen in beeldopname voor real-time live cell analyse. Om deze beperkingen te overwinnen, hebben we gebruik gemaakt van een dubbele camera uitstoot splitsing systemen tegelijkertijd vangen real-time beeld sequenties van fluorescent gelabelde cellen in de stroom kamer. Dubbele camera emissie splitsen systemen filter gedefinieerde golflengte varieert in twee monochrome CCD-camera's, waardoor gelijktijdig vastleggen van twee ruimtelijk identiek, maar fluorophore-specifieke beelden. Vervolgens worden psuedocolored eenkanaals beelden gecombineerd in eenreal-time fusie sequentie die meerdere doelmoleculen kunnen onthullen op cellen snel bewegen over een van belang.

Introduction

Werkwijzen voor de analyse van moleculen op het celoppervlak, zoals immunokleuring, gebruiken probes die chemisch geconjugeerd aan fluoroforen, waardoor detectie van doelmoleculen. Live cell imaging en hydrodynamische flow-based cel adhesie testen worden meestal opgenomen met monochrome CCD-camera's ontworpen om fysiologische processen vast te leggen op de cellulaire en / of moleculair niveau ^{1, 2.} Deze camera's zijn zeer gevoelig, leveren snel frame rates (meer dan 30 frames per seconde), en bieden buitengewone temporele resolutie (als gevolg van een hoge beeldsnelheid en korte belichtingstijden). Echter, monochrome camera's slechts een enkele emissie kanaal (het detecteren van een enkele fluorofoor) om beelden te verzamelen vastleggen. Een camera emissie splitsen systemen kunnen worden opgenomen om meerdere kanalen emissie vangen maar vaak verminderen het gezichtsveld en vereisen dezelfde belichtingstijd voor beeldvorming alle kanalen. Om het volledige kleurenspectrum van cellen gelabeld met multip vastleggenle fluoroforen, een kleurencamera worden gebruikt als alternatief. Echter, kleurencamera's in het algemeen niet in staat om het gewenste temporele resolutie voor beeldvorming van levende cellen in bepaalde toepassingen. Een andere afbeeldingsinrichting is nodig voor toepassingen waarbij het de voorkeur beeld levende cellen bij verschillende golflengten met behoud van een hoge tijdsresolutie. Een van de belangrijkste experimentele toepassing is de parallelle plaat stroom kamer adhesieanalyse, waarbij cellen worden doorbloed bij fysiologisch relevante omstandigheden over een mogelijk reactieve substraat ^{1, 3.} Cellen in flow die specifieke celoppervlak-moleculen tot expressie kunnen hechten en rollen op het substraat, zoals een cel monolaag expressie adhesiemoleculen of-oppervlak geadsorbeerd extracellulaire matrixeiwitten ^{4, 5.} Rolling cellen kunnen rotatie en translatie ondergaan in een fractie van een seconde. Moleculaire functies op rollen en hechtende cellen, zoals clusters van celoppervlak moleculen, ook de potentiometeral actief reorganiseren op het celoppervlak. Zo moet beeldvormingssystemen uitzonderlijk temporele resolutie bieden (30 frames per seconde of meer en "bijna nul" blootstellingstijden) aan een sequentie van beelden die de stap-voor-stap progressie van cellen rollen ^{6, 7} illustreert genereren. Dubbele camera emissie splitsing systemen zijn in staat om aan deze eisen voor de beeldvorming van cellen gelabeld met meerdere fluoroforen.

Dual camera emissie splitsen systemen splitsen en filter fluorescentie kanalen in twee soortgelijke camera's tegelijk vastleggen twee ruimtelijk identieke maar fluorofoor-specifieke beelden met behoud van de volledige gezichtsveld. Deze technologie maakt een directe vergelijking van de opname in real-time in elk kanaal en kan de gebruiker snel schakelen tussen camera modellen met verschillende imaging-mogelijkheden. Deze functie is handig voor het maken van aanpassingen aan het vastleggen van instellingen in een camera die beter kan het systeem om vast te leggenfluoroforen met verschillende intensiteiten, levens, en extinctiecoëfficiënten ^8. In combinatie met imaging software, dubbele camera emissie splitsen systemen maken het real-time opname van live cell imaging assays in meerdere golflengten en kan in vitro testen die fluorescentie gebruikt om mobiele gedrag te bestuderen verbeteren.

Protocol

1. Software-installatie

1. Kopen StreamPix 5 Multi-Camera-software met SimulPix module of andere beeldbewerkingssoftware kan verzamelen en combineren van beelden die door monochrome CCD camera's.
2. Minimumeisen voor StreamPix 5 zijn: Een PC uitgerust met een Core 2 Duo 2,4 GHz of beter met 2 GB RAM of hoger. Een ondersteunde IEEE digitale of analoge camera en compatibel frame grabber. Windows XP/7/Vista 32 of 64 bit. Een monitor met resolutie 1024 x 768 of hoger. Een grafische adapter met goede 2D-prestaties (OCU express 16x of beter wordt aanbevolen) en 7200 RPM harde schijf voor opnamen met RAID-O-configuratie.

2. Installatie van Dual Camera systeem dat twee kleuren gelijktijdige real-time beeldvorming

1. Sluit de DC2 Photometrics emissie splitter, of soortgelijke dubbele camera emissie splitsing apparaat, aan de microscoop door het schuiven van de DC2 C-mount adapter in de video-poort van de microscope zodat de behuizing van de dichroïsche op het apparaat toegankelijk.
2. Plaats twee monochrome CCD camera's in vrouwelijke C-mount 1 en vrouwelijke C-mount 2. Identieke camera voorkeur. Soortgelijke's worden gebruikt, maar de compatibiliteit is afhankelijk interne hardware, vooral de CCD sensor.
3. Gebruik imaging software om beelden van beide camera's weer te geven. De volgende stappen (2.3.1 - 2.3.4) van toepassing op StreamPix 5 met SimulPix module en moet worden aangepast voor andere multi-camera imaging software.
   1. Open StreamPix 5 en selecteer "werkruimte" in de taak lint.
   2. Open "workspace manager" gelegen op uiterst rechts van het scherm en selecteer "nieuwe werkruimte".
   3. Na het benoemen van een camera, volg software vraagt ​​om een ​​grabber van een vooraf ingevulde lijst te selecteren. Selecteer de grabber die overeenkomen met de camera model en herhaal voor de tweede camera werkruimte. Voor de samengevoegde werkruimte, herhaal nog eens, maar "alle camera's in gebruik zijn" fout message zal verschijnen. Deze melding is normaal.
   4. Zodra de samengevoegde werkruimte is geladen, toewijzen camera's van werkruimte 1 en werkruimte 2 voor de gefuseerde werkruimte in het docking paneel zich aan de rechterzijde van het beeldscherm.
4. Lijn camera's in de dubbele camera emissie splitsysteem.
   1. Lijn camera's in heldere veld of fase contrast met de kalibratierooster verstrekt door de fabrikant met een PlanApo 40X objectief (of hoger).
   2. Licht stuurt naar de microscoop oculairs, plaats de-metallisch beklede kalibratierooster die is verstrekt door de fabrikant op de microscoop podium, en vierkant raster op de microscoop podium.
   3. Breng het rooster in beeld.
   4. Verdringen, maar verwijder deze niet, de dichroïsche behuizing om de camera 1 (bypass camera) af te stemmen. Toon het raster zonder binning en zonder automatisch schalen. Scherp op het beeld met behulp van de handmatige scherpstelling knop op C-mount-poort 1.
   5. Duw de dichroïsche behuizing in de dual channel acquisitie apparaat volledig, zodat het beeld wordt gesplitst door de dichroïsche beide camera's.
   6. Draai de drie 5/64 "set schroeven en draai de tweede camera op de vrouwelijke C-mount 2 tot de oriëntatie van het rooster is identiek in beide beelden. Gebruik van de handmatige scherpstelling knop op C-mount-poort 2, brengen het beeld van de camera 2 in beeld.
   7. Voltooi de uitlijning met behulp van het gecombineerde beeld in de samengevoegde werkruimte van de imaging software. Dit maakt het mogelijk om een ​​real-time pseudocolor overlay van de twee beelden van de kalibratierooster zien. Pas de gecombineerde beeldpositie met alleen de R / L knop aan de rechterkant van de DC2. Stel deze knop tot rechter / linker verticale begrenzing van de beelden precies is uitgelijnd.
   8. Gebruik de U / D knop om de op / neer uitlijning van het tweede beeld aan te passen totdat de horizontale spijlen goed zijn uitgelijnd.
   9. Als een lichte camera rotatie tijdens het omhoog / omlaag uitlijning plaatsvindt, juist deze kwestie door de drie 5/64 "inch sch losmakenws voor camera 2 en draaien tot het weergegeven beeld goed is uitgelijnd.

3. Voorbereiding van kankercellen voor Parallel Plate Flow Kamer adhesietest

1. Cultuur BT-20 borstkankercellen in minimaal essentieel medium (MEM) aangevuld medium compleet met 10% foetaal runderserum (FBS) en 1% penicilline-streptomycine bij 37 ° C en 5,0% _CO2 zoals eerder beschreven ^2.
2. Oogst kankercellen met een verdunde trypsine behandeling en tellen cellen met een hemocytometer.
3. Wassen en schorsen cellen op 10 ⁷ cellen / ml in 0,1% albumine uit runderserum (BSA) in DPBS met calcium en magnesium (DPBS +).
4. Verdunde primaire antilichamen, gezuiverde muizen anti-humaan CD24 en gezuiverd rat HECA-452 (anti-sialofucosylated antigenen), tot een vooraf bepaalde optimale concentratie in 0,1% BSA DPBS +. Incubeer cellen gedurende 30 min ^{9, 10.}
5. Centrifugeer cellen bij 1200 rpm om een ​​celpellet te verkrijgen. Aspitarief primair antilichaam, en was de cellen tweemaal met 0,1% BSA DBPs +.
6. Verdun secundaire antilichamen, geit anti-muis IgG AlexaFluor 568 (emissie maximum, 603 nm) en geit anti-rat IgM AlexaFluor 488 (emissie maximum, 519 nm), een vooraf bepaalde optimale concentratie in 0,1% BSA DPBS +. Incubeer de cellen gedurende 30 minuten.
7. Was de cellen tweemaal en suspendeer in 0,1% BSA in DPBS + 10 ⁶ cellen / ml in 0,1% BSA DPBS +.

4. Bereiding van reactieve substraat voor parallelle plaat stroming kamer adhesietest

1. Verbind twee stukken slang aan de inlaat-en uitlaatpoorten van de parallelle plaat stroming kamer die past in een 35 mm weefselkweekplaat. Een buis verbinden met het reservoir van gelabelde cellen gesuspendeerd in 0,1% BSA DPBS + en de andere is de spuitpomp die vloeistof zal terugtrekken op een bepaalde stroomsnelheid.
2. Sluit een vacuüm lijn naar de stroom kamer ^1.
3. Plaats de stroom kamer boven de 35 mm weefselkweek dish met een monolaag van Chinese hamster ovarium cellen die E-selectine (CHO-E). CHO-E-cellen werden gekweekt in MEM compleet medium bij 37 ° C en 5,0% _CO2 ^2.
4. Stel de stroom kamer en / of stroom kamer pakking om een adequaat vacuüm afdichting ¹ te waarborgen.
5. Trekken vloeistof uit het reservoir, het bewaken van de stroom kamer assemblage voor een goede afdichting en geen visueel bewijs van de luchtbel vorming ^1.
6. Plaats stromingskamer montage op microscoop (Leica DMI 6000B) ^1.

5. Twee kleuren Image Acquisition

1. Macht een compacte lichtbron Leica EL-6000, of soortgelijke voorziening, tot hoge intensiteit licht en koppel het genereren in een lichtgeleider. Gebruik een omgekeerde microscoop om dit licht door een combinatie filter kubus, dwz G / R (groen / rood) filter kubus, om fluoroforen van een gewenste kleur / intensiteit prikkelen.
2. Zorgen dichroic woningen is in de juiste werkstand (depressief) enis niet in de bypass mode.
3. Opereren microscoop in fluorescentie-modus en selecteer de juiste fluorescentie filter kubus (groen / rood).
4. Bepaal de belichtingstijd en winst in camera 1 (rood; 620 ± 60 nm) en camera 2 (groen; 535 ± 40 nm).
   1. Druk de dichroische om beelden in zowel de rode en groene emissie kanalen te verkrijgen. Gebruik een stromingskamer assay met cellen gelabeld met alleen de rode fluorofoor, en het verkrijgen van een beeld in het rode kanaal door het aanpassen van de belichtingstijd van de camera 1 in "live-instellingen" van de imaging software.
   2. Overeenkomen met de belichtingstijd van de camera 2 om de belichtingstijd van de camera 1. Als een beeld wordt waargenomen in het groene kanaal doorbloeding artefacten aanwezig zijn en blootstellingstijd in beide camera moet worden verminderd.
   3. Het houden van de belichtingstijd gelijk in camera 1 en camera 2, vermindering van de blootstelling tijd tot de doorbloeding artefact is niet meer zichtbaar in het groene kanaal. Stel de winst van camera 1 op de foto visibilit verbetereny in het rode kanaal indien nodig.
   4. Herhaal de stappen 5.4.1 - 5.4.3 met cellen gelabeld met alleen de groene fluorofoor, maar definiëren belichtingstijd met camera 2 op de foto om cellen in het groene kanaal zonder doorbloeding artefacten in het rode kanaal door camera 1 verzameld.
   5. Retitrate antilichamen als doorbloeding artefacten niet kunnen worden geëlimineerd ^11, of indien belichtingstijden van camera 1 en camera 2 zijn wezenlijk verschillend van dien aard dat samengevoegd beelden kunnen tijdelijk niet goed uitgelijnd zijn.
5. Gebruik imaging software om beelden gelijktijdig gevangen van twee monochrome CCD camera's in de stroom kamer experiment bekijken.
6. Beelden verzameld van beide camera's met behulp van de SimulPix module van Streampix 5 of een alternatief softwarepakket samen te voegen.
7. Gebruik digitale correctie aanpassingen in SimulPix of alternatieve software om ruimtelijk uitlijnen van de samengevoegde beelden, indien nodig. Afbeeldingen kunnen worden gecorrigeerd met de SimulPix module voor horizontale, verticaleEn rotatie instellingen.

Results

Een parallelle plaat stroom kamer adhesieanalyse werd gebruikt om een dubbele camera emissie splitsysteem die gelijktijdig gevangen real-time beeld-sequenties in twee emissie-kanalen (figuur 1) te tonen. De dubbele camera emissie splitsysteem gedetecteerd BT-20 cellen die fluorescent werden gemerkt met anti-humaan CD24 en HECA-452 (detectie sialofucosylated antigenen) monoklonale antilichamen en geschikte secundaire antilichamen (Figuur 2). Sommige rollen cellen weergegeven rode signale...

Discussion

De dubbele camera emissie splitsysteem heeft de ruimte, tijd, en optische resolutie die nodig is om hoge kwaliteit beelden vast te leggen in toepassingen waar cel of moleculaire beweging is snel. Bij het genereren van de representatieve resultaten, parameters in de dubbele camera emissie splitsysteem, waaronder software-instellingen en camera-instellingen, werden geoptimaliseerd om een ​​samengevoegde afbeelding volgorde waarin rollen en hechtende cellen waren ruimte en tijd uitgelijnd verkrijgen. Deze optimalisatie sta...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Reagens/Materiaal
BT-20 cellen	ATCC	HTB-19
CHO-E cellen	Gift van Dr. R. Sackstein (Brigham and Women’s Hospital, Harvard Medical School)
MEM	Thermo Scientific	SH30024.01
FBS	Thermo Scientific	SH30396.03
Penicilline-streptomycine	Thermo Scientific	SV30010
0.25% Trypsine / 0.1% EDTA	Thermo Scientific	SV30031.01
DPBS	Thermo Scientific	SH30028.02
DPBS+	Life Technologies	14080-055
BSA	Sigma	A9647
HECA-452 monoklonaal antilichaam	BD Biosciences	555946
Anti-humaan CD24 monoklonaal antilichaam	BD Biosciences	555426
Anti-rat IgM AlexaFluor 488	Invitrogen	A21212
Anti-muis IgG AlexaFluor 568	Invitrogen	A11004
[header]
Apparatuur
EXi Blue Fluorescerende Microscopie Digitale CCD-camera	Q Imaging	EXI-BLU-R-F-M-14-C
Retiga EXi FAST 1394 Digitale CCD-camera	Q Imaging	RET-EXi-F-M-12-C
DC2 Emissi Splitser	Photometrics	DC2
Omgekeerde Fluorescerende Microscoop	Leica	DMI6000 B
Streampix 5 software	Norpix