Kwantitatieve en tijdelijke controle van zuurstof Micromilieu bij de Single Islet niveau

Summary

Microfluidic oxygen control confers more than just convenience and speed over hypoxic chambers for biological experiments. Especially when implemented via diffusion through a membrane, microfluidic oxygen can provide simultaneous liquid and gas phase modulations at the microscale-level. This technique enables dynamic multi-parametric experiments critical for studying islet pathophysiology.

Abstract

Gelijktijdige zuurstof en controle van de glucose stimulus-secretie koppeling factoren in een enkele techniek is van cruciaal belang voor het modelleren van pathofysiologische staten van eilandje hypoxie, vooral bij transplantatiepatiënten omgevingen. Standaard hypoxische kamer technieken kunnen niet beide stimulaties moduleren tegelijkertijd noch bieden real-time monitoring van glucose stimulus-secretie koppeling factoren. Om deze problemen aan te pakken, pasten wij een meerlagig microfluïdische techniek om zowel waterige als gasfase modulaties integreren via een diffusiemembraan. Dit zorgt voor een stimulatie sandwich rond de microscaled eilandjes binnen de transparante polydimethylsiloxaan (PDMS) apparaat, waardoor monitoring van de genoemde koppeling factoren via fluorescentie microscopie. Bovendien is de gasinvoer gecontroleerd door een paar microdispensers, die kwantitatieve sub minuten modulaties zuurstof tussen 0-21%. Deze intermitterende hypoxie wordt toegepast op een nieuw fenomeen eiland onderzoekent preconditionering. Bovendien, gewapend met multimodale microscopie, waren we in staat om te kijken naar gedetailleerde calcium en K _ATP-kanaal dynamiek tijdens deze hypoxie. We zien microfluïdische hypoxie, vooral deze simultane dual fase techniek, als een waardevol instrument bij het ​​bestuderen eilandjes evenals vele ex vivo weefsels.

Introduction

Dynamische hypoxie is belangrijk in de biologie, specifiek voor transplantaties

Dynamische hypoxie is een belangrijke fysiologische en pathofysiologische parameter in vele biologische weefsels. Wijziging zuurstof, bijvoorbeeld een krachtige ontwikkeling signaal in angiogenese. Bovendien, ruimtelijke en temporele patronen in hypoxie moduleren HIF1-alfa en rollen in ziekten zoals pancreaskanker. Hypoxie is ook een verstorende factor die van invloed eilandje transplantatie uitkomsten. Onlangs, tijdelijk oscillaties van hypoxie, of intermitterende hypoxie (IH) hebben aangetoond voordelen in "conditioneringscycli" eilandjes ^1. Echter, ....

Protocol

1. Preparing the Mouse Islets

1. Dissect C57BL/6 mice and isolate islets by collagenase digestion and Ficoll density gradient separation. (Refer to JOVE articles referenced in^2,3).
2. Incubate islets in RPMI-1640 medium containing 10% FBS, 1% penicillin/streptomycin, and 20 mM HEPES in Petri dishes (37 °C, 5% CO₂). Post-isolation, culture islets for 24 hr prior to use in experiments. Use the islets within 1-2 days to ensure consistent results.

2. Making the Microfluidic Platform

1. Generate the microstructure geometries on transparency photomasks for each device layer: 1) inlet....

Results

Central to this islet hypoxia technique is the ability to modulate aqueous and gaseous phase stimulation in the same microfluidic chamber with minute-scale transients. Figure 1 is a representative result of the a) dual stimulations and b) fast modulations measured within the islet chamber. Aqueous modulation, shown by introduction of fluorescein into the chamber, achieves equilibrium in three to four minutes of mixing. Furthermore, oxygen can be stepped from 5-21% with fast transients, enabling cycling o.......

Discussion

The multiple modalities integrated in this islet hypoxia technique present several points noted here for troubleshooting. First the isolated islets continue to degrade and disintegrate in culture due to digestive enzymes from acinar cells. Standardizing experiments to 1-2 days after islet isolation is thus critical in obtaining consistent results. Second, the aqueous flow was stopped during hypoxia and intermittent hypoxia to prevent convective clearance at the boundary between laminar flow and diffusion. This seems to l.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Reagent/Material
Spinner	Laurell	WS-400
SU8	MicroChem	SU8-2150/SU8-2100
Digital Hotplate	PMC Dataplate	722A
UV Curing Lamp	OmniCure	S1000
PMDS	Dow Chemical	Sylgard 184
Corona Wand	ETP	BD-20AC
Vacuum Chamber	Bel-Art	420220000
Microdispensers	The Lee Company	IKTX0322000A
5 V and 20 V DC Power	Radio Shack
NI USB	National Instrument	NI USB-6501
Thermometer	Omega Engineering, Inc.
Peristaltic Pump	Gilson	Minipulse 2
Oxygen Sensor	Ocean Optics	NeoFox
Fraction Collector	Gilson	203
Pippette	Fisher Scientific	Finnpipette II 100μl
Inverted Epifluorescence Microscope	Leica	DMI 4000B
50 ml Conical Tubes	Fisher Scientific
Fura-2 Fluorescence Dye	Molecular Probes, Life Technologies
Rhodamine 123 Fluorescence Dye	Molecular Probes, Life Technologies
Culture Media	Sigma-Aldrich	RPMI-1640
HEPES	Sigma-Aldrich
Glucose	Sigma-Aldrich
Bovine Serum Albumin	Sigma-Aldrich
30 in Silicone Tubings	Cole-Parmer		1/16 in x 1/8 in
1.5 ml Eppendorf Tubes	Fisher Scientific
Y-connectors	Cole-Parmer		1/16 in and 4 mm
Syringe Connectors	Cole-Parmer		female Luer plug 1/16 in
Straight Connectors	Cole-Parmer		1/16 in
Elbow Connector	Cole-Parmer		1/16 in