Microfluïdische zuurstofcontrole biedt meer dan alleen gemak en snelheid ten opzichte van hypoxische kamers voor biologische experimenten. Vooral wanneer geïmplementeerd via diffusie door een membraan, kan microfluïdische zuurstof gelijktijdige vloeistof- en gasfase-modulaties op microschaalniveau bieden. Deze techniek maakt dynamische multi-parametrische experimenten mogelijk, die cruciaal zijn voor het bestuderen van eilandjespathofysiologie.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Kwantitatieve en tijdelijke controle van zuurstof Micromilieu bij de Single Islet niveau
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Gelijktijdige zuurstof en controle van de glucose stimulus-secretie koppeling factoren in een enkele techniek is van cruciaal belang voor het modelleren van pathofysiologische staten van eilandje hypoxie, vooral bij transplantatiepatiënten omgevingen. Standaard hypoxische kamer technieken kunnen niet beide stimulaties moduleren tegelijkertijd noch bieden real-time monitoring van glucose stimulus-secretie koppeling factoren. Om deze problemen aan te pakken, pasten wij een meerlagig microfluïdische techniek om zowel waterige als gasfase modulaties integreren via een diffusiemembraan. Dit zorgt voor een stimulatie sandwich rond de microscaled eilandjes binnen de transparante polydimethylsiloxaan (PDMS) apparaat, waardoor monitoring van de genoemde koppeling factoren via fluorescentie microscopie. Bovendien is de gasinvoer gecontroleerd door een paar microdispensers, die kwantitatieve sub minuten modulaties zuurstof tussen 0-21%. Deze intermitterende hypoxie wordt toegepast op een nieuw fenomeen eiland onderzoekent preconditionering. Bovendien, gewapend met multimodale microscopie, waren we in staat om te kijken naar gedetailleerde calcium en K ATP-kanaal dynamiek tijdens deze hypoxie. We zien microfluïdische hypoxie, vooral deze simultane dual fase techniek, als een waardevol instrument bij het bestuderen eilandjes evenals vele ex vivo weefsels.
Inleiding
Dynamische hypoxie is belangrijk in de biologie, specifiek voor transplantaties
Dynamische hypoxie is een belangrijke fysiologische en pathofysiologische parameter in vele biologische weefsels. Wijziging zuurstof, bijvoorbeeld een krachtige ontwikkeling signaal in angiogenese. Bovendien, ruimtelijke en temporele patronen in hypoxie moduleren HIF1-alfa en rollen in ziekten zoals pancreaskanker. Hypoxie is ook een verstorende factor die van invloed eilandje transplantatie uitkomsten. Onlangs, tijdelijk oscillaties van hypoxie, of intermitterende hypoxie (IH) hebben aangetoond voordelen in "conditioneringscycli" eilandjes 1. Echter, ....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
1. De muizeneilandjes voorbereiden
- Dissecteer C57BL/6-muizen en isoleer eilandjes door collageenase-digestie en scheiding op Ficoll-dichtheidsgradiënt. (Raadpleeg JOVE-artikelen vermeld in2,3).
- Incubeer eilandjes in RPMI-1640-medium bevattend 10% FBS, 1% penicilline/streptomycine en 20 mM HEPES in petrischalen (37 °C, 5% CO2). Cultiveer de eilandjes 24 uur na isolatie voor gebruik in experimenten. Gebruik de eilandjes binnen 1-2 dagen om consistente resultaten te garanderen.
2. De Microfluidische Platform maken
- Genereer de microstructuren geometrieën op transparante fotomaskers ....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
Centraal in deze techniek voor islet-hypoxie is het vermogen om stimulatie van de waterige en gasvormige fase in dezelfde microfluïdische kamer te moduleren met transiënten op minuut-schaal. Figuur 1 toont een representatief resultaat van de a) dubbele stimulaties en b) snelle modulaties gemeten binnen de islet-kamer. De waterige modulatie, aangetoond door de introductie van fluoresceïne in de kamer, bereikt een evenwicht na drie tot vier minuten mengen. Bovendien kan zuurstof met snelle transiënten word.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
De meerdere modaliteiten geïntegreerd in deze eilandjehypoxietechniek presenteren verschillende punten die hier opgemerkt worden voor probleemoplossing. Ten eerste blijven de geïsoleerde eilandjes zich degraderen en desintegreren in cultuur vanwege spijsverteringsenzymen uit acinaire cellen. Het standaardiseren van experimenten tot 1-2 dagen na eilandje-isolatie is dus cruciaal om consistente resultaten te verkrijgen. Ten tweede werd de vloeistofstroom gestopt tijdens hypoxie en intermitterende hypoxie om convectief klar.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs verklaren dat zij geen concurrerende financiële belangen hebben.
Dankbetuigingen
Dit werk werd ondersteund door de National Institutes of Health Grants R01 DK091526 (JO), NSF 0852416 (DTE) en Chicago Diabetes Project.
....Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| Reagens/Materiaal | |||
| Spinner | Laurell | WS-400 | |
| SU8 | MicroChem | SU8-2150/SU8-2100 | |
| Digitaal verwarmingsplaat | PMC Dataplate | 722A | |
| UV-uithardingslamp | OmniCure | S1000 | |
| PMDS | Dow Chemical | Sylgard 184 | |
| Corona-wand | ETP | BD-20AC | |
| Vacuumkamer | Bel-Art | 420220000 | |
| Microdispensers | The Lee Company | IKTX0322000A | |
| 5 V en 20 V DC-voeding | Radio Shack | ||
| NI USB | National Instrument | NI USB-6501 | |
| Thermometer | Omega Engineering, Inc. | ||
| Peristaltiekpomp | Gilson | Minipulse 2 | |
| Zuurstofsensor | Ocean Optics | NeoFox | |
| Fractiecollector | Gilson | 203 | |
| Pipet | Fisher Scientific | Finnpipette II 100μl | |
| Omgekeerde epifluorescentiemicroscoop | Leica | DMI 4000B | |
| 50 ml kegelbuisjes | Fisher Scientific | ||
| Fura-2 fluorescentiekleurstof | Molecular Probes, Life Technologies | ||
| Rhodamine 123 fluorescentiekleurstof | Molecular Probes, Life Technologies | ||
| Kweekmedium | Sigma-Aldrich | RPMI-1640 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | ||
| Glucose | Sigma-Aldrich | ||
| Rundseraserumalbumine | Sigma-Aldrich | ||
| 30 inch siliconen slangen | Cole-Parmer | 1/16 inch x 1/8 inch | |
| 1,5 ml Eppendorfbuisjes | Fisher Scientific | ||
| Y-connectors | Cole-Parmer | 1/16 inch en 4 mm | |
| Spuitconnectoren | Cole-Parmer | vrouwelijke Luer-plug 1/16 inch | |
| Rechte connectoren | Cole-Parmer | 1/16 inch | |
| Bochtconnector | Cole-Parmer | 1/16 inch |
Referenties
- Lo, J. F., Wang, Y., et al. Islet Preconditioning via Multimodal Microfluidic Modulation of Intermittent Hypoxia. Anal. Chem. 84 (4), 1987-1993 (2012).
- Qi, M., Barbaro, B., Wang, S., Wang, Y., Hansen, M., Oberholzer, J. Human Pancreati....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
