Methodenartikel

Kwantitatieve en tijdelijke controle van zuurstof Micromilieu bij de Single Islet niveau

DOI:

10.3791/50616

⸱

17 november 2013

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Mechanical Engineering, University of Michigan-Dearborn, 2Department of Surgery/Transplant, University of Illinois at Chicago, 3Department of Bioengineering, University of Illinois at Chicago

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Microfluïdische zuurstofcontrole biedt meer dan alleen gemak en snelheid ten opzichte van hypoxische kamers voor biologische experimenten. Vooral wanneer geïmplementeerd via diffusie door een membraan, kan microfluïdische zuurstof gelijktijdige vloeistof- en gasfase-modulaties op microschaalniveau bieden. Deze techniek maakt dynamische multi-parametrische experimenten mogelijk, die cruciaal zijn voor het bestuderen van eilandjespathofysiologie.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Gelijktijdige zuurstof en controle van de glucose stimulus-secretie koppeling factoren in een enkele techniek is van cruciaal belang voor het modelleren van pathofysiologische staten van eilandje hypoxie, vooral bij transplantatiepatiënten omgevingen. Standaard hypoxische kamer technieken kunnen niet beide stimulaties moduleren tegelijkertijd noch bieden real-time monitoring van glucose stimulus-secretie koppeling factoren. Om deze problemen aan te pakken, pasten wij een meerlagig microfluïdische techniek om zowel waterige als gasfase modulaties integreren via een diffusiemembraan. Dit zorgt voor een stimulatie sandwich rond de microscaled eilandjes binnen de transparante polydimethylsiloxaan (PDMS) apparaat, waardoor monitoring van de genoemde koppeling factoren via fluorescentie microscopie. Bovendien is de gasinvoer gecontroleerd door een paar microdispensers, die kwantitatieve sub minuten modulaties zuurstof tussen 0-21%. Deze intermitterende hypoxie wordt toegepast op een nieuw fenomeen eiland onderzoekent preconditionering. Bovendien, gewapend met multimodale microscopie, waren we in staat om te kijken naar gedetailleerde calcium en K ATP-kanaal dynamiek tijdens deze hypoxie. We zien microfluïdische hypoxie, vooral deze simultane dual fase techniek, als een waardevol instrument bij het ​​bestuderen eilandjes evenals vele ex vivo weefsels.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dynamische hypoxie is belangrijk in de biologie, specifiek voor transplantaties

Dynamische hypoxie is een belangrijke fysiologische en pathofysiologische parameter in vele biologische weefsels. Wijziging zuurstof, bijvoorbeeld een krachtige ontwikkeling signaal in angiogenese. Bovendien, ruimtelijke en temporele patronen in hypoxie moduleren HIF1-alfa en rollen in ziekten zoals pancreaskanker. Hypoxie is ook een verstorende factor die van invloed eilandje transplantatie uitkomsten. Onlangs, tijdelijk oscillaties van hypoxie, of intermitterende hypoxie (IH) hebben aangetoond voordelen in "conditioneringscycli" eilandjes 1. Echter, zowel statische als voorbijgaande hypoxie effecten op eilandje fysiologie moeten nog goed worden begrepen of bestudeerd, voornamelijk te wijten aan het ontbreken van passende hulpmiddelen voor micro eilandje te besturen.

Eilandjes zijn goed gevasculariseerd in vivo

Alvleesklier eilandjes zijn 50-400 56, m bolvormige aggregaten van endocrine cellen, waaronder beta-cellen en alfa-cellen die verantwoordelijk zijn voor glucose homeostase zijn. Wanneer eilandjes worden blootgesteld aan stimulerende glucose in het bloed, opname en glycolyse leidt tot ATP productie, die ATP-gevoelige kaliumkanaal (KATP) kanalen en resulteert in calcium influx dat de exocytose van insuline korrels triggers opent. Zuurstof is belangrijk om dit zwaar stofwisseling rijden en insuline secretie significant beïnvloed door de dynamiek van de bloedstroom en zuurstof naast glucose gradiënten. Eilandjes Dit glucose-insulinerespons gemakkelijk uitvoeren vivo ze zijn zeer geperfundeerd in de alvleesklier, ieder binnen een cel lengte van een capillair vat. Echter, de dicht netwerk van capillairen intraislet verwijderd door collagenase gedurende eilandje isolatie 2,3. Bijgevolg worden zowel zuurstof en voedingsstoffen levert beperkt tot een 100 urn omtrek door diffusie beperkingen.

stap "> De huidige technieken hebben beperkt succes in het herscheppen van eilandje micromilieu

Inheemse zuurstof en glucose dynamiek, de sleutel tot het modelleren van fysiologische en pathofysiologische omstandigheden recreëren eilandje is, is moeilijk te bereiken met standaard hypoxische kamers die uitgebreide stroom nodig hebben en gebrek aan continue monitoring van eilandje functies. Bovendien transplantatie therapie voor type I diabetes geïsoleerde eilandjes blootstellen aan hypoxie in het hepatische portaalsysteem 4 die veel lager pO 2 (<2%, 5-15 mmHg) heeft vergeleken met fysiologische pancreas (5.6%, 40 mmHg). Na de transplantatie, het eilandje enten neem twee weken of meer te gerevasculariseerd. Het is aangetoond dat hypoxische blootstelling schaadt glucose-insuline koppelingsmechanisme eilandje's. Onder de stimulus-secretie koppeling factoren, calcium signalering, mitochondriale potentials, en insuline kinetiek kan gemakkelijk worden gecontroleerd met behulp van microfluidics. Onze vorige microfluïdische techniek gedemonstreerd deze real-time monitoring met nauwkeurige modulatie van de waterige micro-omgeving rond enkele eilandje 5,6. Echter, kwantificering van hypoxische bijzondere eilandje wordt gehinderd door het ontbreken van gelijktijdige stimulatie en controle technieken. Daarom combineren microfluïdische controle van zuurstof en eilandje monitoring kan eilandje hypoxie studies te verbeteren.

Microfluidics kan recreëren en moduleren de waterige en zuurstof micromilieu

De standaardtechniek voor weefsel-kweek en hypoxie is gebaseerd op hypoxische kamers. In het algemeen, de hypoxische kamers bieden enkele zuurstofconcentraties met verevening keer in ~ 10-30 min, onverenigbaar met minuten opgeschaald dynamische hypoxie. Twee recente studies gebruikten kleine aangepaste kamers voor intermitterende hypoxie blootstelling op de hele muizen, met tegenstrijdige resultaten op glucose geïnduceerde insuline respons 7,8. Houd in gedachten dat op het gehele dier niveau, de ingeademde zuurstof niet direct trangepland om capillaire eilandje pO 2, als gevolg van controles in de luchtwegen. Bovendien hebben deze studies niet gestandaardiseerd zuurstofgehalte, noch hebben zij real-time maatregelen op het weefsel niveau van de eilandjes.

Aan de andere kant, kan zuurstof microfluidics deze beperkingen overtreffen door het beheersen van zuurstof via gas kanaal netwerken. Bovendien microfluidics is compatibel met live-imaging tijdens zuurstof modulatie, een prestatie moment niet mogelijk met standaard hypoxische kamers. Een aantal van deze nieuwe microfluidics benadert gebruik maken van de gas-doorlaatbaarheid van polydimethylsiloxane aan zuurstofconcentraties lossen in microkanalen die media stromen over doelcellen 9-14. Deze apparaten zijn ook geïntegreerd meerdere discrete zuurstofconcentraties, fluorescentie gebaseerde zuurstof sensoren, en zelfs chemisch zuurstof generatie on-chip.

Liquid-solvation gebaseerd microfluidics hebben een harde tijd het behoud van stabiele, continue gradiënten zoals ikt afhankelijk convectief mengen dat gevoelig is stromingsomstandigheden. Ter vergelijking: de techniek die we hier gebruiken richt zich op het verminderen van de verspreiding pad van zuurstof levering. Het gas solvatie en afschuifstroming worden geëlimineerd door direct te diffunderen zuurstof door een membraan bezaaid met cellen of weefsels eilandje. Dit verwijdert de extra microfluidics nodig om solvatie controle en voorkomt onnodige shear stress op de eilandjes, die zelf de afgifte van insuline kan leiden. Dit platform is gebruikt om reactieve zuurstof species (ROS) tonen opregulatie zowel hyperoxic en hypoxische extremen (2-97% O 2) in celkweek 1,15. Vanwege de directe levering van zuurstof en de verwijdering van schuifstroom onze-diffusie ondersteunde platform de optimale microfluïdische oplossing voor het bestuderen eilandje hypoxie.

Multimodaal stimulatie en monitoring

-Diffusie ondersteunde microfluidics brengt ook extra voordelen wanneer aangepast voor het bestuderen eilandje microphysiology. Door een membraan als een diffusiebarrière, kan de vloeistof worden geïsoleerd van de zuurstof modulaties, zodat controles waterige glucose stimulations onafhankelijk van hypoxische stimulaties. Dit creëert een sandwich-achtige simultane stimulatie die ruimtelijk pin-punten levering aan de eilandjes. Bovendien, als het gas wordt tijdelijk gemoduleerd via geautomatiseerde microinjectors, kunnen we de zuurstofconcentratie moduleren 21-0% digitaal met voorbijgaande tijd minder dan 60 sec. De dynamische elementen van zuurstof en glucose micromilieu in de microscoop mogelijk een real-time multimodale protocol dat onmogelijk of buitengewoon omslachtig zou zijn met standaard hypoxische kamers. Met behulp van dit apparaat, werden calcium signalering (Fura-AM), mitochondriale potentials (Rhodamine 123), en insuline kinetiek (ELISA) gecontroleerd om een ​​compleet beeld van de dynamische glucose-insuline respons onder hypoxie bieden.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. De muizeneilandjes voorbereiden

  1. Dissecteer C57BL/6-muizen en isoleer eilandjes door collageenase-digestie en scheiding op Ficoll-dichtheidsgradiënt. (Raadpleeg JOVE-artikelen vermeld in2,3).
  2. Incubeer eilandjes in RPMI-1640-medium bevattend 10% FBS, 1% penicilline/streptomycine en 20 mM HEPES in petrischalen (37 °C, 5% CO2). Cultiveer de eilandjes 24 uur na isolatie voor gebruik in experimenten. Gebruik de eilandjes binnen 1-2 dagen om consistente resultaten te garanderen.

2. De Microfluidische Platform maken

  1. Genereer de microstructuren geometrieën op transparante fotomaskers voor elke apparaatlaag: 1) inlaat en uitlaat, 2) Glucose-microfluidische laag met perifusiekamer (8 mm diameter x 3 mm, 150 μl), 3) 200 μm membraan met microwellen (500 μm diameter, 100 μm diep), en 4) gas-microfluidische lagen.
  2. Om de inlaat- en uitlaatlaag te fabriceren, giet gedegasseerde, voorgemengde PDMS tot een hoogte van 1,5 mm in een blanco petrischaal en laat 2 uur uitharden bij 80 °C. Prik inlaat-/uitlaatpoorten met een diameter van 2 mm.
  3. Om de glucose-microfluidische laag te fabriceren, draai twee lagen van 350 μm SU8-2150 om een enkele laag van 700 μm te vormen op een 4 inch siliconen wafer.
    1. Blootstel UV-licht door de juiste fotomasker om het microkanaalpatroon over te brengen op de SU8 na ontwikkeling, waardoor een master van 700 μm hoog ontstaat.
    2. Giet gedegasseerde, voorgemengde PDMS op deze master tot een hoogte van 3 mm en laat 2 uur uitharden bij 80 °C. Snijd deze PDMS met een scheermes in de gewenste vorm.
    3. Prik inlaat-/uitlaatpoorten met een diameter van 2 mm en de kamer met een diameter van 8 mm.
  4. Om de 200 μm membraan met microwellen te fabriceren, draai SU8-2100 tot 100 μm. Pas dezelfde UV-litografie toe om het microwellenpatroon over te brengen op deze master van 100 μm hoog.
    1. Draai gedegasseerde, voorgemengde PDMS op deze master bij 900 rpm gedurende 30 sec en laat 10 min uitharden bij 80 °C. Draai een tweede laag bovenop de eerste onder dezelfde omstandigheden, resulterend in een 200 μm PDMS-membraan met microwellenpatronen.
    2. Prik inlaat-/uitlaatpoorten met een diameter van 2 mm door dit membraan
  5. Om de gas-microfluidische laag te fabriceren, draai SU8-2100 tot 100 μm. Pas dezelfde UV-litografie toe om de gas-microfluidische patronen over te brengen op deze master van 100 μm hoog.
    1. Giet gedegasseerde, voorgemengde PDMS op deze master tot een hoogte van 1,5 mm en laat 2 uur uitharden bij 80 °C. Snijd de PDMS met een scheermes in de gewenste vorm.
    2. Prik inlaat-/uitlaatpoorten met een diameter van 2 mm door deze laag
  6. Om de meerdere lagen te verbinden, bereid ze voor door ze schoon te maken met scotchtape, bloot te stellen aan een coronaboog en vervolgens met de hand te richten in de volgende volgorde.
    1. Verbind het membraan met de onderste gaslaag met de microwellen naar boven.
    2. Verbind de glucose-microfluidische laag bovenop het membraan met microwellen.
    3. Verbind de inlaat- en uitlaatlaag bovenop het geheel, waardoor de hele assemblage wordt ingekapseld.
    4. Versterk de binding door er 1 kg gewicht bovenop te leggen en 3 uur te bakken bij 100 °C.
  7. Test het voltooide apparaat op lekkage door water in de waterige laag te laden en het hele apparaat onder water te dompelen. Laat vervolgens lucht door de gaslaag stromen met een lege spuit.
  8. Steriliseer de lekvrije apparaten met 70% ethanol door de waterige laag en spoel daarna met PBS-buffer, waarin het apparaat bij 4 °C wordt bewaard tot gebruik.

3. Microdispenser Setup

  1. Verkrijg 2 microdispensers, 5 V en 20 V DC-voedingen en een digitale I/O-kaart om de zuurstofmix- en afleveringssetup te bouwen.
    1. Verbind de besturingsleidingen van de microdispensers met de meegeleverde driver-eenheden.
    2. Verbind de drivers met de digitale I/O-kaart op poorten die overeenkomen met Labview-bediening.
    3. Verbind de 5 V en 20 V voedingen met de overeenkomstige contacten op de driver-eenheden.
    4. Verbind de digitale I/O met een laptop om Labview-codes voor gasregeling uit te voeren (bijlage).
  2. Verbind één microdispenser met stikstof en een andere met perslucht, beide met 5% CO2. Stel beide gassen in op 2 psi. Sluit de uitgangen van de dispensers aan in een T-splitsing voordat ze de microfluïdische apparaat binnenkomen.
  3. Gebruik een op lekkage geteste apparaat om de overgangsreactie van zuurstofmodulatie te karakteriseren door de microdispensers tussen 5-21% zuurstof te laten cyclussen, terwijl het opgeloste zuurstof in water wordt gemeten met een vezeloptische zuurstofsensor (zie materiaallijst en representatieve resultaten).

4. Opzetten bij de Microscopie

  1. Monteer het apparaat op de verwarmde stage op de omgekeerde microscoop.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Centraal in deze eilandhypoxietechniek is de mogelijkheid om vloeibare en gasvormige fasestimulatie in dezelfde microfluïdische kamer te moduleren met tijdschalen van enkele minuten. Figuur 1 is een representatief resultaat van de a) dubbele stimulaties en b) snelle modulaties gemeten binnen de eilandkamer. Vloeibare modulatie, getoond door de introductie van fluoresceïne in de kamer, bereikt evenwicht in drie tot vier minuten mengen. Verder kan zuurstof worden geschakeld van 5-21% met snelle overgangen,...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De meerdere modaliteiten geïntegreerd in deze eilandjehypoxietechniek presenteren verschillende punten die hier opgemerkt worden voor probleemoplossing. Ten eerste blijven de geïsoleerde eilandjes zich degraderen en desintegreren in cultuur vanwege spijsverteringsenzymen uit acinaire cellen. Het standaardiseren van experimenten tot 1-2 dagen na eilandje-isolatie is dus cruciaal om consistente resultaten te verkrijgen. Ten tweede werd de vloeistofstroom gestopt tijdens hypoxie en intermitterende hypoxie om convectief klar...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs verklaren dat zij geen concurrerende financiële belangen hebben.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit werk werd ondersteund door de National Institutes of Health Grants R01 DK091526 (JO), NSF 0852416 (DTE) en Chicago Diabetes Project.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Reagens/Materiaal
SpinnerLaurellWS-400
SU8MicroChemSU8-2150/SU8-2100
Digitaal verwarmingsplaatPMC Dataplate722A
UV-uithardingslampOmniCureS1000
PMDSDow ChemicalSylgard 184
Corona-wandETPBD-20AC
VacuumkamerBel-Art420220000
MicrodispensersThe Lee CompanyIKTX0322000A
5 V en 20 V DC-voedingRadio Shack
NI USBNational InstrumentNI USB-6501
ThermometerOmega Engineering, Inc.
PeristaltiekpompGilsonMinipulse 2
ZuurstofsensorOcean OpticsNeoFox
FractiecollectorGilson203
PipetFisher ScientificFinnpipette II 100μl
Omgekeerde epifluorescentiemicroscoopLeicaDMI 4000B
50 ml kegelbuisjesFisher Scientific
Fura-2 fluorescentiekleurstofMolecular Probes, Life Technologies
Rhodamine 123 fluorescentiekleurstofMolecular Probes, Life Technologies
KweekmediumSigma-AldrichRPMI-1640
HEPESSigma-Aldrich
GlucoseSigma-Aldrich
RundseraserumalbumineSigma-Aldrich
30 inch siliconen slangenCole-Parmer1/16 inch x 1/8 inch
1,5 ml EppendorfbuisjesFisher Scientific
Y-connectorsCole-Parmer1/16 inch en 4 mm
SpuitconnectorenCole-Parmervrouwelijke Luer-plug 1/16 inch
Rechte connectorenCole-Parmer1/16 inch
BochtconnectorCole-Parmer1/16 inch

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Lo, J. F., Wang, Y., et al. Islet Preconditioning via Multimodal Microfluidic Modulation of Intermittent Hypoxia. Anal. Chem. 84 (4), 1987-1993 (2012).
  2. Qi, M., Barbaro, B., Wang, S., Wang, Y., Hansen, M., Oberholzer, J. Human Pancreatic Islet Isolation: Part I: Digestion and Collection of Pancreatic Tissue. J. Vis. Exp.. , e1125(2009).
  3. Qi, M., Barbaro, B., Wang, S., Wang, Y., Hansen, M., Oberholzer, J. Human Pancreatic Islet Isolation: Part II: Purification and Culture of Human Islets. J. Vis. Exp.. , e1343(2009).
  4. Shapiro, A. M., et al. Islet Transplantation in Seven Patients with Type 1 Diabetes Mellitus Using a Glucocorticoid-Free Immunosuppressive Regimen. N. Engl. J. Med. 343 (4), 230-238 (2000).
  5. Adewola, A. F., Wang, Y., Harvat, T., Eddington, D. T., Lee, D., Oberholzer, J. A Multi-Parametric Islet Perifusion System within a Microfluidic Perifusion Device. J. Vis. Exp.. , e1649(2010).
  6. Mohammed, J. S., Wang, Y., Harvat, T. A., Oberholzer, J., Eddington, D. T. Microfluidic device for multimodal characterization of pancreatic islets. Lab Chip. 9, 97-106 (2009).
  7. Carreras, A., Kayali, F., Zhang, J., Hirotsu, C., Wang, Y., Gozal, D. Metabolic Effects Of Intermittent Hypoxia In Mice: Steady Versus High Frequency Applied Hypoxia Daily During The Rest Period. AJP - Regu Physiol. 303 (7), 700-709 (2012).
  8. Lee, E. J., et al. Time-dependent changes in glucose and insulin regulation during intermittent hypoxia and continuous hypoxia. Eur. J. Appl. Physiol. , (2012).
  9. Kane, B. J., Zinner, M. J., Yarmush, M. L., Toner, M. Liver-specific functional studies in a microfluidic array of primary mammalian hepatocytes. Anal. Chem. 78, 4291-4298 (2006).
  10. Lam, R. H. W., Kim, M. C., Thorsen, T. Culturing aerobic and anaerobic bacteria and mammalian cells with a microfluidic differential oxygenator. Anal. Chem. 81, 5918-5924 (2009).
  11. Polinkovsky, M., Gutierrez, E., Levchenko, A., Groisman, A. Fine temporal control of the medium gas content and acidity and on-chip generation of series of oxygen concentrations for cell cultures. Lab Chip. 9, 1073-1084 (2009).
  12. Mehta, G., et al. Quantitative measurement and control of oxygen levels in microfluidic poly(dimethylsiloxane) bioreactors during cell culture. Biomed. Microdev. 9 (2), 123-134 (2007).
  13. Vollmer, A. P., Probstein, R. F., Gilbert, R., Thorsen, T. Development of an integrated microfluidic platform for dynamic oxygen sensing and delivery in a flowing medium. Lab Chip. 5, 1059-1066 (2005).
  14. Chen, Y., et al. Generation of oxygen gradients in microfluidic devices for cell culture using spatially confined chemical reactions. Lab Chip. 11, 3626-3633 (2011).
  15. Lo, J. F., Sinkala, E., Eddington, D. T. Oxygen gradients for open well cellular cultures via microfluidic substrates. Lab Chip. 10, 2394-2401 (2010).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Microfluidic HypoxiaOxygen ModulationIslet IsolationFluorescence MicroscopyPDMS DeviceGas Permeable MembraneCalcium DynamicsKATP ChannelIntermittent HypoxiaGlucose Stimulus

Gerelateerde artikelen