Geoptimaliseerde protocollen voor<em&gt; Mycobacterium leprae</em&gt; Strain Management: Bevroren Stock Behoud en onderhoud in Athymische Naakt Muizen

Samenvatting

Mycobacterium leprae, de verwekker van lepra, niet groeien in vitro. We beschrijven een eenvoudig te protocol volgen om een bacillaire schorsing voor te bereiden op het onderhoud van grote hoeveelheden M. verzekeren leprae voor verschillende toepassingen. Protocollen voor vermeerdering door muis voetzool inenting, de evaluatie van de levensvatbaarheid, invriezen en ontdooien bacillaire voorraad worden in detail beschreven.

Samenvatting

Lepra, veroorzaakt door Mycobacterium leprae, is een belangrijke infectieziekte die nog endemisch is in vele landen over de hele wereld, waaronder Brazilië. Er zijn geen bekende methoden voor het kweken van M. leprae in vitro, de presentatie van een belangrijk obstakel in de studie van deze ziekteverwekker in het laboratorium. Daarom is de handhaving en groei van M. leprae-stammen worden bij voorkeur uitgevoerd in athymische naakt-muizen (NU-Foxn1 ^nu). De laboratoriumomstandigheden bij muizen zijn direct beschikbaar, gemakkelijk uit te voeren en laat standaardisatie en ontwikkeling van protocollen voor het bereiken van reproduceerbare resultaten. In dit rapport beschrijven we een eenvoudig protocol voor zuivering van bacillen van naakt muis voetzolen met trypsine, die een suspensie met minimale celafval en hoge bacteriële levensvatbaarheid index oplevert, zoals bepaald met fluorescentiemicroscopie. Een wijziging van de standaard methode voor bacillaire tellen door Ziehl-Neelsenvlekken en lichtmicroscopie wordt ook gedemonstreerd. Verder beschrijven we een protocol voor invriezen en ontdooien bacillaire voorraden alternatief protocol voor onderhoud en opslag van M. leprae stammen.

Inleiding

Lepra, een ziekte die wordt veroorzaakt door Mycobacterium leprae, is een belangrijk probleem voor de volksgezondheid in vele landen over de hele wereld ^1,2. Ondanks het feit dat bekend staat als een infectieziekte die zowel de huid en perifere zenuwen beïnvloedt, zijn er nog steeds hiaten in kennis over de betrokken bij complexe immunopathogenese van ziektemechanismen.

Onder de uitdagende kenmerken van M. leprae dat haar studie belemmeren zijn het onvermogen om te groeien in kunstmatige voedingsbodems en de relatief lange verdubbeling tijd (ongeveer 14 dagen) ^3,4. Meest experimentele procedures die M. gebruiken leprae worden opgezet met bacillen gezuiverd van huidletsels van lepra patiënten of van experimentele diermodellen, zoals gordeldieren en verscheidene stammen van muizen ^5,6.

Al vele jaren hebben onderzoekers afhankelijk van zuivering van M. leprae van huidletsels van multibacillaire LepRosy patiënten voor gebruik bij experimentele procedures. Verschillende laboratorium voor de in vitro kweek of onderhouden van levende M. leprae zijn geprobeerd, maar tot op heden, hebben diermodellen bleek het meest geschikt voor onderzoeksdoeleinden worden. In de jaren 1960 en 1970, begonnen de onderzoekers met behulp van muizen en gordeldieren voor de detectie en beoordeling van M. leprae levensvatbaarheid, controle bacteriegroei in reactie op anti-M leprae drugs, en de groei en het onderhoud van mycobacteriële stammen ^2,4.

De diermodellen hebben een aantal beperkingen, vooral in gordeldieren en niet-menselijke primaten, waaronder ethische bezwaren, kosten van onderhoud, speciale infrastructuur die nodig is voor het onderhoud van dieren, en een slechte reproduceerbaarheid van de resultaten en de uiteindelijke opbrengsten. Momenteel muizen zijn de voorkeursmodel dier voor lepra onderzoek. De laboratoriumomstandigheden bij muizen zijn direct beschikbaar, gemakkelijk uit te voeren en laat gestandaardiseerde protocollen ^{7,8,9. Naakt muizen zijn gebruikt bij het ​​onderhoud van M. leprae stammen omdat, zelfs bij lage levensvatbaar bacillaire belastingen, de T-cel deficiënte immuunrespons leidt tot uitbundige granuloomvorming en goede bacillaire vermenigvuldiging. Zo heeft dit diermodel opgedaan brede acceptatie binnen de melaatsheid onderzoeksgemeenschap.}

In dit rapport beschrijven we een eenvoudig protocol voor enzymatische zuivering van bacillen uit naakt muis voetzolen, die bestemd zijn voor de bereiding van een M. leprae ophanging met minimale cel puin en met een hoge bacteriële levensvatbaarheid index. De levensvatbaarheid wordt bepaald door fluorescentie microscopie, die snel kan worden uitgevoerd in het laboratorium. We tonen ook aan een wijziging van de standaard methode voor het bacillaire tellen door koude Ziehl-Neelsen kleuring en lichtmicroscopie. Bovendien presenteren we een alternatief protocol voor onderhoud en opslag van M. leprae stammen, waardoor invriezen en ontdooien van bacillaire stocks.

Protocol

1. Voorbereiding van Mycobacterium leprae Suspension

1. Voordat euthanizing de athymische naakt muis (NU-Foxn1 ^nu), de voorbereiding van de trypsine-oplossing en cultuur media (Protocol van de reagentia - Protocollen 1, 2, en 3). Euthanaseren het naakt muizen 4-5 maanden na inenting met M. leprae volgens de AVMA Richtlijnen voor de euthanasie van dieren: 2013 Edition ¹⁰ (de experimenten en het gebruik van afbeeldingen van dieren werden goedgekeurd en uitgevoerd in overeenstemming met de richtlijnen van de Animal Care Comite van Faculdade de Odontologia de Bauru, USP). Binnen een biologische veiligheid kabinet gebruikt voor de behandeling van dieren, het reinigen van de gehele muis met 70% ethanol alcohol.
2. Houd de achterste poot behulp hemostatische tang distaal van het spronggewricht. Snijd de poot eraf met een schaar onder de tang en dompel de poot in 2% jodium gedurende 20 minuten. Herhaal vervolgens de procedure voor de andere achterpoot.
3. Breng de poten aan eenschoon biologische veiligheid kabinet voor verdere werkzaamheden. Neem poten uit de 2% jodium, droog ze af met een steriel gaasje en verzamel de twee voetzolen met behulp van nummer 22 of 23 scalpel, het verwijderen van alle weke delen (dermis, epidermis, pezen en zenuwen) in de buurt van het bot. Verwijder de middenvoetsbeentjes botten en de 1e en 5e vingerkootjes. Plaats het materiaal in een steriele petrischaal en verwijder de epidermis, door schrapen het af met de scalpel. Snijd het weefsel in kleine stukjes met een schaar en deze overbrengen naar een ronde bodem buis. Gewicht van het weefsel en voeg 1 ml Hanks Balanced Salt Solution (HBSS). Houd de buis op ijs te voorkomen opwarming van het monster.
4. Voeg nog een 1 ml HBSS en homogeniseren van het monster met behulp van een weefselhomogenisator.
   1. Eerste homogenisering cyclus: 3 pulsen van 15 seconden op snelheid 4 (14.450 rpm).
   2. Breng het supernatant in een steriele 50 ml conische buis, het door een cel zeef om de resterende vuil weg. Laat de oplossing voorbij graviteit.
   3. Voeg een extra 2 ml HBSS, en herhaal de homogenisering cyclus (paragraaf 1.4.1), en laat de monsters door de cel zeef weer.
   4. Spoel de zeef door het toevoegen van HBSS om het volume op 9 ml brengen. Gooi de cel zeef.
5. Ontdooi een hoeveelheid van 0,5% trypsine oplossing. Voeg 1 ml van trypsine aan de 9 ml celsuspensie tot een eindconcentratie 0,05% trypsine verkrijgen. Gooi overgebleven ontdooid trypsine. Incubeer gedurende 60 min in een 37 ° C waterbad. Na incubatie, breng het volume tot 40 ml door toevoeging van steriele zoutoplossing om het trypsine te verdunnen.
6. Centrifugeer bij 1700 xg gedurende 30 min bij 4 ° C.
7. Verwijder het supernatant door voorzichtig het buisje. Resuspendeer de pellet door de buis te tikken en voeg 1 ml steriele zoutoplossing. Breng de suspensie naar een nieuwe conische buis meten van het uiteindelijke volume van de ophanging (om de opbrengst / gram weefsel te berekenen).
8. Meng de bacillaire schorsing met een 1 ml insuline spuit met een 26 G naald tijdens het overbrengen van de suspensie naar een nieuwe buis.
9. Voer microbiologische controle van de suspensie door het plaatsen van 2 druppels (50 ul) van het in elke drager: 7H9 en Lowenstein-Jensen en incubeer bij 37 ° C gedurende 30 dagen, voor de detectie van verontreinigende mycobacteriën. Evenzo inoculeren een Brain Heart Infusion (BHI) en incubeer gedurende 24 uur bij 37 ° C, voor de detectie van verontreinigende aërobe bacteriën.
10. Aliquot de schorsing in buizen voor kleuring: 35 pl voor Cold Ziehl-Neelsen (Protocol 2), en 200 ul voor levensvatbaarheid bepaling (Protocol nr. 3).
11. Na Ziehl-Neelsen (ZN) Bereken het aantal zuurvaste bacillen / ml (AFB / ml). Voor naakt muizen inenting, bereiden een 1 x 10 ⁸ AFB / ml suspensie, zorg ervoor dat u voldoende volume tot 30 ul / voetzool / dier (Protocol 5) te enten hebben, en houden de schorsing koud tot inenting. Voor bevriezing, bereiden een 1 x 10 ⁷ AFB / ml suspensioen (Protocol 4).

2. Koude Ziehl-Neelsen kleuring

1. Voordat de kleuring, bereid de serum / fenoloplossing en ZN kleuringsvloeistoffen (Protocol reagentia - Protocollen 4 en 5). Teken drie cirkels (binnendiameter 10 mm) op drie glasplaatjes met een immunohistochemie pen. Identificeer de dia's: (1) normaal of onverdund, (2) 01:10, en (3) 1:100 met een nummer 2 potlood (Waarschuwing: sommige grafiet verdwijnt na ZN kleuring).
2. Verdun de bacillaire suspensie (stap 1.10) tot 1:10 en 1:100 verdunningen, dwz voeg 5 pl onverdund schorsing en 45 pi zoutoplossing, neem dan 5 ul van 01:10 en voeg 45 ul van zoutoplossing.
3. Voeg 5 ul van het serum / fenol-oplossing en 10 gl bacillaire suspensie per cirkel. Mengen en gelijkmatig rond het gebied van de cirkel met de steel van een wegwerp lus. Wacht tot de schorsing te drogen op een waterpas tafel.
4. Na drying, fix het uitstrijkje door het passeren van de dia 3 keer in de blauwe vlam van een bunsenbrander (ongeveer 20 sec totaal) ^11.
5. Voor kleuring, het gehele oppervlak van de slede met gefilterde Ziehl-Neelsen carbofuchsine (ongeveer 5 ml) gedurende 20 minuten.
6. Spoel de dia in stromend water (slow flow).
7. Bedek de dia met een 10% zure alcoholoplossing gedurende 20 sec.
8. Was de dia weer stromend water.
9. Bedek de dia met een methyleenblauw-oplossing gedurende 5 minuten.
10. Spoel de dia in stromend water en laat het drogen op kamertemperatuur.
11. Count 20 velden / cirkel (totaal 60 velden / dia) met een 100X olie immersie objectief. De berekening van zuurvaste bacillen / ml (AFB / ml) wordt als volgt uitgevoerd volgens de beschrijving in de laboratoriumtechnieken voor Lepra ^12:
    AFB / veld = totaal aantal bacillen in de 3 cirkels (60 velden) gedeeld door 60.
    AFB / ml = AFB / veld x constant (oppervlakte van de cirkelx 100 gedeeld door oppervlak van de doelstelling lensopening), en het tellen van een verdunde suspensie, vermenigvuldigt het aantal AFB / ml met de verdunningsfactor (10 of 100).

3. Levensvatbaarheid Bepaling

1. Voordat u begint, bereiden de autoclaaf M. leprae schorsing (Protocol van de reagentia - Protocol nr. 7). Gebruik de juiste kit (zie tabel van de reagentia en apparatuur) voor kwalitatieve bepaling van M. leprae levensvatbaarheid in de suspensie. Verdun de oplossing als volgt (alle procedures moeten onder gedimd licht worden uitgevoerd): verdun oplossing A met een factor 10 in zoutoplossing (1 pl voorraad plus 9 pi zoutoplossing), verdunde oplossing B 20 met een factor in een zoutoplossing (1 pl voorraad plus 19 pi zoutoplossing).
2. Voeg 3,6 gl verdunde oplossing A en 6 pi van verdunde oplossing B 200 pl van de suspensie bacillaire te testen (stap 1.10). Een eerder geautoclaveerde M. leprae suspensie wordt routinematig gebruikt alsegatief controle levensvatbaarheid kleuring.
3. Incubeer de suspensies gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur in het donker.
4. Centrifugeer de buis bij 10.600 xg gedurende 5 minuten bij 4 ° C.
5. Verwijder het supernatant en resuspendeer de pellet in 15 pl 10% glycerol. Solliciteer 8 pi aan het oppervlak van een schoon glasplaatje en bedek het met een kleine dekglas. Analyseer de dia met behulp van een fluorescentiemicroscoop, met de toepasselijke filters (zie Molecular Probes aanbevelingen). Evalueer de resultaten door het vergelijken Syto 9 (Sy) kleuring aan jodide (PI) kleuring propidium.
   Opmerking: Sy vlek penetreert 100% van zowel dood als levend bacteriën, en PI vlek penetreert alleen bacteriën met beschadigde membranen. De autoclaaf suspensie (negatieve controle) kunnen groepjes bacteriën door de aanwezigheid van cellulair afval vormen. De semi-kwantitatieve schaal gebruikt voor live / dead evaluatie varieert 0-2 +, 0 geeft aan dat minder dan 30% van de cellen zijn positief voor PI vlek; 1 + betekent tussen 30 -50% van de cellen positief zijn voor PI vlek, 2 + betekent meer dan 50% van de cellen positief zijn voor PI kleuring. Een score van 0 wordt beschouwd als het meest geschikt voor gebruik.

4. Invriezen / ontdooien M. leprae Suspension

1. Voordat u begint, bereiden de bevriezing medium (Protocol van de reagentia - Protocol nr. 6). Voor invriezen, gebruik dan de onderstaande stappen:
   1. Voeg 150 ul van de suspensie bevattende 1 x 10 ⁷ AFB / ml in een steriele cryovial met 1 ml ijskoud medium.
   2. Plaats de Cryovial in een bevriezing container en de container bewaren bij -80 ° C gedurende 24 uur.
   3. Breng de bevroren flesje om een ​​opbergdoos en op te slaan bij -80 ° C.
2. Voor het ontdooien, gebruik dan de onderstaande stappen:
   1. Verwijder de cryovial met de bevroren schorsing van -80 ° C en plaats deze in een 37 ° C waterbad om te beginnen met het ontdooien van de schorsing.
   2. Giet de suspensie in een buis met 20 ml sterielzoutoplossing. Meng de suspensie voorzichtig tot het ontdooien is voltooid.
   3. Centrifugeer de suspensie gedurende 30 minuten bij 1700 xg bij 4 ° C.
   4. Verwijder het supernatant en voeg genoeg steriele zoutoplossing om het gewenste volume te bereiken. Homogeniseren van de schorsing door het door een injectiespuit (stap 1.8).
   5. Voor ZN kleuring, levensvatbaarheid vastberadenheid en inenting, volgen protocollen 2, 3 en 5.

5. Muis Enten

1. Twee mensen zijn nodig voor deze procedure, een om de muis en ander te beperken tot het inoculum te beheren. Het dier moet worden ingeënt moeten worden behandeld volgens de ethische richtlijnen en regelgeving en alle procedures moeten door de institutionele Animal Care en gebruik Comite worden goedgekeurd. Beperken het naakt muis door het nekvel met de poten naar boven.
2. Homogeniseren van de schorsing door het door een 26 G naald. Met een 1 ml spuit, zuig genoeg bacillaire schorsing inoculate twee voetzolen (30 ul / voetzool).
3. Houd de achterpoot Reinig de voetzool met 70% ethanol alcohol vóór injectie en voeren de naald intradermaal met de afschuining van de naald omhoog gericht, van de proximale naar de distale zijde van de voetzool. Injecteer 30 pl van de suspensie. De voetkusseninjecties kan worden uitgevoerd in verdoofde muizen.
4. Wacht 5 seconden voordat de naald uit de huid door oprisping van het inoculum te voorkomen. Muizen moeten worden gehuisvest op zacht beddengoed na inenting, en het lopen en tekenen van zelfverminking te worden gecontroleerd.

Resultaten

Het succes van het protocol kan worden beoordeeld op drie manieren. Eerst wordt de evaluatie van de kwaliteit van het inoculum bepaald door de hoeveelheid cellulair afval en de resulterende percentage levensvatbare bacillen in de eindsuspensie (zie Protocol 3). Zoals getoond in figuren 1 en 2, de laatste bacillaire suspensie bevatte weinig celafval en hoge levensvatbaarheid (score 0 +), dat de meeste bacillen gekleurd met Syto 9 green fluorescent vlek (vlek penetreert 100% van dood of levend bacteriën, figuur 1) en slechts een paar bacillen gekleurd met de rode PI fluorescerende vlek (vlek penetreert alleen bacteriën met beschadigde membranen, figuur 2).

Figuur 1. Syto 9 kleuring van M. leprae schorsing. Groene fluorescentie toont de aanwezigheid van levend en dood M. leprae. 400X.

Figuur 2. PI kleuring van M. leprae schorsing. Rode fluorescentie toont het kleine aantal doden M. leprae. 400X.

Ten tweede zal een inoculum met een hoge levensvatbaarheid beïnvloeden de vermenigvuldiging van bacillen in de voetkussens van de dieren na 4-5 maanden na inoculatie met de ontwikkeling van duidelijke macroscopische laesies, zoals in de video (protocol 1). De derde manier om het succes van het protocol bepalen is door het evalueren van de overleving en vermenigvuldiging van AFB in muizen geïnoculeerd met voetkussens bacillen die voor verschillende perioden was bevroren (zie protocol 4).

"Cellspacing =" 0 "> Experiment (dier) Aantal AFB / ml bevroren op dag 0 Levensvatbaarheid score / dag 0 Invriezen periode (dagen) Aantal AFB geënt na invriezen Levensvatbaarheid score na invriezen Aantal AFB / ml herstelden na 7 maanden 1 (1) 1,0 x 10 ⁷ 0 + 60 1,7 x 10 ⁵ 1 + 2,3 x 10 ⁸ 1 (2) 1,0 x 10 ⁷ 0 + 60 1,7 x 10 ⁵ 1 + 3,8 x 10 ⁷ 1 (3) 1,0 x 10 ⁷ 0 + 60 1,7 x 10 ⁵ 1 + 8,5 x 10 ⁷ 1 (4) 1,0 x 10 ⁷ 0 + 60 1,7 x 10 ⁵ 1 + 4,6 x 10 ⁷ 2 (1) 1,0 x 10 ⁷ 0 + 15 4,2 x 10 ⁵ 1 + 1,7 x 10 ⁷ 2 (2) 1,0 x 10 ⁷ 0 + 15 4,2 x 10 ⁵ 1 + 4,8 x 10 ⁶ 2 (3) 1,0 x 10 ⁷ 0 + 15 4,2 x 10 ⁵ 1 + 8,6 x 10 ⁶ 3 (1) 1,0 x 10 ⁷ 0 + 15 1,7 x 10 ⁵ 1 + 1,2 x 10 ⁷ 3 (2) 1,0 x 10 ⁷ 0 + 15 1,7 x 10 ⁵ 1 + 1,8 x 10 ⁷ 3 (3) 1,0 x 10 ⁷ 0 + 15 1,7 x 10 ⁵ 1 + 1,8 x 10 ⁷ 3 (4) 1,0 x 10 ⁷ 0 + 15 1,7 x 10 ⁵ 1 + 2,6 x 10 ⁷ 3 (5) 1,0 x 10 ⁷ 0 + 15 1,7 x 10 ⁵ 1 + 3.7 x 10 ⁶

Tabel 1. Resultaten van M. leprae vermenigvuldiging met behulp van na bevriezing schorsingen.

Tabel 1 toont resultaten van M. leprae groei met behulp van schorsingen na invriezen. De levensvatbaarheid score van de schorsingen na het ontdooien was 1 +. De bevriezing protocol werd uitgevoerd in drie onafhankelijke experimenten uitgevoerd op verschillende periodes bevriezing testen. In beide experimenten met inocula voor 15 of 60 dagen ingevroren, was het resultaat vergelijkbaar, propagation na bevriezing leverde 10-1000 keer verhoogde het aantal AFB teruggewonnen uit elke voetzool na 7 maanden inoculatie (tabel 1). Daarom is de bevriezing van M. leprae schorsingen in 7H9 medium aangevuld met OADC (oliezuur-albumine-dextrose-catalase) resulteerde in het onderhoud van de levensvatbaarheid.

Drie inocula werden gebruikt voor de evaluatie M. leprae vermenigvuldiging na twee perioden invriezen (15 en 60 dagen). Na 7 maanden, werden bacillen hersteld van voetzooltjes van geïnoculeerde muizen en geteld na Ziehl-Neelsen kleuring. Semiquantitatieve levensvatbaarheid schaal: 0 betekent afwezig tot 30% van de PI gekleurde cellen; 1 + betekent dat tussen de 30-50% van de PI gekleurde cellen; 2 + betekent meer dan 50% van de PI gekleurde cellen. AFB: zuurvaste bacillen.

Discussie

Een gedetailleerde beschrijving van een goed geïllustreerd succesvol protocol voor propagatie van M. leprae is hard nodig. Onze studie toont aan dat het protocol van inoculum voorbereiding door middel van filtratie en trypsinedigestie laat de inocula worden verkregen met zeer weinig cellulaire puin en met een hoge levensvatbaarheid van bacillen (score 0 +). Natriumhydroxide werd gebruikt om het weefsel voor zuivering van bacillen ⁶ splitsen. Studies uitgevoerd in ons laboratorium met behulp van natriumhydroxide voor de zuivering van M. leprae resulteerde in de vorming van klompjes bacillen, belemmeren de homogenisering van de suspensie op levensvatbaarheid bepaling en dierlijke inoculatie (gegevens niet getoond).

Mogelijke problemen met het inoculum voorbereiding door filtratie en trypsine digestie onder grote hoeveelheid cellulair afval en verontreiniging van het inoculum met bacteriële of fungale middelen. In het geval van grote hoeveelheden cellulaire Debrwordt waargenomen na zuivering, ofwel de trypsine niet meer actief is of er een overmatige hoeveelheid biologisch materiaal. Enzymatische activiteit van trypsine voorraadoplossing worden geëvalueerd. Als overmatige hoeveelheid eerste biologisch materiaal wordt vermoed, moet het materiaal worden verdeeld in porties en het protocol moet in afzonderlijke partijen worden uitgevoerd. Om verontreiniging van het inoculum met bacteriële of fungale middelen vermijden, moet erop worden gelet dat het materiaal onder aseptische omstandigheden verwerken. Als schimmel-en / of bacteriële besmetting worden geconstateerd, wordt de schorsing moet worden weggegooid.

Een beperking van ons protocol is de subjectiviteit van de levensvatbaarheid evaluatie met behulp van de beschreven semi-kwantitatieve methode. Levensvatbaarheid semi-kwantitatief bepaald is praktischer, hoewel minder nauwkeurig is dan de gepubliceerde kwantitatieve methode ^6. Levensvatbaarheid score van 0 + en 1 + bevredigend zijn voor het onderhoud van de vermeerdering en de bevriezing vanM. leprae. Lahiri et al.. hebben reeds aangetoond dat naakt muizen ingeënt met 80-90% haalbaar inoculum, resulteren in voetzolen geschikt voor het oogsten (hoog levensvatbaarheid bacillen) 4-5 maanden van inenting. Daarom vroeg infectie (ongeveer 4 maanden) is de beste oogsttijd. Voor het oogsten van bevroren inocula, werden de muizen in het huidige protocol geïnoculeerde gehandhaafd voor een langere periode (7 maanden) te groeicurves garanderen. Een kritische stap voldoende levensvatbaarheid is het gebruik van verse bacillen suspensies, bij voorkeur binnen 24 uur na afname van biologisch materiaal van de gastheer en verwerking. Bovendien is de kwaliteit van de reagentia, vers bereide verdunde trypsine en levensvatbaarheid kleuring oplossingen zijn nodig om reproduceerbare resultaten te garanderen.

Een andere beperking van dit protocol is dat de uiteindelijke M. leprae schorsing is niet vrij van gastheer-DNA, RNA, eiwitten, enz. Daarom moeten andere zuiveringsstappen worden toegevoegd to het verkrijgen van een M. leprae schorsing vrij van gastheercel componenten.

Een methode voor het behoud van levensvatbare bacillen door bevriezing hele weefselmonsters van M. leprae laesies gerapporteerd ^9. De studie van Portaels et al.. toonde significant verlies van levensvatbaarheid, variërend van 65-97% na invriezen en ontdooien van M. leprae besmet weefselmonsters verkregen van gordeldier ^9. Het protocol aangetoond dat de levensvatbaarheid index waargenomen in M. leprae suspensies na invriezen en ontdooien gedaald in vergelijking met de hoeveelheid die niet waren ingevroren (tabel 1). Inderdaad, het bevriezen van de M. leprae schorsing in de vrieskou media leverde levensvatbaarheid variërend 50-70%, waarbij de levensvatbaarheid score 1 +, terwijl de levensvatbaarheid score 0 + werd verkregen in de niet-bevroren schorsing. Niettemin, de vermenigvuldiging van M. leprae was bevredigend na 7 maanden na de enting van naakt muizen ( Tabel 1). De inoculatie van muizen met naakt gereconstitueerde monsters wordt ingevroren gedurende 60 dagen resulteerde in gemiddeld 100 keer verhoogde het aantal bacillen vergelijking met de oorspronkelijke inoculum. Het blijkt dat het bevriezen van de M. leprae suspensie in vriesmedium plaats van geïnfecteerde weefselmonsters, efficiënter. Een kritische stap in ons protocol is de langzame bevriezing van de AFB in een ijskoude container noodzakelijk de bacillen levensvatbaar te houden, zoals aangetoond door Colston en Hilson ^8. Toekomstige experimenten zullen worden uitgevoerd om de levensvatbaarheid van bacillen beoordelen na langere tijd bevriezen.

Kortom, omdat M. leprae groeit niet in vitro ons protocol maakt gemakkelijk alternatief voor instandhouding van levensvatbare inoculum en de succesvolle bevriezingsstap maakt de handhaving van stammen zonder permanente passage bij dieren, waardoor de instelling van een bank van gedefinieerde stammen.

Dit gedeelte bevat instructies voor het bereiden van reagentia om dit protocol uit te voeren.

1. Trypsine

Trypsine	0,5 g
Gedestilleerd water	tot 100 ml

Filter steriliseren. Bewaren bij -20 ° C.

2. 7H9

7H9 bouillon base	4,7 g
40% glycerol voorraad	5 ml
Gedestilleerd water	tot 900 ml

Meng de basis met water en voeg dan de glycerol onder roeren. Autoclaaf bij 121 ° C gedurende 20 minuten te steriliseren. Bewaren bij 4 ° C.

3. Brain Heart Infusion (BHI)

BHI	37 gr
Gedestilleerd water	tot 1000 ml

Autoclaaf bij 121 ° C gedurende 15 minuten te steriliseren. Bewaren bij 4 ° C.

4. Fenol serum

4.1) 5% fenol

Fenol	5 ml
Gedestilleerd water	tot 100 ml

4.2) Serum fenol

foetaal runderserum	2 ml
5% fenol	98 ml

Bewaren bij 4 ° C.

5. Oplossingen voor koude Ziehl-Neelsen Stain

5.1) CarboFuchsin

Fuchsin	1 g
Fenol kristallen gefuseerd aan 60 ° C	5 ml
Zuivere ethylalcohol	10 ml
Gedestilleerd water	tot 100 ml

Filter voor elk gebruik.

5.2) methyleenblauwactieve Base

Methyleenblauwactieve	3 g
95% ethylalcohol	tot 200 ml

5.3) Alcohol zuur

70% alcohol	990 ml
chloridric zuur	10 ml

6. Medium voor invriezen:

OADC	10 ml
Glycerol	20 ml
7H9 medium	tot 100 ml

Autoclaveer glycerol voor gebruik en steriliseer OADC door filtratie.

7. Geautoclaveerde M. leprae schorsing

Autoclaaf bij 121 ° C gedurende 20 minuten. Bewaren bij -20 ° C.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
BacLight Bacterial Viability Kit	Invitrogen; Molecular Probes	L7007
Hanks' balanced Salt Solution (HBSS)	Sigma	H9269
Cryo 1 °C Freezing Container	Nalgene	5100001
Lowenstein-Jensen medium	LB Laborclin	901122
Saline	TEK Nova Inc	S5812
Pen	Dako	S2002
Centrifuge tube 50 ml/conical base	TPP	91050
Cell strainer  - 40 µm Nylon	BD Falcon	352340
Trypsin	Sigma	T-7409
Middlebrook 7H9 Broth Base	Sigma-Aldrich	M0178 Fluka
Glycerol	Gibco BRL	15514011
Brain heart infusion (BHI)	Oxoid LTDA	CM1135
Fuchsin	Merck Millipore	1159370025
Phenol	Invitrogen	15509037
Ethyl alcohol	Merck Millipore	EX02764
Cloridric acid	Merck	1131349010
BBL Middlebrook OADC (oleic acid-albumin-dextrose-catalase)	Becton Dickinson	211886
Fetal bovine serum	Gibco; LifeTechnologies	26140079