Motor Nerve doorsnijding en Time-lapse beeldvorming van gliacellen Gedrag Live zebravis

Samenvatting

Hoewel het perifere zenuwstelsel (PNS) in staat is om significant herstel na een blessure, is weinig bekend over de cellulaire en moleculaire mechanismen die dit fenomeen regeren. Met behulp van levende, transgene zebravis en een reproduceerbare zenuw doorsnijding test, kunnen we dynamische gliacel gedrag te bestuderen tijdens zenuw degeneratie en regeneratie.

Samenvatting

Het zenuwstelsel wordt vaak beschreven als een hard-bedraad deel van het lichaam, zelfs al is een aanzienlijk vloeistof orgaansysteem dat reageert op externe stimuli op een consistente, stereotype wijze behoud ongelooflijke flexibiliteit en plasticiteit. Anders dan het centrale zenuwstelsel (CNS), het perifere zenuwstelsel (PNS) in staat is significant herstel, maar we nog maar net begonnen om de cellulaire en moleculaire mechanismen die dit fenomeen worden beheerst. Met behulp van zebravis als model systeem, hebben we de unieke kans om paar regeneratieve studies met in vivo beeldvorming en genetische manipulatie. Perifere zenuwen uit axonen omgeven door lagen van glia en bindweefsel. Axonen omhuld door myelinating of niet-myeliniserende Schwann-cellen, die op hun beurt verpakt in een bosje door een cellulaire schede genoemd perineurium. Na een blessure, volwassen perifere zenuwen hebben de opmerkelijke capaciteit om remove beschadigd axonale puin en re-innervate doelen. Om de rol van alle perifere glia in PNS regeneratie onderzoeken, beschrijven we hier een axon doorsnijding test die een commercieel beschikbaar stikstof-gepompte dye laser gebruikt om motorische zenuwen axotomize in levende transgene zebravis. We verder de methoden deze experimenten beschrijven paar om time-lapse imaging van gewonde en controle zenuwen. Deze experimentele paradigma kan worden gebruikt om niet alleen de rol van glia Spel zenuwregeneratie, maar ook de basis kan zijn voor het ophelderen van de moleculaire mechanismen die zenuwstelsel reparatie regelen beoordelen.

Inleiding

Zebravis zijn uitgebreid gebruikt om de ontwikkeling van het zenuwstelsel vanwege hun optische doorlatendheid bestuderen en het gemak van transgenese die wanneer gekoppeld, zorgen voor spectaculaire beeldvorming van dynamische cel gedrag in een levend embryo. Bovendien, omdat zebravis en zoogdieren delen vrijwel alle genen die voor zenuwstelsel vorming cellulaire en moleculaire informatie in dit modelorganisme verzameld is rechtstreeks relatable andere vertebraten. Hoewel ongelooflijk krachtig voor neurale ontwikkelingsstudies, de zebravis en de unieke eigenschappen hebben het potentieel om ook mechanismen handhaven en herstellen het zenuwstelsel na verwonding helderen. Zebravis larven behouden hun doorschijnendheid tot in de late larvale stadia en pigmentatie effectief kan worden geblokkeerd met ofwel het gebruik van farmacologische remmers van melanine productie of genetische mutanten die pigment cellen missen. Dus, met behulp van dit model organisme om letsel en regenereren studerenion bij oudere dieren is mogelijk en biedt de unieke kans om de cellulaire en moleculaire mechanismen die het zenuwstelsel te herbouwen direct te onderzoeken. In dit manuscript, beschrijven we hoe ze efficiënt en reproduceerbaar verwonden zenuwen in de PNS van zebravis larven. Dit paradigma schade leent zich niet alleen degeneratie bestuderen, maar ook de reacties van perifere glia en immuuncellen evenals de interacties tussen deze populaties tijdens de regeneratie.

Het PNS is een complex netwerk van motorische en sensorische zenuwen die noodzakelijk gegevens tussen het centrale zenuwstelsel (CNS) en de huid, spieren en organen van het lichaam voorbij is, waardoor een organisme te communiceren met de omgeving en overleven. Langs deze zenuwen, perifere glia, waaronder niet-myeliniserende en myeliniserende Schwann-cellen en perineurial glia, alsmede bindweefsel, omsluiten de axons en vormen uiteindelijk de volwassen zenuw. Verwondingen van deze zenuwen initieert een proces known als Wallerian degeneratie ^10. Dit mechanisme van axonale fragmentatie, immuun werving, puin opruimen en regeneratie is zeer stereotiep en genetisch gereguleerd ^1. Eerdere studies in zoogdieren systemen zijn de rollen van Schwann-cellen beschreven tijdens zenuw degeneratie en regeneratie ^{1, 2, 6, 8.} In deze studies van vaste weefsel of celkweek, Schwann-cellen niet alleen geworven macrofagen om de schade ter plaatse om te helpen bij afval ophalen, maar ook geholpen in myeline fagocytose zelf. Hoewel deze studies ongelooflijk informatief zijn geweest, hebben we nooit eerder gevisualiseerd gliale reacties op perifere axon schade in vivo in real-time, en geen andere studies hebben de relatie tussen de verschillende klassen van perifere glia onderzocht tijdens deze evenementen.

Onlangs hebben diverse laboratoria Wallerian degeneratie onderzocht met behulp van zebravis en laser-gemedieerde axon verwonding vergelijkbaar met wat we hier beschrijven ^{4, 5, 7, 9. In een aantal van deze studies werden oppervlakkige sensorische axonen axotomized bij jonge larven met behulp van een custom-built, twee-foton confocale microscoop 4, 5, 9. In een andere studie, die is zeer vergelijkbaar met onze eigen, werden dieper axonen binnen het ventrale motorische zenuw doorgesneden in 5 dagen oude larven met behulp van een in de handel verkrijgbaar laser ablatie systeem 7. In beide experimentele set-ups, de focus lag op Wallerian degeneratie en beide axonen en afweercellen werden afgebeeld. Te breiden op deze onderzoeken, beschrijven we verwonden motorische axonen in oudere larven met meer volwassen, gemyeliniseerde zenuwen en test de respons van alle zenuw-geassocieerde perifere glia tijdens degeneratie en regeneratie.}

Hiervoor doorsnijden we motorische zenuwen in 6 en 7 dagen na de bevruchting (DPF) larven en reacties van individuele gliale populaties visualiseren en de interacties tussen deze populaties samen gewonde axonen onderzoeken. Met behulp van dubbele en driedubbele transgenic lijnen die label perifere glia, zoals Schwann-cellen en perineurial glia, alsmede een merker voor axons, gebruiken we een commercieel beschikbare laserablatie bestaande uit een stikstof-gepompte dye laser (golflengte 435 nm) aan een draaiende schijf confocale systeem om axon doorsnijdingen creëren. Dit maakt experimentele set-up ons om live, larvale zebravis visualiseren, te verwonden specifieke perifere motorische axon image time-lapse van de reacties van de verschillende gliale bevolkingsgroepen traktaten en axon letsel en hun relatie tot elkaar. Dit protocol kan verder worden aangepast zenuwletsel in zebravis van verschillende leeftijden maken met verschillende transgene lijnen of genetische mutanten om verschillende wetenschappelijke vragen te beantwoorden.

Protocol

1. Voorbereiding en Plaatsing van zebravis embryo's voor Ablation en Live-Imaging

1. Bereid een voorraad van 0,8% laag smeltpunt agarose in ei water. Aliquot in 13X 100 mm wegwerp cultuur buizen en bewaar bij 4 ° C totdat het nodig is.
2. Cross volwassen zebravissen met stabiel geïntegreerd transgenen te fluorescent labelen motorische neuronen en gliacellen soorten rente. Verzamel zebravis embryo's in ei water en plaats in 28.5 ° C incubator voor de juiste enscenering later ^3.
3. Om ongeveer 24 uur na de bevruchting (HPF), verwijder ei water en voeg 0,002% 1-fenyl 2-thio (PTU) in ei water. Terug's naar de incubator.
4. Tussen 24 en 96 HPF moet embryo's onderzocht op de aanwezigheid van gewenste transgenen op een fluorescerende ontleden scope. Plaats geselecteerde embryo's in zoet PTU ei water en terug te keren naar de incubator.
5. Als larven 6 dagen na de bevruchting (DPF) (of gewenste tijd) hebben bereikt, verwijder ze uit de couveuse, Selecteert u een paar larven voor de montage, en overbrengen naar een kleinere schaal.
6. Verwijder het water uit de schotel en onmiddellijk te vervangen met ongeveer 0,02% Tricane in PTE ei water. Laat larven zitten in verdoving ongeveer 5 minuten.
7. Een hoeveelheid van 0,8% laag smeltpunt agarose in een bekerglas met kraanwater en een magnetron voor 30 seconden, of tot de agarose is gesmolten. Laat het bekerglas afkoelen tot de agarose in de cultuur buis voelt lauw aanvoelt (niet heet).
8. Selecteer een verdoofde larve en overbrengen naar een enkel-of multi-well 35 mm glazen bodem schaal. Verwijder eventueel water dat werd overgedragen aan de larve, dan onmiddellijk bedekken de larve met voldoende warme agarose aan de glazen bodem gedeelte van de schotel te vullen maar niet een grote koepel te creëren.
9. Aangezien de agarose verhardt, gebruikt een dissectie naald de larve op zijn kant plaatsen aan de bodem van de schaal, kantel de larve net iets op zijn rug. Het is absoluut noodzakelijk om de schade en de daaropvolgende beeldvorming, datde gemonteerde larve raken het glas op de bodem van de schaal. Gebruik het ontleden naald om de larve in deze positie handhaven tot de agarose is gestold en de larve wordt geïmmobiliseerd.
10. Nadat de agarose volledig is uitgehard, langzaam pipet genoeg Tricane water (dit kan dezelfde Tricane gebruikt voor anesthesie) in de schaal volledig te bedekken de agarose en larve.

2. Laser Kalibratie en testen

1. Schakel alle confocale microscoop instrumentatie, geschikte diode lasers voor spannende zebravis transgenen, en de stikstof-gepompte dye laser. Zorg ervoor dat de "lege" beam splitter is op zijn plaats, de laser demper volledig open is, en de 435 nm Coumarine kleurstof cel is op zijn plaats. Op de computer, opent imaging software.
2. Verplaats een 63x 1.2NA water immersie objectief op zijn plaats en breng een kleine druppel immersie medium voor water doelstellingen op het doel. Een 63x objectief zal zorgen voor een goede laser ablatie nauwkeurigheid en water immersion zorgt voor een grotere werkafstand, die nodig is bij het werken met 6-7 dpf zebravis larven.
3. Verkrijgen van een glasplaatje met een gespiegelde kant gebruiken voor kalibratie van de laser. Plaats de dia, spiegel naar beneden, op de microscoop podium.
4. Met behulp van het oculair onder helderveld verlichting, vinden en zich richten op een kras of etsen in de spiegel. De helderveld licht zal schijnen neer op het glaasje, maar zal alleen doorgaan, om de doelstelling op plaatsen waar de spiegel is bekrast of weggeëtst, waardoor de spiegel om zwarte kijken door het oculair en de etsen te kijken als vlekken of lichtlijnen.
5. Bekijk en richten de etsen op het computerscherm met behulp van beeldbewerkingssoftware. Open het venster dat de laser kalibratie-en energie-instellingen regelt. Het aantal pulsen op "1" en de demping plaat "3"% transmissie. Het aantal pulsen is het aantal keren dat de laser flitst binnen elk gebied van belang (ROI) en het% transmissie vertegenwoordigt het laservermogen. Zorg ervoor dat de juiste kalibratie-instelling is geselecteerd voor het 63x 1.2NA water immersie objectief.
6. Selecteer het gereedschap Ovaal van de hoofdwerkbalk, en klik op het beeld op het computerscherm om een ​​enkel cirkelvormig ROI te creëren. Doe dit 3 keer totdat er 4 cirkelvormige ROI willekeurig verdeeld over de afbeelding.
7. Sommige systemen kunnen onder meer een veiligheidsfunctie die niet zal toestaan ​​dat de laser te vuren als het licht pad naar de lenzen is geopend. Als dit het geval is, handmatig lichtpad de oculairen sluiten op dit moment.
8. Brand de laser. Dit zal 4 kleine vlek etsen, 1 maken binnen elke cirkelvormige ROI. Als de laser niet afgaan, controleert u of de laser is ingeschakeld en correct is aangesloten en dat het lichtpad van de lenzen is gesloten. Als de laser branden, maar geen etsen wordt gezien, controleert u of de "lege" beam splitter is op zijn plaats. Als alles op zijn plaats, verhoging van het laservermogen en "frap" tot het etsen are zichtbaar. Als een laservermogen waarin meer dan 10 noodzakelijk het glas etsen, kan deze dan het laser plasma cartridge moet worden vervangen.
9. Als de geëtste vlekken verschijnen gecentreerd binnen de geselecteerde ROI, geen kalibratie nodig is (overgaan tot 2.12). Als de vlekken niet in het midden, de kalibratie-instelling moet worden bijgewerkt.
10. Te kalibreren, klikt u op de update van de kalibratie-instelling. De laser gaat af en er verschijnt een afbeelding met een geëtste punt. Als het punt niet verschijnt, annuleert de kalibratie, verhogen het laservermogen, en start de kalibratie.
11. Klik in het midden van de vlek. De laser zal weer vuren, en een ander punt zal verschijnen. Klik op dat punt, en herhaal dit proces totdat de kalibratie voltooid en 9 plekken verschijnen in een raster mode. Herhaal de stappen 2,6-2,9 om te controleren of de kalibratie succesvol was.
12. Verwijder het glaasje van de microscoop podium en het doel schoon te maken. Open het lichtpad naar de OCUlars, en vervang de "lege" beam splitter met de "100% ILL" beam splitter.

3. Nerve doorsnijding gebruiken Laser Ablation en Time-lapse confocale beeldvorming van gliacellen Gedrag

1. Verwijder het podium gebruikt om het glaasje te houden en te vervangen door een podium geschikt voor het houden van 35 mm glazen bodem gerechten. Doorgaan met het 63x 1.2NA water immersie objectief te gebruiken.
2. Breng een kleine druppel water onderdompeling medium om de doelstelling, en zet de schaal met gemonteerde larve op het podium. Het stabiliseren van de schotel met clips.
3. Met behulp van het oculair en groothoek verlichting, richten de larve en zoek de motorische zenuwen. Scan de zenuwen in hemisegments 10-20 en selecteer een motorische zenuw voor doorsnijding.
4. Brengen een live-weergave van de zenuw op het computerscherm met behulp van beeldbewerkingssoftware. Selecteer Z-vliegtuigen en het verwerven van een beeld van de axonen en gliacellen van de niet gewonde zenuw.
5. Bereid time-lapse imaging instellingen in de imaging-software voor het vastleggenZ-projecties van alle celtypes in 5-30 min intervallen afhankelijk van het experiment. Het beste is om alle noodzakelijke instellingen voor de time-lapse voordat u de ablatie te creëren, zodat er geen vertraging bij het starten van de time-lapse zodra de schade is voltooid.
6. Verwijder de "100% ILL" beam splitter en te vervangen door de "blanco". Sluit het licht pad naar de oculairs.
7. Terug naar de live-weergave van de zenuw. Gebruik de juiste fluorescerende kanaal om de axonen die wordt doorsneden bekijken.
8. Met behulp van de ellips tool, maak een dunne elliptische ROI in het gebied dat moet worden weggenomen, dan creëren kleinere ROI binnen de geselecteerde regio.
9. In het venster dat de laser instellingen regelt, stelt u het aantal pulsen op "2" en de demping plaat op "18"% transmissie. Vuur de laser binnen de geselecteerde ROI. Als fluorescentie blijft binnen de ROI's, verhogen het laservermogen, wacht ongeveer 10 seconden, en weer schieten van de laser. Doe dit tot u een instelling die fluorescen veroorzaakt bereikence te verdwijnen binnen de ROI.
10. Wacht minstens 10 seconden en controleer het geablateerde gebied opnieuw voor fluorescentie. Pas op dat een ROI aanvankelijk kan lijken weggenomen, terwijl het in werkelijkheid photobleached. Als fluorescentie rendement, verhoging van het laservermogen en weer schieten van de laser. Herhaal dit tot bloei verdwijnt binnen de ROI en niet terug binnen 10 sec. Het beste is om te beginnen met een lagere laservermogen en verhogen het benodigde vermogen. De benodigde laservermogen kan variëren op basis van individuele microscopie systemen, leeftijd van Coumarin kleurstof, specimen montage, leeftijd van de larven, en de dikte van het weefsel. Tegelijk een laservermogen is vastgesteld, kan deze vermogensstand om opnieuw gebruikt na zenuwen in hetzelfde experiment.
11. Zodra de ablatie is voltooid, beginnen time-lapse imaging.
12. Als de time-lapse is voltooid, gebruikt imaging software om gegevens te verzamelen en te creëren kleur samengestelde Z-projecties voor elk tijdstip. Maak een QuickTime-film om het gedrag te analyserenvan axonen en gliacellen tegelijk.

Resultaten

De hier beschreven test kan worden gebruikt om de reactie van gliacellen en andere zenuw-geassocieerde celpopulaties axonalverwonding in vivo te beoordelen. Film 1 toont een voorbeeld van een zenuwbeschadiging die met deze werkwijze en de respons van omringende gliacellen. Dit experiment werd uitgevoerd in Tg (nkx2.2a: megfp); Tg (Olig2: DsRed) zebravis, waarbij perineurial glia drukken een membraan gerichte EGFP en motorische neuronen express cytosole DsRed. De schade werd gemaakt lan...

Discussie

De meest kritische stappen van dit experimentele ontwerp zijn: 1) behoren montage larven voor schade en vervolgens in vivo beeldvorming en 2) kalibreren van de laser en de juiste energie-instellingen selecteren om een schone zenuw doorsnijding maken die resulteert in een minimale extra weefselschade . Om te helpen zorgen voor een succesvolle axotomie voor in vivo beeldvorming en daaropvolgende analyse, monteren meerdere larven in een van beide individuele glazen bodem gerechten of in een glazen bodem s...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Phenylthiourea	Sigma	P7629-100G
Finquel Tricaine Methanesulfonate MS-222	Argent Chemical	C-FINQ-UE-100G
Low melting point agarose	Sigma	A9414-10G
Quad CELLview Cell Culture Dishes, Glass Bottom, Sterile, Greiner Bio One	VWR/Greiner	89125-444
Single well glass bottom Petri dishes 35 x 10 mm, 12 mm thick	Willco Wells	GWSt-3512
MicroPoint Laser System with all components	Andor Technology - purchased through Quorum Technologies, Inc.	2203-SYS
MicroPoint Laser Courmarin dye (435 nm)	Andor Technology	MP-27-435-DYE