Methodenartikel

Isolatie en chemische karakterisering van Lipid A van Gram-negatieve bacteriën

32.1K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/50623

⸱

16 september 2013

 ,  ,  , 
1Section of Molecular Genetics and Microbiology, The University of Texas at Austin, 2Department of Chemistry and Biochemistry, The University of Texas at Austin, 3The Institute of Cellular and Molecular Biology, The University of Texas at Austin

In dit artikel

Samenvatting

Isolatie en karakterisering van het lipide Een domein van lipopolysaccharide (LPS) van gram-negatieve bacteriën geeft inzicht in celoppervlak gebaseerde mechanismen van resistentie tegen antibiotica, bacteriële overleving en fitness, en hoe chemisch diverse lipide Een moleculaire species verschillend moduleren gastheer aangeboren immuunrespons.

Samenvatting

Lipopolysaccharide (LPS) is het belangrijkste celoppervlak molecuul van gram-negatieve bacteriën, afgezet op de buitenste laag van de buitenste membraan dubbellaag. LPS kan worden onderverdeeld in drie gebieden: de distale O-polysaccharide, een kern oligosaccharide en de lipide A-domein bestaat uit een lipide A moleculaire species en 3-deoxy-D-manno-oct-2-ulosonic zuurresten (Kdo). De lipide A-domein is het enige essentiële component voor bacteriële celoverleving. Na de synthese wordt lipide A chemisch gewijzigd ingevolge omgevingsstress zoals pH of temperatuur, de weerstand tegen antibiotische verbindingen bevorderen en herkenning omzeilen door mediatoren van de gastheer aangeboren immuunrespons. Het volgende protocol beschrijft de klein-en grootschalige isolatie van lipide A uit gram-negatieve bacteriën. Geïsoleerde materiaal wordt vervolgens chemisch gekenmerkt door dunnelaagchromatografie (TLC) of massa-spectrometrie (MS). Naast de matrix-assisted laser desorptie / ionisatie-tijd van flicht (MALDI-TOF) MS, beschrijven wij ook onze tandem MS protocollen voor het analyseren van lipide A moleculaire deeltjes met behulp van elektrospray ionisatie (ESI) gekoppeld aan botsingsgeïnduceerde dissociatie (CID) en de nieuw aangeworven ultraviolet fotodissociatie (UVPD) methoden. Onze MS protocollen zorgen voor eenduidige bepaling van de chemische structuur, van cruciaal belang voor de karakterisering van lipide A moleculen die unieke of nieuwe chemische modificaties bevatten. Wij de radioisotopische etikettering, en de daaropvolgende isolatie van lipide A beschrijven ook uit bacteriële cellen voor analyse door TLC. Ten opzichte van MS-gebaseerde protocollen, TLC biedt een meer economisch en snelle karakteriseringsmethode, maar kan niet worden gebruikt om lipide A chemische structuren ondubbelzinnig overdragen zonder het gebruik van standaarden van bekende chemische structuur. In de afgelopen twee decennia isolatie en karakterisatie van lipide A heeft geleid tot talrijke interessante ontdekkingen die ons begrip van de fysiologie van gram-negatieve bacteriën, mechanismen van antibiotische weerstand verbeterdafstand, de menselijke aangeboren immuunrespons en hebben vele nieuwe doelen die in de ontwikkeling van antibacteriële verbindingen.

Inleiding

Lipopolysaccharide (LPS) is het belangrijkste buitenoppervlak molecuul bijna alle Gram-negatieve organismen en bestaat uit drie moleculaire domeinen: een distaal O-antigeen polysacharide, een kern oligosaccharide en de membraan-geassocieerde lipide A domein afgezet op de buitenste laag van de buitenste membraan dubbellaag 1,2. De lipide A-domein bestaat uit 3-deoxy-D-manno-oct-2-ulosonic (Kdo) residuen en een lipide A moleculaire species, waarbij lipide A kan worden gedefinieerd als de chloroform oplosbare gedeelte van LPS bij milde zure hydrolyse 1, 2. De standaard lipide A molecuul kan chemisch worden gedefinieerd als een diglucosamine backbone die hexa-geacyleerd en bis-gefosforyleerd, in overeenstemming met de grote lipide A species waargenomen in het modelorganisme Escherichia coli (E. coli) 1,2. Negen constitutief tot expressie gebrachte genen, geconserveerd Gram-negatieve bacteriën zijn verantwoordelijk voor de productie van de lipide A-domein (Figuur 1) 1,2. De meeste bacteriën hebben een extra set van genen, die variëren in de mate van fylogenetische conservering, die deelnemen aan verdere chemische modificatie van lipide A 3. Defosforylering, verwijdering van acylketens, en de toevoeging van chemische groepen zoals amino suikers (bijv. aminoarabinose) en / of fosfo zijn de meest waargenomen activiteiten (figuur 1). Veel van de enzymen verantwoordelijk voor lipide A modificatie rechtstreeks geactiveerd door signalen uit de omgeving, zoals tweewaardige kationen, of de expressie wordt gereguleerd door twee componenten respons-ademautomaatsystemen 3.

Erkenning van lipide Een soort door de gastheer aangeboren immuunsysteem wordt gemedieerd door de Toll-like receptor 4/myeloid differentiatie factor 2 (TLR4/MD2) co-receptor 4. Hydrofobe krachten tussen MD2 en de lipide A acylketens, en tussen TLR4 en de 1 en 4 'fosfaatgroepen van lipide A bevorderen de sterke associatie van lipid A met TLR4/MD2 4,5. Modificaties die acylering staat of de negatieve lading van lipide A invloed TLR4/MD2 gebaseerd lipide veranderen Een erkenning en stroomafwaarts stimulatie van de aangeboren immuunrespons activatoren NF-kB en ontstekingsmediatoren zoals TNF en IL1-β 6,7. Wijzigingen die de negatieve lading van lipide A maskeren voorkomen ook bacteriedodende kationische antimicrobiële peptiden binden aan celoppervlak-negatieve Gram 3,8. Veel lipide A modificaties worden verondersteld om bacteriële film onder specifieke milieuomstandigheden, zoals in de menselijke gastheer of in een ecologische niche verhogen. Om deze reden veel modificatie enzymen zijn een aantrekkelijk doelwit in de rationele ontwikkeling van antimicrobiële verbindingen. De diversiteit van chemische structuren lipide A met betrekking tot organisme en / of omgeving en de biologische gevolgen van deze verschillende structuren structurele karakterisatie van lipide A een belangrijke inspanning in thij studie van gram-negatieve bacteriën.

Isolatie van lipide A moleculen uit hele bacteriën omvat de extractie van LPS uit het bacteriële celoppervlak, een hydrolytische stap lipide A bevrijden, gevolgd door een laatste zuiveringsprocedure 9-11. De meest genoemde LPS extractie procedure is de hete-fenol water extractie procedure, voor het eerst geïntroduceerd door Westphal en Jann 10. Na extractie geheel LPS onderworpen aan milde zure hydrolyse, die chemisch scheidt Kdo van de 6'-hydroxylgroep van het distale glucosamine suiker van lipide A (Figuur 1). Talrijke valkuilen bestaan ​​voor de warm-fenol water procedure, inclusief het gebruik van een groot gevaar reagens, de noodzaak van co-geëxtraheerde nucleïnezuren en eiwitten, en verscheidene dagen afgebroken moeten het protocol 10 voltooien.

Ons laboratorium heeft verder ontwikkeld de extractie en isolatie van lipide A als eerste ontwikkeld door Caroff en Raetz 12,13. In vergelijking met procedures warm-fenol water, de hier gepresenteerde methode is snel en efficiënt en biedt een breed scala aan cultuur volumes van 5 ml tot meerdere liters. Bovendien, in tegenstelling warm-fenol water extracties, onze methode niet kiezen voor ruwe of gladde types van LPS, het verstrekken van optimaal herstel van lipide A soorten. In het protocol wordt chemische lysis van hele bacteriecellen uitgevoerd met een mengsel van chloroform, methanol en water, waar LPS kan worden gepelleteerd door centrifugatie. Een combinatie van milde zure hydrolyse en oplosmiddel extracties (Bligh-Dyer) worden gebruikt om lipide A bevrijden van covalent gebonden polysaccharide. Werkwijze volgens Bligh en Dyer werd eerst toegepast op de winning van lipide soorten van verschillende dierlijke en plantaardige weefsels 14, hier aangepast om gehydrolyseerde polysaccharide scheiden van lipide A. In dit laatste scheidingsstap, chloroform oplosbare lipiden selectief verdelen in de onderste organische fase. Om verder te zuiveren lipide A, omgekeerde-fase ofanionische kolom-chromatografie kan worden gebruikt 12.

Na isolatie van lipide A soort uit gehele cellen, kan een aantal analytische methoden worden gebruikt om de chemische structuur van het geïsoleerde materiaal zoals NMR, TLC en MS-gebaseerde analyse karakteriseren. NMR zorgt voor niet-destructieve structuuropheldering en biedt constructieve details over glycosidebindingen, ondubbelzinnige toewijzing van acylketen posities en toewijzing van bevestigingsplaatsen voor lipide A aanpassingen zoals aminoarabinose en fosfoethanolamine 15-17. NMR-analyse van lipide A niet in ons protocol beschreven, maar is voldoende 15,16 elders beschreven. Voor een snelle analyse TLC-gebaseerde methoden worden vaak gebruikt, maar niet om directe informatie over fijne chemische structuur te bieden. MS gebaseerde protocollen zijn de meest gebruikte methode om lipide A structuren 18,19 karakteriseren. Matrix geassocieerd laser desorptie ionisatie (MALDI)-MS wordt vaak gebruikt om aanvankelijk overzicht intact lipide A soort. Enkelvoudig geladen ionen worden gegenereerd analyt bereid volgens onze extractieprocedures. Naarmate er meer fijne structurele analyse is nodig, MS / MS-gebaseerde methoden blijken informatiever dan MALDI-MS. Gekoppeld aan ionisatie electrospray (ESI) enkelvoudig of meervoudig geladen lipide A precursorionen verder versnipperd door botsing geïnduceerde dissociatie (CID) of ultraviolet fotodissociatie (UVPD), structureel informatieve product ionen 18,20,21 genereren. Neutrale verlies producten van lipide A precursor ionen worden ook vaak ontstaan ​​tijdens ESI-MS voorzien van een extra laag van structurele informatie.

Tandem massaspectrometrie (MS / MS) blijkt een onmisbaar en veelzijdige werkwijze voor de opheldering van lipide A structuren. Tijdens MS / MS worden ionen geactiveerd op een diagnostische fragmentatie patroon dat kan worden gebruikt om de structuur van het precursorion helderen opleveren. De meest available MS / MS methode is CID. Deze methode levert fragment ionen via botsingen van de geselecteerde precursorion met een inert doelgas, waardoor energie depositie die leidt tot dissociatie. CID heeft bewezen een kritiek hulpmiddel in de opdracht van lipide A structuur voor een groot aantal bacteriesoorten 22-33.

Hoewel CID is de meest algemeen ingevoerd MS / MS methode, genereert een beperkte reeks producten ionen. 193 nm UVPD is een alternatieve en complementaire MS / MS methode. Deze werkwijze gebruikt een laser om ionen bestralen en de absorptie van fotonen gevolg bekrachtiging van de ionen en daaropvolgende dissociatie. Deze hogere energie-MS / MS techniek levert een meer divers aanbod van product-ionen dan CID en zorgt zo voor meer informatieve fragmentatiepatronen. In het bijzonder, UVPD biedt informatie over subtiele veranderingen in lipide Een soort gebaseerd op breuklijnen in glycoside, amine, acyl-en CC-linked bonds 18,21,34.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

Alle oplossingen moeten worden bereid met ultrapuur water en HPLC-kwaliteit methanol en chloroform. Bereide oplossingen die organische oplosmiddelen zoals methanol, chloroform, of pyridine en geconcentreerde zuren of basen bevatten, moeten worden voorbereid en gebruikt onder een zuurkast. Alle oplossingen kunnen worden bewaard bij kamertemperatuur. Oplosmiddelen moet worden gemeten in een gegradueerde glazen cilinder en opgeslagen in glazen flessen oplosmiddel met PTFE bekleed caps. Voor langdurige opslag-chloroform bevattende oplosmiddelen worden bewaard in getinte amberkleurige glazen flessen om de productie van fosgeen, een zeer reactief zuurchloride voorkomen. PTFE centrifugebuizen en roterende verdamper kolven worden gespoeld met methanol en chloroform vóór gebruik. Volg noodzakelijke federale, staats-en / of verwijdering institutioneel afval voorschriften bij het afvoeren van oplosmiddelen en / of radioactief afval.

1. Large Scale Lipide A Extractie (50 ml 1,5 L)

  1. Bereid een eenfase Bligh-Dyer mengsel: chloorform-methanol-1X fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS), pH 7,4; 1:2:0.8 v / v). Combineer 200 ml chloroform, 400 ml methanol en 160 ml PBS in 1 L fles oplosmiddel. Cap fles en meng door omkeren (> 30x). Draai de dop periodiek tijdens het mengen om te ventileren en op te slaan verzegeld.
  2. Bereid een vooraf geëquilibreerd tweefasen Bligh-Dyer mengsel chloroform: methanol: water (2:2:1.8 v / v). Combineer 400 ml chloroform, 400 ml methanol en 180 ml water in 1 L fles oplosmiddel. Cap fles en meng door omkeren, en zorg ervoor dat kapje regelmatig los tijdens het mengen om te ventileren. Laat evenwicht O / N en winkel gesloten.
  3. Bereid de milde zure hydrolyse buffer (50 mM natriumacetaat, pH 4,5, 1% natriumdodecylsulfaat (SDS)). 500 ml milde zure hydrolyse buffer Weeg 2,05 g natriumacetaat en overbrengen in een bekerglas van 500 ml. Voeg water toe tot een volume van ~ 350 ml en roer, voeg dan 50 ml van 10% SDS. Mix en pH op 4,5, over te dragen aan een maatcilinder en voeg water toe tot 500 ml.
  4. Bereidenchloroform: methanol (04:01, v / v): Meet 100 ml chloroform en breng flesje oplosmiddel. Meet 25 ml methanol en meng met chloroform. Bewaren in amberkleurige glazen fles.
  5. Inoculeer 5 ml van media (Luria bouillon of andere) van een enkele bacteriële kolonie. Grow O / N bij 37 ° C, of ​​vereist ° C voor groei. Een diagram van de extractieprocedure wordt getoond in figuur 2.
  6. De volgende dag, het meten van de OD 600 en gebruik de 5 ml O / N cultuur tot 200 ml van de cultuur te enten om een startlocatie OD600 van 0,05. Groeien cellen tot een OD 600 van 0,8-1,0 wordt bereikt.
  7. Oogst cellen via centrifugatie bij 10.000 xg gedurende 10 minuten. Langere spins kan nodig zijn voor stammen die slecht neer te slaan. Giet media supernatant.
  8. Was cel pellet met 50 ml 1 x met fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS). Herhaal centrifugeren om cellen te pelleteren. Giet supernatant en bewaar cel pellet bij -20 ° C, of ​​ga verder met stap 1.9.
  9. Resuspendeer cellen in 40 mlvan 1x PBS en kloof tussen twee 250 ml PTFE centrifugebuisjes (opbrengst 20 ml celsuspensie / buis). Voeg 25 ml chloroform en 50 ml methanol aan elke buis, een eenfase Bligh-Dyer (chloroform: methanol: water; 1:2:0.8 v / v) (Figuur 2). Meng door omkeren en incubeer bij kamertemperatuur gedurende> 20 minuten om volledige cellysis te waarborgen.
  10. Centrifugeer het mengsel bij 2000 xg gedurende 20 minuten. LPS zal pellet samen met eiwitten en nucleïnezuren (figuur 2), maar zullen fosfolipiden, isoprenyl lipiden en kleine hydrofobe peptiden in het supernatant blijven. Verwijder het supernatant.
  11. Was de LPS pellet met ~ 100 ml eenfase Bligh-Dyer mengsel. Centrifugeer bij 2000 xg gedurende 20 minuten. Gooi supernatant. Bij isoleren lipide A uit E. coli of Salmonella, slechts een was vereist, maar extra wasstappen nodig zijn om fosfolipide verontreiniging wanneer isoleren lipide A uit sommige organismen te verminderen.
  12. Voeg 27 ml van mild zure hydrolyse buffer (50 mM natriumacetaat, pH 4,5, 1% SDS, zie stap 1.3) aan LPS pellet en meng door en neer te pipetteren totdat alleen kleine deeltjes blijven. Sonicaat homogeen opnieuw in suspensie LPS pellet in oplossing met sonde sonicator bij een constante duty cycle van 20 sec bij 50% vermogen. Herhaal ultrasoonapparaat van het monster 2x (20 sec / barsten, ~ 5 sec tussen bursts).
  13. Kook monsters in een waterbad gedurende 30 minuten. Let op: zorg ervoor dat de caps zijn strak, maar niet volledig afgesloten. Sommige organismen, zoals Vibrio cholerae (V. cholerae) vereisen langere incubatietijden (1 uur) tot totale opbrengst van lipide A. toenemen verwijderen flessen uit waterbad en laat monster afkoelen tot kamertemperatuur voordat.
  14. Om lipiden extract na hydrolyse, zet de SDS-oplossing in een twee-fasen Bligh-Dyer (figuur 2) mengsel door toevoeging van 30 ml chloroform en 30 ml methanol, een chloroform: methanol: water (2:2:1.8, v / v) mengsel. Meng door omkeren en centrifugeer het monster gedurende 10 minuten bij 2,000 x g. Pak de onderste fase in een schone PTFE centrifugebuis met een glazen pipet.
  15. Voer een tweede extractie door toevoeging van 30 ml onderste fase uit een vooraf geëquilibreerd tweefasen Bligh-Dyer mengsel (stap 1.2), de bovenste fase van stap 1.14. Mix, centrifugeer bij 2000 xg gedurende 10 minuten. Pak de onderste fase, en een zwembad met de onderste fase in stap 1.14 uitgepakt.
  16. Was de gepoolde onderste fasen (60 ml totaal) door het toevoegen van 114 ml van pre-evenwicht gebracht tweefasen Bligh-Dyer bovenste fase (stap 1.2) naar een twee-fasen Bligh-Dyer mengsel (chloroform maken: methanol: water; 02:02: 1.8, v / v). Mengen. Centrifugeer bij 2000 xg gedurende 10 minuten.
  17. Verwijder de onderste fase een schone glazen kolf rotatieverdamper droog monster gebruikmakend van roterende verdamping (figuur 2).
  18. Voeg 5 ml chloroform: methanol (04:01, v / v) aan de roterende kolf en bad ultrasone trillingen (> 30 seconden) om te helpen bij suspensie van lipide uit sociale kolf. Gebruik een glazen transferpipet om lipide over te dragen aan een schoneglazen buis (13 x 100 mm of groter) afgedekt met PTFE beklede fenol schroefdop. Droge monster onder een stroom van stikstof met behulp van een stikstof droger.
  19. Resuspendeer gedroogde lipiden in 1 ml chloroform: methanol (04:01, v / v). Transfer naar kleine glazen flesje, (12 x 32 mm) met een kegelvormige basis voor meer kwantitatieve resuspensie met behulp van kleine volumes (zie tabel van apparatuur / reagentia). Droog met een stikstof-droger.
  20. Gedroogde monster kan worden opgeslagen bij -20 ° C tot latere TLC (protocol 2) en MS analyse (Protocol 3, 4 of 5). (Let op: Bedrag van materiaal geïsoleerd worden en aangewend in de daaropvolgende protocollen wordt voorgesteld op basis van wat is voldoende voor de meeste organismen Hetzelfde lipide monster kan worden gebruikt in de Protocollen 2-5, het kennis nemen van% materiaal verwijderd Zie Overleg voor meer details...).

2. Visualisatie van Lipid A Species via Dunnelaagchromatografie

  1. Bereid de TLC mobiele fase oplosmiddel systeem (chloroform: pyridine: 88% mierenzuur: water; 50:50:16:5 v / v). Combine 200 ml chloroform, 200 ml pyridine, 64 ml 88% mierenzuur en 20 ml van water in een 1 L fles oplosmiddel. Cap fles, meng door omkeren meerdere keren, en ontluchten.
  2. Gebruik een TLC tank die geschikt voor 20 x 20 cm platen. Lijn TLC tank met ~ 40 cm chromatografie papier.
  3. TLC tank voeg 200 ml chloroform: pyridine: 88% mierenzuur: water (50:50:16:5, v / v) mengsel. Laat tank pre-evenwicht voor> 3 uur, vaak O / N heeft de voorkeur en handiger.
  4. Verwijder gedroogde lipide monsters van diepvries (stap 1.20) en laat warm tot kamertemperatuur.
  5. Met een scheermes verwijdert de silica uit de bovenkant van een silica gel 60 TLC-plaat. Met een doffe potlood, een lijn evenwijdig aan de onderzijde van de plaat 2 cm vanaf de bodem. Deze lijn is de oorsprong voor het spotten van monsters. Mark stappen langs deze referentielijn tot monsters 1 cm van elkaar te spotten.
  6. Los gedroogd lipide uit stap 2.4 in 200 ui chloroform: methanol (04:01, v / v), vortex en ultrasone trillingen (3x, ~ 15 seconden elk), levert ~ 100 -500 ng / ul lipide A als afkomstig van E. coli.
  7. Met behulp van een microcapillaire glazen pipet, spot een tiende van het volume (20 pl) op de TLC-plaat zoals aangegeven in stap 2.5. Laat monsters aan de lucht drogen op TLC plaat voor ~ 15 minuten. (Opmerking: Monsters in kleine glazen flesjes kan worden gedroogd met een droger stikstof en bewaard bij -20 ° C voor later gebruik bij protocollen 3-5 Noteer% materiaal verwijderd.).
  8. Plaats TLC plaat die gespot monsters in de pre-evenwicht gebracht tank. Zodra oplosmiddel voor de bovenkant van de TLC-plaat (~ 2,5-3 uur) bereikt, verwijder de plaat en de lucht drogen (> 60 min.). Een koude lucht pistool kan worden gebruikt om volledig droog te houden.
  9. Terwijl de plaat drogen, zet hete plaat bij 250 ° C voor verkolen.
  10. In een geventileerde zuurkast, bereid 10% zwavelzuur-ethanol mengsel verkoling lipiden opgelost op silica TLC-plaat (geconcentreerd zwavelzuur: 100% ethanol; 01:09 v / v). Meet 10 ml zwavelzuur en voeg langzaam 90 ml 100% ethanol. Zorggrondig te mengen en over te dragen aan een glazen chromatografische reagens verstuiver.
  11. In de zuurkast, gebruik een glazen chromatografische reagens verstuiver om de gedroogde TLC-plaat spuiten met 10% zwavelzuur-ethanol mengsel. Spuit het mengsel gelijkmatig over de plaat.
  12. Plaats het TLC-plaatje op de 250 ° C hete plaat tot verkoold lipide monsters verschijnen als zwarte / bruine vlekken (<1 min). Niet overbelichten de plaat, want dit zal ertoe leiden dat de hele plaat te bruin worden en maak visualisatie van lipide A soort moeilijk.

3. Structurele karakterisatie van Lipid A via MALDI-TOF massaspectrometrie

  1. Vanaf stap 1.20, (of stap 2.7) uit vriezer verwijderen lipide A monster en laat warm tot kamertemperatuur. Resuspendeer gedroogde lipide Een monster ~ 20 pl chloroform: methanol (04:01, v / v) en vortex een ~ 1-5 ug / ul lipide A oplossing te verkrijgen indien geëxtraheerd uit E. coli. (Let op: 10% minder geconcentreerd als materiaal gebruikt uit stap 2.7).
  2. Bereid ATT matrix componenten. Verzadigde 6-aza-2-thiothymine in 50% acetonitril: voeg 500 ul water en 500 pi acetonitril aan een 1,5 ml microcentrifugebuis en voeg> 10 mg 6-aza-2-thiothymine zodat de 50% acetonitril oververzadigd. Verzadigde tribasisch ammoniumcitraatoplossing: Toevoegen> 1 mg tot 500 pi water, neerslaan moet duidelijk zichtbaar zijn. Vortex en centrifuge-oplossingen voor gebruik, alleen verzadigde supernatant wordt gebruikt.
  3. Bereid ATT matrix mengsel verzadigde 6-aza-2-thiothymine in 50% acetonitril, verzadigde tribasisch ammoniumcitraat (20:01, v / v). Meng matrix componenten samen door het toevoegen van 20 pi van ATT oplossing voor 1 pl verzadigde tribasisch ammoniumcitraatoplossing in 500 pi microcentrifugebuis, vortex te mengen, en centrifuge alvorens te MALDI plaat.
  4. Bereid MALDI plaat door toevoegen van 0,5 pi kalibrant mengsel aan de MALDI plaat op een plek in de buurt waar de monsters zullen worden gestort, om de meest accurate massa / bepaalbaarheidsgrens.
  5. Deponeren 0,5 plvan ATT matrix op MALDI plaat op elke plek waar lipide Een monster zal worden gestort.
  6. Borg 0,5 pi van het monster (2,5% van de totale steekproef) op de plek van ATT matrix, te mengen op de plaat, en het verwerven van spectra door te scannen monster voor optimale ion signalen (Figuur 3). Opmerking: De bedragen voor de meest optimale MS signaal kan variëren met organisme en moet empirisch worden bepaald. Om meer materiaal toe te voegen kan men ter plaatse 0,5 pi meerdere keren waardoor gespot mengsel te drogen tussen toevoeging van meer monster. Monster kan worden geconcentreerd (droog en resuspendeer in een kleiner volume) of zonodig verdund. Meer uitgangsmateriaal (volume vanaf celkweek) kunnen ook worden gebruikt (zie discussie).

4. Elektrosprayionisatie massaspectrometrie en botsingsgeïnduceerde fragmentatie van Lipid A

  1. Bereid een chloroform: methanol oplosmiddelmengsel (1:1, v / v) door mengen van 200 ui voorraad HPLC kwaliteit methanol met 200 ml HPLC kwaliteit chloroform in een glazen solvent fles.
  2. Breng 200 pi van de chloroform: methanol oplosmiddelmengsel de injectieflacon met lipide A (bijv. uit stap 1,20, 2,7, of gedroogd na Protocol 3) en de ultrasone trillingen lipide oplossing gedurende 5 minuten of totdat alles is opgelost.
  3. Stel de massaspectrometer voor negatieve modus elektrosprayionisatie.
  4. Met een 250 ul injectiespuit en een injectiespuit pomp direct trekken het verdunde lipide A monster bij een stroomsnelheid van 2,0-3,5 pl / min.
  5. Optimaliseren en verbeteren van de lipide A ion signaal door het afstemmen van de ionenoptiek. Een volledige massaspectrum kan nu worden verzameld van de lipide A soort (Figuur 4).
  6. Isoleer en activeer het doel lipide A door CID selecteren als de MS / MS methode.
  7. Verhoog de CID spanning (of genormaliseerde botsingsenergie, NCE) totdat de precursor lipide A soort is ongeveer 10% relatieve overvloed opzichte van het hoogste productionen.
  8. Verwerven en gemiddelde spectra totdat er voldoende signaal-ruis wordt bereikt voor the product ionen. Het aantal scans nodig is afhankelijk van de signaalintensiteit van de oorspronkelijke precursor en kan variëren 3-300 scans (figuur 5A).

5. MS / MS op Lipid A door Ultraviolet Photodissociation

  1. Bereid monster en massaspectrometer als in de stappen 4,1-4,5.
  2. Zet de laser gekoppeld aan de massaspectrometer. De massaspectrometer werd uitgerust met een 193 nm excimer laser gewijzigde UV activering in de HCD cel van het instrument mogelijk. Fotodissociatie werd uitgevoerd op een soortgelijke wijze als eerder beschreven 35. We maken gebruik van een aangepaste vacuümverdeelstuk met een CaF 2 optische venster om fotonen te zenden naar de hogere energie-C-trap dissociatie (HCD) cel. De laser wordt geactiveerd tijdens de MS / MS door een transistor-transistor logica (TTL)-signaal van massaspectrometer een puls / vertraging generator.
  3. Stel het instrument software, zodat de laser de excimer laser wordt geactiveerd wanneer deionen komen de HCD cel. Dit vereist een geringe wijziging van de software.
  4. Zet de pulsgenerator zodanig dat de laser wordt gepulseerd elke 2 ms (500 Hz).
  5. Isoleer de lipide A precursorion door HCD selecteren als MS / MS methode en de botsing energie aanpassen aan 1% NVU. Hierdoor kan de isolatie van precursorionen voor ultraviolette dissociatie in het HCD cel. Hoewel de HCD cel wordt gebruikt, wordt de software aangepast om UVPD voeren tijdens dit interval.
  6. Activeer de geïsoleerde lipide A ion door verhoging van de laserenergie en het aanpassen van het aantal laserpulsen. Een typische UVPD experiment uitgevoerd met tien 6 ml pulsen.
  7. Zoals in stap 4.8, verwerven en gemiddelde spectra totdat voldoende signaal-ruis wordt bereikt voor het product UVPD ionen. Het aantal scans nodig is afhankelijk van de signaalintensiteit van de oorspronkelijke precursor en kan variëren 3-300 scans (Figuur 5B).

6. 32P-Labelingof Lipid A en Latere Isolatie

  1. Inoculeer 5 ml van media (Luria bouillon of andere media) van een enkele kolonie. Grow O / N bij 37 ° C of gewenste temperatuur.
  2. De volgende dag, het meten van de OD 600 en de O / N cultuur tot 7 ml van de cultuur te enten om een startlocatie OD 600 van ~ 0,05, gekweekt in een standaard 20 x 150 mm wegwerp glazen cultuur buis. Voeg 2,5 uCi / ml anorganisch 32 blz. Groeien cellen tot een OD 600 van 0,8-1,0 wordt bereikt. Volg de federale, provinciale en / of institutionele richtlijnen voor de veilige en correcte afhandeling van radioactief materiaal.
  3. Oogst cellen in 16 x 125 mm glazen centrifugebuis met PTFE beklede dop met een vaste hoek klinische centrifuge bij 1500 xg gedurende 10 minuten. Verwijder supernatant in een geschikte radioactief afval container. Alle radioactief afval (bijvoorbeeld vloeistof, glas, Biohazard) gegenereerd in de volgende stappen dienen te worden vernietigd in overeenstemming met federale, staats-en / of institutionele guivendien.
  4. Was celpellet met 5 ml van 1 x met fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS). Centrifugeer gedurende 10 minuten bij 1500 x g. Gooi supernatant.
  5. Resuspendeer cellen in 5 ml eenfase Bligh-Dyer mengsel (figuur 2) bestaat uit chloroform: methanol: water (1:2:0.8, v / v). Vortex mengen en incuberen bij kamertemperatuur gedurende> 20 minuten om volledige cellysis te waarborgen.
  6. Centrifuge klinische centrifuge bij 1500 xg gedurende 20 minuten. Giet voorzichtig uit supernatant, die fosfolipiden en isoprenyl lipiden bevat.
  7. Resuspendeer de pellet LPS in 1,8 ml 50 mM natriumacetaat, pH 4,5, 1% SDS buffer door wervelen. Sonificeer monster met behulp van een badsonificeerinrichting tot pellet gelijkmatig wordt verspreid (~ 30 sec).
  8. Incubeer monster gedurende 30 minuten in kokend waterbad. Zorg dat caps zijn krap, maar niet verzegeld.
  9. Verwijderen uit waterbad en laat monster afkoelen bij kamertemperatuur gedurende 5-10 minuten.
  10. Zet de oplossing in twee fasen Bligh-Dyer mengsel door toevoeging van 2 ml chloroform en 2 mlmethanol, waardoor een chloroform: methanol: water (2:2:1.8 v / v) mengsel. Vortex te mengen, en centrifugeer gedurende 10 min in klinische centrifuge bij 1500 xg om afzonderlijke fasen.
  11. Pak de onderste fase in een schone glazen centrifugebuis met een glazen pipet (eerste extractie).
  12. Voer een tweede extractie van het monster door toevoeging van 2 ml van voor-geëquilibreerd tweefasen Bligh-Dyer onderste fase (bereid als in stap 1.2) aan op de bovenste fase uit stap 11. Vortex en centrifugeer 10 minuten. Verwijder de onderste fase en combineren met de onderste fase van de eerste extractie.
  13. De samengevoegde onderste fase (~ 4 ml totaal volume), voeg 7,6 ml vooraf geëquilibreerd bovenste fase (stap 1.2), waarbij een twee-fasen Bligh-Dyer oplossing (chloroform: methanol: water, 2:2:1.8, v / v). Vortex en centrifugeer gedurende 10 minuten.
  14. Verwijder de onderste fase om een ​​schone glazen buis en droog met een stikstof-droger. Gedroogde monsters kunnen worden opgeslagen bij -20 ° C tot verder gebruik.

7. Visualisatiesatie van 32P-gemerkte lipide A Soort via Dunnelaagchromatografie

  1. Bereid 32P gemerkte lipide A monster TLC tank en TLC-platen zoals beschreven in stappen 2.1-2.8.
  2. Los 32P gemerkte monster in 500 ui 04:01 chloroform-methanol (v / v). Vortex en bad ultrasone trillingen om lipide materiaal volledig op te lossen. Voeg 5 pl monster scintillatieflesje met 5 ml scintillatie cocktail. Rekenen in scintillatieteller en bereken het totaal tellingen / min monster.
  3. Wanneer visualiseren radioactief soorten lipiden, kan 10 x 20 cm of 20 x 20 cm TLC-platen gebruikt. Voor 10x20 cm platen, moeten monsters worden gespot langs de herkomst aangegeven in stap 2.5, zodat langste afmeting van de plaat is verticaal (dwz monsters gespot bij de oorsprong gemarkeerd 2 cm boven de 10 cm rand).
  4. Met behulp van een pipet microcapillaire, spot 10.000-20.000 cpm / monster op plaat en laat plekken om te drogen (> 15 min.). Monsters zou moeten worden geconcentreerd door drogen onderstikstof en opnieuw gesuspendeerd in een geschikt volume, tot 10.000-20.000 tellingen / min / spot (2 ui of 2 ui per keer <10 pi totaal) bereiken.
  5. Plaats TLC plaat met radioactief gelabeld monsters in de pre-evenwicht gebracht tank. Zodra oplosmiddel voor de bovenkant van de TLC-plaat (~ 3 uur) bereikt, verwijder de plaat en de lucht drogen (> 60 min.). Opgelet: TLC platen uitgevoerd in aanwezigheid van pyridine moet grondig gedroogd in een zuurkast, zoals sporen van pyridine fosforimaging schermen kunnen beschadigen. Een koude lucht pistool kan worden gebruikt om volledig droog te houden.
  6. Wikkel de plaat in plasticfolie en blootstellen aan fosforbeeldvormingsanalyse scherm in een autoradiografie cassette O / N. De volgende ochtend, scan het scherm om het beeld (Figuur 6) te verkrijgen. Met behulp van beeld densitometrie analyse software, zorgt deze methode voor een nauwkeurige, relatieve kwantificering van lipide A soorten.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

Canonical lipide A van E. coli en Salmonella enterica serovar Typhimurium een hexa-geacyleerd glucosamine disaccharide met fosfaatgroepen op de 1 - en 4 "-plaatsen. Tijdens de groei in rijke media (bijv. Luria Broth) een gedeelte van de lipide A bevat een pyrofosfaat groep op de 1-positie waarbij een tris-gefosforyleerd species 36 (figuur 1). KDO (3-deoxy-D-manno-octulosonic zuur), is op bevestigd het 6-hydroxyl en dient als een brug naar lipi...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

In dit protocol hebben we de isolatie van lipide Een soort van hele cellen van bacteriën gedetailleerde en beschreven TLC of MS gebaseerde analytische methoden om chemisch deze geïsoleerde materiaal karakteriseren. Tandem massaspectrometrie is een krachtige strategie voor de novo structurele karakterisatie van biologische verbindingen, en is van onschatbare waarde voor de chemische karakterisering van het arsenaal van lipide A moleculen waargenomen in de natuur. CID en UVPD zijn twee complementaire activeringsm...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

Geen belangenconflicten verklaard.

Dankbetuigingen

Dit werk werd ondersteund door subsidies AI064184 en AI76322 van de National Institutes of Health (NIH) en door Grant 61789-MA-MUR van het leger Bureau Onderzoek naar MST onderzoek werd ook gesteund door Welch Foundation Grant F1155 en NIH verlenen R01GM103655 naar JSB

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
ChloroformThermo Fisher ScientificC607HPLC Grade
MethanolThermo Fisher ScientificA452HPLC Grade
Teflon FEP Centrifuge BottlesThermo Fisher Scientific05-562-21
Silica Gel 60 TLC PlatesEMD Biosciences5626-6
Grade No. 3MM Chromatography PaperWhatman3030700
Orbitrap EliteThermo Fisher Scientific
Mass Spectrometer
ExciStar XS Excimer LaserCoherent Inc.
PicoTip Nanospray ESI emittersNew Objectives≥ 30 μm om verstopping te verminderen
Model 505 Pulse/Delay GeneratorBerkeley Nucleonics Corporation
Hot Plate Thermolyne 2200Barnstead/ThermolyneHPA2235MQ
16x125 mm GPI 15-415 Threaded Disposable Borosilicate Culture TubesCorning Pyrex99449-16X
Reusable Threaded PTFE Screw Caps GPI 45-415Corning9999-152
Personal Molecular Imager System (fosforimager)BioRad170-9400
Autoradiography CassetteThermo Fisher ScientificFBCS810
Phosphorscreen SO230Kodak
Peptide Mass Standards KitSequazymeP2-3143-00
Sonifier S250-ABranson101063196
1.5 ml 12x32 mm Tapered Base Screw Thread VialThermo Fisher ScientificC4000-V1

Referenties

  1. Trent, M. S., Stead, C. M., Tran, A. X., Hankins, J. V. Diversity of endotoxin and its impact on pathogenesis. Journal of endotoxin research. 12, 205-223 (2006).
  2. Raetz, C. R., Whitfield, C. Lipopolysaccharide endotoxins. Annu Rev. Biochem. 71, 635-700 (2002).
  3. Raetz, C. R., Reynolds, C. M., Trent, M. S., Bishop, R. E. Lipid A Modification Systems in Gram-Negative Bacteria. Annu. Rev. Biochem. 76, 295-329 (2007).
  4. Kim, H. M., et al. Crystal structure of the TLR4-MD-2 complex with bound endotoxin antagonist Eritoran. Cell. 130, 906-917 (2007).
  5. Rietschel, E. T., et al. Bacterial endotoxin: molecular relationships of structure to activity and function. FASEB journal : official publication of the Federation of American Societies for Experimental Biology. 8, 217-225 (1994).
  6. Medzhitov, R., Janeway, C. Innate immunity. The New England journal of medicine. 343, 338-344 (2000).
  7. Dinarello, C. A. Interleukin-1 and interleukin-1 antagonism. Blood. 77, 1627-1652 (1991).
  8. Guo, L., et al. Lipid A acylation and bacterial resistance against vertebrate antimicrobial peptides. Cell. 95, 189-198 (1998).
  9. Yi, E. C., Hackett, M. Rapid isolation method for lipopolysaccharide and lipid A from gram-negative bacteria. The Analyst. 125, 651-656 (2000).
  10. Westphal, O. aJ., K, Bacterial Lipopolysaccharide. Extraction with phenol-water and further application of the procedure. Methods Carbohydr. Chem. 5, 83-91 (1965).
  11. Galanos, C., Luderitz, O., Westphal, O. A new method for the extraction of R lipopolysaccharides. European journal of biochemistry / FEBS. 9, 245-249 (1969).
  12. Raetz, C. R., Purcell, S., Meyer, M. V., Qureshi, N., Takayama, K. Isolation and characterization of eight lipid A precursors from a 3-deoxy-D-manno-octylosonic acid-deficient mutant of Salmonella typhimurium. The Journal of biological chemistry. 260, 16080-16088 (1985).
  13. Caroff, M., Deprun, C., Karibian, D., Szabo, L. Analysis of unmodified endotoxin preparations by 252Cf plasma desorption mass spectrometry. Determination of molecular masses of the constituent native lipopolysaccharides. The Journal of biological chemistry. 266, 18543-18549 (1991).
  14. Bligh, E. G., Dyer, W. J. A rapid method of total lipid extraction and purification. Canadian journal of biochemistry and physiology. 37, 911-917 (1959).
  15. Zhou, Z., Ribeiro, A. A., Raetz, C. R. High-resolution NMR spectroscopy of lipid A molecules containing 4-amino-4-deoxy-L-arabinose and phosphoethanolamine substituents. Different attachment sites on lipid A molecules from NH4VO3-treated Escherichia coli versus kdsA mutants of Salmonella typhimurium. The Journal of biological chemistry. 275, 13542-13551 (2000).
  16. Wang, X., et al. Structure and biosynthesis of free lipid A molecules that replace lipopolysaccharide in Francisella tularensis subsp. novicida. Biochemistry. 45, 14427-14440 (2006).
  17. Strain, S. M., et al. Location of polar substituents and fatty acyl chains on lipid A precursors from a 3-deoxy-D-manno-octulosonic acid-deficient mutant of Salmonella typhimurium. Studies by 1H, 13C, and 31P nuclear magnetic resonance. The Journal of biological chemistry. 260, 16089-16098 (1985).
  18. Madsen, J. A., Cullen, T. W., Trent, M. S., Brodbelt, J. S. IR and UV Photodissociation as Analytical Tools for Characterizing Lipid A Structures. Analytical Chemistry (Washington, DC, United States. 83, 5107-5113 (2011).
  19. Banoub, J. H., El Aneed, A., Cohen, A. M., Joly, N. Structural investigation of bacterial lipopolysaccharides by mass spectrometry and tandem mass spectrometry. Mass Spectrom. Rev. 29, 606-650 (2010).
  20. Hankins, J. V., Trent, M. S. Secondary acylation of Vibrio cholerae lipopolysaccharide requires phosphorylation of Kdo. The Journal of biological chemistry. 284, 25804-25812 (2009).
  21. Hankins, J. V., et al. Elucidation of a novel Vibrio cholerae lipid A secondary hydroxy-acyltransferase and its role in innate immune recognition. Molecular Microbiology. 81, 1313-1329 (2011).
  22. Chan, S., Reinhold, V. N. Detailed structural characterization of lipid A: electrospray ionization coupled with tandem mass spectrometry. Anal. Biochem. 218, 63-73 (1994).
  23. Boue, S. M., Cole, R. B. Confirmation of the structure of lipid A from Enterobacter agglomerans by electrospray ionization tandem mass spectrometry. J. Mass Spectrom. 35, 361-368 (2000).
  24. Kussak, A., Weintraub, A. Quadrupole ion-trap mass spectrometry to locate fatty acids on lipid A from Gram-negative bacteria. Anal. Biochem. 307, 131-137 (2002).
  25. El-Aneed, A., Banoub, J. Elucidation of the molecular structure of lipid A isolated from both a rough mutant and a wild strain of Aeromonas salmonicida lipopolysaccharides using electrospray ionization quadrupole time-of-flight tandem mass spectrometry. Rapid Commun. Mass Spectrom. 19, 1683-1695 (2005).
  26. Murphy, R. C., Raetz, C. R. H., Reynolds, C. M., Barkley, R. M. Mass spectrometry advances in lipidomica: collision-induced decomposition of Kdo2-lipid A. Prostaglandins Other Lipid Mediators. 77, 131-140 (2005).
  27. Lee, C. -S., Kim, Y. -G., Joo, H. -S., Kim, B. -G. Structural analysis of lipid A from Escherichia coli O157:H7:K- using thin-layer chromatography and ion-trap mass spectrometry. J. Mass Spectrom. 39, 514-525 (2004).
  28. Wang, Z., Li, J., Altman, E. Structural characterization of the lipid A region of Aeromonas salmonicida subsp. salmonicida lipopolysaccharide. Carbohydr. Res. 341, 2816-2825 (2006).
  29. Mikhail, I., Yildirim, H. H., Lindahl, E. C. H., Schweda, E. K. H. Structural characterization of lipid A from nontypeable and type f Haemophilus influenzae: variability of fatty acid substitution. Anal. Biochem. 340, 303-316 (2005).
  30. Madalinski, G., Fournier, F., Wind, F. -L., Afonso, C., Tabet, J. -C. Gram-negative bacterial lipid A analysis by negative electrospray ion trap mass spectrometry: Stepwise dissociations of deprotonated species under low energy CID conditions. Int. J. Mass Spectrom. 249, 77-92 (2006).
  31. Silipo, A., et al. Structural characterizations of lipids A by MS/MS of doubly charged ions on a hybrid linear ion trap/orbitrap mass spectrometer. J. Mass Spectrom. 43, 478-484 (2008).
  32. Jones, J. W., Shaffer, S. A., Ernst, R. K., Goodlett, D. R., Turecek, F. Determination of pyrophosphorylated forms of lipid A in gram-negative bacteria using a multivaried mass spectrometric approach. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S. A. 105, 12742-12747 (2008).
  33. Jones, J. W., Cohen, ie, Turecek, F., Goodlett, D. R., Ernst, R. K. Comprehensive structure characterization of lipid A extracted from Yersinia pestis for determination of its phosphorylation configuration. J. Am. Soc. Mass Spectrom. 21, 785-799 (2010).
  34. Hankins, J. V., Madsen, J. A., Giles, D. K., Brodbelt, J. S., Trent, M. S. Amino acid addition to Vibrio cholerae LPS establishes a link between surface remodeling in gram-positive and gram-negative bacteria. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 109, 8722-8727 (2012).
  35. Han, S. W., et al. Tyrosine sulfation in a Gram-negative bacterium. Nature. 3, 1153-1110 (2012).
  36. Touze, T., Tran, A. X., Hankins, J. V., Mengin-Lecreulx, D., Trent, M. S. Periplasmic phosphorylation of lipid A is linked to the synthesis of undecaprenyl phosphate. Mol. Microbiol. 67, 264-277 (2008).
  37. Galloway, S. M., Raetz, C. R. A mutant of Escherichia coli defective in the first step of endotoxin biosynthesis. The Journal of biological chemistry. , 265-6394 (1990).
  38. Trent, M. S., et al. Accumulation of a polyisoprene-linked amino sugar in polymyxin-resistant Salmonella typhimurium and Escherichia coli: structural characterization and transfer to lipid A in the periplasm. The Journal of biological chemistry. 276, 43132-43144 (2001).
  39. Chung, H. S., Raetz, C. R. Dioxygenases in Burkholderia ambifaria and Yersinia pestis that hydroxylate the outer Kdo unit of lipopolysaccharide. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 108, 510-515 (2011).
  40. Zhou, Z., Lin, S., Cotter, R. J., Raetz, C. R. Lipid A modifications characteristic of Salmonella typhimurium are induced by NH4VO3 in Escherichia coli K12. Detection of 4-amino-4-deoxy-L-arabinose, phosphoethanolamine and palmitate. The Journal of biological chemistry. 274, 18503-18514 (1999).
  41. Raetz, C. R., et al. Kdo2-Lipid A of Escherichia coli, a defined endotoxin that activates macrophages via TLR-4. Journal of lipid research. 47, 1097-1111 (2006).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Isolatie van lipide Aextractie van lipopolysacharidenmilde zuurhydrolysedunlaagchromatografiemassaspectrometrieMALDI TOF MSESI MS MSbotsingsge nduceerde dissociatieultraviolette fotodissociatie

Gerelateerde artikelen