Generatie en 3-dimensionale kwantificering van arteriële laesies in Muizen met behulp van optische projectie Tomografie

Samenvatting

Ex vivo analyse van arteriële laesies uit diermodellen van hart- en vaatziekten is klassiek gebaseerd op histologische en immunohistochemische technieken. Deze bieden 2-dimensionale metingen in 3-dimensionale laesies. Dit manuscript beschrijft de generatie van arteriële laesies voor kwantitatieve analyse in 3-dimensies met behulp van optische projectietomografie.

Samenvatting

Het genereren en analyseren van vasculaire laesies in geschikte diermodellen is een hoeksteen van het onderzoek naar hart- en vaatziekten, het genereren van belangrijke informatie over de pathogenese van laesievorming en de werking van nieuwe therapieën. Gebruik van atherosclerose vatbaar voor muizen, chirurgische methoden van laesie inductie, en dieet wijziging is drastisch verbeterd inzicht in de mechanismen die bijdragen aan de ontwikkeling van de ziekte en het potentieel van nieuwe behandelingen.

Klassiek wordt de analyse van lesies ex vivo in 2-dimensionale histologische technieken. Dit artikel beschrijft toepassing van optische projectie tomografie (OPT) om 3-dimensionale kwantificering van arteriële lesies. Omdat deze techniek is niet destructief, kan het worden gebruikt als een aanvulling op de standaard histologische en immunohistochemische analysen.

Neointimale laesies werden veroorzaakt door wire-inbrengen of ligatie van de muis dijbeen kunstery terwijl atherosclerotische lesies werden gegenereerd door toediening van een atherogeen dieet om apoE-deficiënte muizen.

Laesies werden onderzocht met behulp van OPT beeldvorming van autofluorescente emissie gevolgd door aanvullende histologische en immunohistochemische analyse. OPT duidelijk onderscheiden letsels van de onderliggende vaatwand. Laesie grootte werd berekend 2-dimensionale gebieden af ​​met planimetry, waardoor berekening van letselvolume en maximaal dwarsdoorsnedegebied. Gegevens die middels OPT kwamen overeen met metingen verkregen middels histologie en bevestigt daarmee de nauwkeurigheid van de techniek en zijn potentieel als complement (in plaats van alternatief) voor traditionele analysemethoden.

Dit werk toont het potentieel van OPT voor beeldvorming van atherosclerotische en neointima laesies. Het biedt een snelle, broodnodige ex vivo techniek voor de routine 3-dimensionale kwantificatie van vasculaire remodeling.

Inleiding

De vorming van arteriële lesies staat centraal in de hoge morbiditeit en mortaliteit geassocieerd met cardiovasculaire aandoeningen ^1. Letselvorming wordt geacht te worden veroorzaakt door vrijelijk ontstekingsreactie op verwonding ² arteriële. Atherosclerose vormen langzaam in reactie op chronisch letsel aan de vaatwand terwijl restenotische lesies snel ontstaan ​​nadat acute beschadigingen (bijvoorbeeld na stentimplantatie). De mechanismen die bijdragen tot de ontwikkeling van arteriële lesies zijn aanzienlijk verduidelijkt door het gebruik van geschikte dierlijke modellen, vaak in combinatie met relevante genetische manipulaties ^1.

Analyse van laesiegrootte en samenstelling klassiek sterk afhankelijk ex vivo, 2-dimensionale histologie (hoewel dit veranderen met de ontwikkeling van verbeterde werkwijzen voor in vivo en ex vivo detectie en analyse van letsels bij gezelschapsdieren ^{3). Histologische analyse van arteriële lesies is arbeidsintensief, tijdrovend en geeft weinig informatie over 3-dimensionale structuur. Zo wordt laesie belasting gewoonlijk bepaald door meting van de dwarsdoorsnede van een laesie (of op willekeurig gekozen plaatsen of op de plaats van maximale occlusie). Dit zorgt voor een onvolledige analyse van de totale laesie last. Whole-mount 3-dimensionale imaging technologie een mogelijke oplossing voor dit probleem maar verrassend weinig passende benaderingen zijn beschreven. Dit kan voornamelijk te wijten zijn aan de grootte van de muis slagaders die te groot is voor één-foton confocale microscopie maar te klein voor magnetic resonance imaging (MRI) 4 en X-ray computed tomography (CT) 5 zijn. Toepassing van ex vivo MRI en micro CT de studie van atherosclerotische lesies in muizen suggereert zij bieden beperkte resolutie, zelfs in relatief grote bloedvaten. Toegevoegd aan deze, de relatief lange overname tijden vereistbeperken doorvoer (en het verhogen van het scannen van de kosten) 4,6.}

Ontwikkeling van nieuwe optische beeldvorming modaliteiten (zoals optische coherentie tomografie ^3,7 en foto-akoestische tomografie ⁸⁾ biedt veel potentieel voor de verbetering van beeldvorming van laesies in muizen slagaders. Soortgelijke potentiaal wordt getoond door optische projectie tomografie (OPT), die werd ontwikkeld om de analyse van muizenembryo's mogelijk. OPT is ontworpen om de afbeelding exemplaren, variërend van ~ 0,3-10 mm in diameter ^9. Transmission imaging registreert de opaciteit van een semi-transparant monster polychromatisch zichtbaar licht, kunnen worden gebruikt ter identificatie van anatomische structuren. Emission beeldvorming gegevens lichtemissie na excitatie bij specifieke golflengten van endogene (bijvoorbeeld, collageen, elastine) en exogene fluoroforen in het monster. Dit kan ook anatomische informatie (aangezien verschillende weefselbestanddelen kunnen verschillen soortelijk gewicht van autofluorescente speciesaanwezig). Verder kan de verdeling van immunologische of genexpressie worden bepaald met behulp van geschikte fluorescente probes ^10. Voor beide imaging mode (transmissie of emissie), is licht gericht naar een charge-coupled device om iteratieve beeld vast te leggen als het monster roteert (meestal 400 beelden in stappen van 0,9 °) mogelijk te maken. Deze kunnen worden gebruikt voor het berekenen van het volume door middel van standaard tomografische reconstructie werkwijzen (bijvoorbeeld gefilterde terugprojectie (met een kegel algoritme) of iteratieve reconstructie).

Deze video toont onze nieuwe toepassing van OPT voor snelle, meetbare en rendabele 3-dimensionale analyse van atherosclerotische letsels en neointima, zoals eerder beschreven in Kirkby et al. ^11. De techniek is geschikt gebleken voor het kwantificeren laesiegrootte in drie veel gebruikte modellen zijn: (i) dij slagader wire-schade; (Ii) dijbeenslagader ligatie, en (iii) dieet-geïnduceerde atherosclerose bij apolipoprotein E deficiënte (apoE ^{- / -)} muizen.

Protocol

1. Chirurgische Inductie van Neointimale laesies in de muis Femorale Artery

1. Experimenten met dieren moeten worden uitgevoerd in overeenstemming met de nationale en institutionele ethische eisen. Alle operaties moeten worden uitgevoerd met behulp van de juiste aseptische techniek. Inductie van neointima laesies wordt bereikt door een modificatie van de door Roque et al. ¹² en Sata et al. ¹³ techniek.
2. Weeg mannelijke C57Bl6 / J muizen (leeftijd 10-12 weken; gewicht 25-30 g) dan verdoven door het leveren van 4-5% isofluraan in een inductie kamer. Zodra anesthesie werd geïnduceerd overdracht van de muis om een ​​mat verwarmd tot lichaamstemperatuur te handhaven bij 37 ° C. Continue toediening van isofluraan (2-3%) via een masker.
3. Zodra een passend niveau van anesthesie is geïnduceerd (gebrek aan respons tot teen knijpen), bieden pijnstillende dekking door toediening van buprenorfine (0,1 mg / kg ^-1). Plaats dan de muis in een rugligging eend scheren het ventrale oppervlak van de linker achterpoot.
4. Een insnijding aan de spieren van de bovenste achterbeen bloot en tussen de bifurcatie van de popliteale slagader en de buikwand, stompe dissectie tot de femorale slagader en ader van de femorale zenuw isoleren. Spoel de wond indien nodig middels 1% w / v lignocaïne.
5. Plaats proximaal (nabij de buikwand) en distale (direct onder de tak met de popliteale slagader) tijdelijke ligaturen (6/0 Mersilk) rond de femorale slagader en ader om bloed te regelen. Isoleren dan de arteria poplitea (ongeveer 2-5 mm distaal van de tak met de dijbeenslagader) en ligeren distaal. Plaats een tweede, ongebonden ligatuur onder de popliteale slagader.
6. Voeg een kleine incisie (arteriotomie) in de popliteale slagader onmiddellijk distaal van de tak met de femorale slagader, waardoor bloeden door druk op het proximale tijdelijke ligatuur. Advance een straight, opgesprongen 0,014 "geleidedraad1-1,5 cm langs de femorale slagader in de richting van de buikwand en laat in plaats van 30 seconden (Figuur 1A).
7. Verwijder de voerdraad en ligeren van de popliteale slagader boven de arteriotomie via de ligatuur geplaatst daartoe nodige voorzorgen de femorale slagader niet af te sluiten.
   LET OP: Voor-ligatie geïnduceerd letsel. Neointima remodeling intraluminale zonder schade kan worden geïnduceerd door ligatie van de femorale en popliteale slagaders (Figuur 1B en 1C). Om dit te bereiken volg de stappen 1,1-1,5. Echter, de arteriotomie niet maken, maar ofwel (i) (stap 1,6 vermijden) ligeren van de popliteale slagader onmiddellijk distaal van de femorale slagader of (ii) het ligeren femoralis communis aan het vertakkingspunt van de popliteale slagader. Ga dan verder met stap 1.8.
8. Verwijder tijdelijke ligaturen, sluit de wond met een discontinue externe hechtdraad (5/0 Mersilk) en toe te passen EMLA crème (2,5% lidocaïne, prilocaïne 2,5%). Laat de dieren opnieuw krijgen bewustzijn (meestal 5-10 min) en zorgen dat ze vrij bewegen rond hun kooi (lichte kreupelheid duidelijk aanwezig zijn in het aangedane been, maar dit moet oplossen over de eerste 2-3 dagen na de operatie) alvorens terug te keren op het houden van de kamers. Muizen hoeft niet alleen worden gehuisvest na de operatie.
9. Laat de dieren herstellen gedurende maximaal 3 maanden. Kleine laesies zal beginnen te verschijnen ~ 7 dagen na draad blessure en zal een stabiele maximale grootte bereiken na ~ 21-28 dagen.

2. Inductie van atherosclerotische laesies in de Apolipoproteïne E ^{- / -} Muizen

1. Dien westerse dieet (0,2% cholesterol, Research Diets, USA) om mannelijke, 6 weken oude ApoE-null muizen (gefokt in huis) gedurende 12 weken.
2. Atherosclerotische laesies zijn vaak zichtbaar op grove inspectie van de aortaboog en de hoofdtakken (figuur 2).

3. Analyseren arteriële laesies met behulp van Optical Projection Tomography (OPT)

nt "> NB: OPT beelden van de laesies in muizen femorale slagaders en aortaboog monsters werden verkregen met behulp van een optische projectie Tomografie.

1. Euthanaseren muizen door transcardiale perfusie fixatie en verbloeding onder terminale narcose (80 mg / kg natriumpentobarbital), middels gehepariniseerd (10 E / ml) met fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS) gevolgd door 10% neutraal gebufferde formaline.
2. Isoleer dijbeenslagaders of de aortaboog en haar belangrijkste takken (links halsslagader, links subclavia, brachiocephalicus romp), in voorkomend geval, en verwijder vreemde peri-adventitia materiaal. Post-fix in 10% gebufferde formaline O / N, vóór opslag in 70% ethanol tot gebruik.
3. Insluiten slagaders in 1,5% laag smeltpunt agarose, pre-gefilterd door Whatman 113 V papier. Bevestig elk monster aan een magnetisch OPT monteren met cyanoacrylaat lijm met het vat as in lijn met die van de berg. Trim overtollige agarose om een ​​conische vorm. Dehydrateer in 100% methanol gedurende ten minste 12 uur.
4. CLear schepen door onderdompeling (12-24 uur) in een mengsel van benzylalcohol en benzylbenzoaat (1: 2 v / v).
5. Plaats geklaard monsters in een gekalibreerde tomograaf. Stel besluit tot 1.024 x 1.024, en het bepalen van een optische vergroting waarmee het gehele gebied van belang te zien. OPT volume isotroop is de z-as wordt gereconstrueerd op dezelfde resolutie (bijvoorbeeld 1024 x 1024 x 1024), voxelafmeting ~ 200 urn. Dit kan een overschatting van de resolutie te vertegenwoordigen als er waarschijnlijk reconstructieartefacten zijn. Stel monsterpositie zodat het draait op zijn as in het midden van het gezichtsveld in de lichte-veld transmissiekanaal.
6. In de GFP1 filter emissie kanaal (excitatiefilter 425 nm met 40 nm band-pass; emissie-filter: 475 nm lange pass), richten het monster en stel de blootstelling tijd om het dynamische bereik van het resulterende beeld te maximaliseren (voorkomen dat over-verzadiging). Scan het schip in de GFP1 emissie enige kanaal, met een 0,9 ° rotatie stap.
7. Bij oplevering, bevestigt de kwaliteit van de data-acquisitie met behulp DataViewer software. Verwijder specimen van de scanner.
8. Om verdere histologische analyse, plaats monster in 100% methanol gedurende> 24 uur gewacht voordat verwerking wax paraffine als normaal.

4. Afbeelding Wederopbouw en Analyse

Tomografische reconstructie van gefilterde terugprojectie wordt uitgevoerd met behulp NRecon software of dergelijke. Reconstructies kunnen worden uitgevoerd zonder toezicht, in batches.

1. Verbeter de beeldkwaliteit door te compenseren voor verkeerde uitlijning en het aanpassen van het intensiteit niveaus.
2. Controleer de kwaliteit van het beeld reconstructie gebruik DataViewer software.
3. Identificeer het desbetreffende gedeelte van het monster voor analyse. Houd deze lengte consistente tussen schepen als luminale afmetingen worden geregistreerd.
4. Definieer de omtrek van de laesies door het handmatig traceren van de juiste grens 1 in elke 50 gereconstrueerde doorsneden.
5. Controleer elke doorschoten doorsnede om ervoor te zorgen door de computer gegenereerde interpolaties correct zijn. De grens met de hand aan te passen waar nodig.
6. Stel het grijsniveau drempel zodat alleen de laesie is geselecteerd en exporteren meetgegevens.
7. Bij elke aftasting, definiëren een verticale interessegebied met de laesie en teken de grens tussen media en neointima (ie., De positie van de interne elastische lamina) voor elke 50 ^th scanlijn. Interpoleren intima / media grenzen voor de interleaved scanlijnen in de software, en te verifiëren en te corrigeren de pasvorm waar nodig. Verdere segment deze gedefinieerd driedimensionale volume op een handmatig gedefinieerde intensiteit drempel naar een binair beeld set waarin witte pixels vertegenwoordigen neointima en zwarte pixels vertegenwoordigen patent lumen produceren.
8. Metingen zijn: totale laesie volume (volume object), luminale volume (totaal volume - volume object) en de verdeling van de laesie en lumen cross-sekteional gebied langs de axiale lengte van het onderzochte vat.

Resultaten

Voorlopige doorzoeken van gezonde (unlesioned) murine femorale arteriën (n = 5) aan dat overbrenging imaging geen bruikbare beelden. Dit was een gevolg van de geklaarde slagaders worden ook transparant (in plaats van ondoorzichtigheid) voor verzending imaging.However, dit is gunstig voor emissie beeldvorming als er geen absorptie / verstrooiing van het uitgezonden signaal. Daarentegen dijbeenslagaders autofluoresce sterk emissie kanaal met de grootste signaal na excitatie bij 405-445 nm (consistent met 410 nm excitatie piek van elastine ^14). 2-dimensionale plakjes gereconstrueerd op basis van deze beelden duidelijk te onderscheiden van de media uit de lumen en adventitia en lumen.

In murine femorale arteriën geoogst 28 dagen na draad- (n = 6) of ligation- (n = 5) geïnduceerd letsel neointimale verdikking bleek uit non-tomografische emissieprojecties (figuur 3A). In gereconstrueerd 2-dimensioional segmenten kunnen concentrisch neointima laesies worden onderscheiden van de media door de zwakkere emissie (Figuur 3B en Figuur S1).

OPT emissiebeelden van ganse berg monsters van de aortaboog en de hoofdtakken van atherosclerotische muizen (n = 8) die letsels met de verwachte anatomische verdeling (bijv., In de kleinere kromming van de aortaboog, de brachycefale slagader, en de oorsprong van de linker halsslagader en de linker subclavia bloedvaten (Figuur 4A). dwarsdoorsnedebeelden aangegeven dat het hier meestal excentrieke laesies en werden gemakkelijk onderscheiden van de media en lumen (figuur 4B, figuren S2 en S3).

Verwerking slagaders voor histologische analyse na OPT bevestigde de niet-destructieve aard van het OPT, met secties succes gekleurd met behulp van histologische (Verenigde Staten Trichrome, Picrosirius rood) en immunohistochemische (α-SMA, Mac-2) technieken (Figuren 3C en 4C).

Meting van laesiegrootte gebruik OPT aangetoond in overeenstemming met metingen verkregen met beeldanalyse van histologische doorsneden van dezelfde slagader ¹¹ worden.

Planimetrische metingen van laesiegebied verkregen OPT en histologie nauw gecorreleerd met lineaire regressie voor draadloze (R ² = 0,92) en ligatie geïnduceerde (R ² = 0,89) neointima laesies en atherosclerotische plaques (R ² = 0,85). Een belangrijk voordeel van OPT is de mogelijkheid om 3-dimensionale analyse mogelijk. Door het ontwikkelen volumetrische kwantificatie van letsels met deze techniek konden we laesie volumes opnemen in draadloze (0,1100 ± 0,0091 mm ^3, n = 6) en ligatie verwonde femorale arteriën (0,0200 ± 0,0089 mm ^3; n = 5) en in atherosclerotische brachiocephalic slagaders (0.180 ± 0.018 mm ^3; n = 8). Metingen werden zeer reproduceerbaar (variatiecoëfficiënten 5,4%, 11,4% en 4,8%, respectievelijk, n = 4) voor alle types laesie. Neointima laesies in-wire verwonde vaten waren groter (p <0,0001) dan die geproduceerd door ligatie, in overeenstemming met de grotere mate van schade veroorzaakt door de eerstgenoemde.

De gegenereerde data kunnen ook worden uitgedrukt als laesie profielen (Figuur 5) en gesmolten voor dynamische, kwalitatieve evaluatie (zie figuur S1 - S3). Deze benadering duidelijk de omvang van de lesie ontwikkeling als reactie op verschillende procedures verwonding versterkt en de ongelijke verdeling van laesievorming in verwonde vaten.

Figuur 1: Methoden voor het initiëren laesievorming in muizen dijbeenslagader & #.160, (A) Retrograde insertie van een angioplastie geleidedraad in de femorale slagader, door een arteriotomie in de popliteale slagader stimuleert laesievorming in respons op verwonding en verwijdering van het endotheel te rekken. Bloedstroom wordt hersteld over het gewonde deel van het schip. (B) Neo-intimale proliferatie in de afwezigheid van intraluminale stretch, erosie of onderbreking van de bloedstroom kan worden geïnduceerd door ligatie van ofwel de femorale of popliteale slagader onmiddellijk distaal van de femorale slagader bifurcatie. (C) Een ernstige niet-leegvissen letsel / proliferatie respons kan worden geïnduceerd door ligatie van zowel de femorale en popliteale slagaders over de aftakking van de arteria femoralis. Deze techniek zal ook blokkeren de bloedstroom in het distale deel van de femorale slagader.

Figuur 2:. Kenmerkend afzetting van atheroom in de muis aortaboog Atherosclerosis gevoelig (Apolipopotein E deficiënte muizen) gevoerd met een hoog cholesterol westers dieet 12 weken ontwikkelt een karakteristiek patroon van laesies afzetting in de aortaboog en de hoofdtakken. Zoals aangetoond, laesies zichtbaar (pijlen), grove inspectie onder een stereomicroscoop, de aortaboog, de brachycefale slagader, en de ostia van het linker halsslagader en de linker arteria subclavia.

Figuur 3:. Laesievorming na ligatie van de linker dijbeenslagader (A) Niet-tomografische fluorescentie-emissie afbeeldingen (omgekeerd om duidelijkheid te verhogen - donkere gebieden overeenkomen met sterkere emissie) maken de identificatie van intimaverdikking (rood arrowheadvertenties). (B) Verschillende vasculaire regio's en het lumen kan worden onderscheiden in tomografische reconstructies. (C) Histologische analyse (Verenigde Staten trichroom) benadrukt de duidelijke gelijkenis met beelden verkregen met behulp van OPT. Schaal bars in (AC) zijn 200 mm. Aangepast van Kirkby et al. ¹¹ Schaal bars in (AC) zijn 200 micrometer.

Figuur 4:. Imaging van atheroma in de aortaboog van atherosclerose vatbaar muizen (A) atheroma (rode pijlen) is duidelijk zichtbaar in de niet-tomografische beelden (omgekeerd zodat donkere gebieden geven sterker uitstoot, waardoor de verbetering van de duidelijkheid) van de aortaboog, op locaties voorspeld als atheroma-dragende door inspectie onder lichtmicroscopie (zie figuur 2). (B) Dit patroon van de distributie wordt bevestigd in tomografische cross-secties. (C) histologische (Verenigde Staten trichroom) vlekken toont gelijkenis met tomografische secties en immunohistochemie met behulp van verschillende antilichamen benadrukt het complementaire karakter van het OPT met traditionele benaderingen van laesie analyse. Schaalbalken in (A-B) zijn 1 mm; Schaalbalk in (C) is 250 pm. RSA, recht subclavia; RCA, rechter halsslagader; LCA, links halsslagader; LSA, linker subclavia; BCA, brachiocephalic slagader; AAO, oplopend aorta; Dao, dalende aorta. Aangepast van Kirkby et al. ¹¹

Figuur 5: Analyse van de laesie en lumen profielen geeft verschillende mate van neointima proliferatie in respons op verschillende methoden van slagaderletsel optische projectie tomografie maakt laesie en lumen dwarsdoorsnede measuremen.ts worden uitgezet tegen de afstand langs de femorale slagader. Hieruit blijkt duidelijk dat, in vergelijking met niet-beschadigde arterie (A), gedeeltelijke ligatie (B) produceert kleine, relatief discrete laesies, terwijl de totale ligatie (C) geeft een totale occlusie op de plaats van ligatie maar de laesie niet ver uitstrekken langs de slagader . Intraluminale wire letsel (D) geeft een laesie die bijna volledig afsluit het distale gedeelte van het monster en zich uitstrekt langs de gehele lengte van het afgetaste gedeelte van de slagader. Aangepast van Kirkby et al. ¹¹

Figuur S1. Animated reconstructie van cross-sectionele beelden verkregen uit een muis dijbeenslagader volgende ligatie letsel. Dit soort geanimeerde afbeelding is nuttig voor zowel de kwalitatieve en kwantitatieve analyse. Aangezien de animatie verplaatst van het proximale naar de distale gedeelten van de slagader de geleidelijke ontwikkeling van een occlusieve neointima, discernible van het lumen en de media is direct duidelijk. Zijtakken gemakkelijk kunnen worden geïdentificeerd en er is duidelijk luminale occlusie en buitenwaarts hermodellering van de arterie de laesie groter wordt. Volledige occlusie van het vat voorkomt ooit de ligatie wordt bereikt. Aangepast van Kirkby et al. ¹¹

.. Figuur S2 geanimeerde reconstructie van dwarsdoorsnedebeelden van een aorta van een atherosclerose-gevoelige muis De animatie begint met dwarsdoorsneden van de opgaande (linker - dat eerst verschijnt) en dalen (rechts) aorta. Kleine lesies verschijnen in opgaande aorta als scan beweegt in de richting van de aortaboog. De beelden bewegen dan door de boog naar de zwaar laesie ostia van de brachycefale (links), linker halsslagader (midden) en linker subclavia (rechts) slagaders vertonen. Als de scan beweegt distaal langs deze takken de letsels geleidelijk te verminderen en verdwijnen, eerst in de SUBCLavian slagader, dan in de carotis en uiteindelijk in de brachycefale slagader. Interessant is dat de laesie in de brachycefale slagader wordt doorgegaan met de stroomverdeler en het vat verdeelt in de rechter carotide slagaders en rechter subclavia. Aangepast van Kirkby et al. ¹¹

Figuur S3. Animaties, volume weergegeven beeld van een aorta van een atherosclerose-gevoelige muis. Optische projectie tomografie in het genereren van 3-dimensionale beelden, in dit geval het aantonen laesie distributie in de aortaboog van een apolipoproteïne E-deficiënte muizen. (A) atheroma aanwezig in de verwachte locaties (hele brachiocefale slagader, in de ostia van het linker carotide slagaders en subclavia en de geringere kromming van de aortaboog). (B) Segmentatie en weergave van laesie (in rood aangegeven) dragende doorsneden benadrukt de verdeling van de plaques bij bovenop de oorspronkelijke afbeelding.Aangepast van Kirkby et al. ¹¹

Discussie

3-dimensionale analyse heeft een groot potentieel voor de vervanging van of toevoeging aan de 2-dimensionale histologische technieken die nog steeds ten grondslag liggen aan de meerderheid van de onderzoeken van de arteriële laesievorming. Hier OPT wordt in kleine slagaders muizen (met murine femorale slagaders die waarschijnlijk de kleinste vaten die met succes kunnen worden geanalyseerd met deze techniek). Het is echter ook geschikt voor gebruik met bloedvaten (en laesies) van andere species, met inbegrip van kleine tot middelgrote menselijke vaten; onze groep heeft met succes gebruik gemaakt van de techniek om letsels bij konijnen aorta analyseren (Bezuidenhout et al;. ongepubliceerd). OPT zorgt voor sneller analyse en meer structurele informatie met traditioneel histologie en heeft het voordeel dat verdere analyse van het monster met behulp van zowel histologische en immunohistochemische technieken niet voorkomen.

De geproduceerd met behulp OPT beelden gaf anatomische details, tonen plaatsen van laesievormingen de omvang van lesies in deze gebieden. De arteriën die in deze onderzoeken zijn waarschijnlijk vlakbij de grens van de resolutie van de techniek en de beeldkwaliteit daardoor verminderd tot op zekere hoogte door artefacten (waarschijnlijk het gevolg van de rotatie verplaatsing, incomplete clearing, reflectie / refractie op agarose hoekpunten scherpstellingsproblemen) . Desondanks blijft de noodzakelijke gegevens (dwz lagen van de vaatwand) blijven onderscheiden en dus de techniek uiterst nuttig voor het kwantificeren van afzonderlijke lagen. Inderdaad kan beelden snel en reproduceerbaar worden gekwantificeerd metingen laesie en luminale volume in plaque-dragende gedeelten van het vaartuig, alsmede doorsneden van de laesie en lumen bieden op geselecteerde locaties in de sample. Large (aorta) en middelgrote (dijbeen, carotis, subclavia) muizen slagaders - die over het algemeen gebruikt voor de analyse van atherosclerotische en neotintimal laesievorming in muizen - succesvol warengeanalyseerd met deze methode. Inderdaad hebben we nu gebruikt OPT om het effect van farmacologische interventies en genetische manipulatie atherosclerotische en nieuwe intima verwondingsgrootte te tonen. Bijvoorbeeld, endotheline receptor blokkade veranderd neointimale laesievorming terwijl de selectieve verwijdering van de endotheline-B-receptor van de vasculaire endotheel niet ^15. In atherosclerose gevoelige muizen genetische deletie van de enzymen 11β-HSD1 ¹⁶ of galectine 3 ¹⁷ bleken de grootte van atherosclerotische lesies te verminderen.

Kwantificering van laesievolume is een duidelijk voordeel van OPT. Het geeft een meer informatieve indicatie van de totale laesie last in een slagader ⁴ dan meestal wordt verkregen met histologische methoden. Het analyseren van de gehele laesie vermindert selectie vertekeningen en fouten die onvermijdelijk zal optreden als verschillende onderdelen van een schip worden gekozen voor analyse. Productie van longitudinale lesie profielen is een verdere sterke OPT, Benadrukt door de vergelijking van lesies geïnduceerd door verschillende soorten letsel ^13,16 (Figuur 5). Bijvoorbeeld, zowel complete ligatie en wire-inbrengen veroorzaakte bijna totale occlusie dicht bij de femero-knieholte splitsing. Wire verwonding echter veroorzaakte laesies die zich uitstrekte over de gehele lengte van het afgetaste gedeelte, terwijl lesies veroorzaakt door arteriële ligatie snel kleine maat en verdwijnen. Dit patroon is consistent met de grotere omvang van de schade veroorzaakt door insertie van de angioplastiek geleidingsdraad. Het genereren vergelijkbare resultaten met behulp van histologische secties is duur, tijdrovend en arbeidsintensief.

De voordelen van OPT omvatten de kwaliteit van de beelden produceert en de relatieve snelheid en eenvoud (we routinematig afgetast 20 vaten per dag). Beeldkwaliteit weergegeven superieur of althans vergelijkbare andere werkwijzen voor het genereren van 3-dimensionale beelden ex vivo (zoals MRI en micro CT), yet OPT vereist kortere scantijden (integratie tijd voor onze studies was typisch 1-2sec / afbeelding) en het is minder duur. Monstervoorbereiding zich uitstrekt over meerdere dagen, maar vereist weinig arbeid, kunnen schepen worden voorbereid in batches, en de gegevens kunnen in één sessie worden verworven. Bijgevolg throughput hoog en niet langdurig gebruik van de scanner vereist. Belangrijk is dat de niet-destructieve karakter van OPT betekent dat het kan worden gebruikt om gebieden van belang zijn voor immunohistochemische onderzoek identificeren; dus de hoeveelheid snij- reduceren en kleuring vereist. Het is mogelijk dat de ontwikkeling van hoge resolutie ultrageluid een alternatieve werkwijze voor volumetrische kwantificatie van laesies in de slagaders deze grootte verschaft, maar de auteurs zich niet bewust van enige publicaties die deze aanvraag tonen.

Misschien niet verrassend, de beeldkwaliteit in OPT is inferieur aan microscopische technieken (die kan natuurlijk alleen worden uitgevoerd op kleinere monsters). Voorgestelde verfijningen aan Wederopbouwn van de gegevens kan deze beperking te pakken doordat toekomstige verbetering van de beeldkwaliteit ^19,20. Een andere zorg is dat methodologische Weefselbewerkingswerkwijze verandert kenmerken van het monster. Bijvoorbeeld de lipofiele aard van de klaringsmiddel, benzylalcohol / benzylbenzoaat (BABB), waarschijnlijk lipide van atherosclerotische lesies te verwijderen, terwijl vóór dehydratatie krimp veroorzaken (hoewel, natuurlijk, uitdroging en lipide -verwijdering zijn ook een kenmerk van steekproef voorbereiding voor het inbedden in paraffine). BABB werd gebruikt in dit onderzoek als in vergelijking met hydrofiele clearing middelen (bv glycerol ²¹⁾ veroorzaakt slechts kleine veranderingen in de morfologie.

Er zijn verschillende mogelijkheden voor verdere ontwikkeling en verfijning van OPT, met name wat het volgen van de 3-dimensionale rangschikking van sleutelcellen en signalering factoren betrokken bij arteriële hermodellering. De sterke autofluorescentie van arterieel weefsel, die zon voordeel bij het ​​genereren van anatomische beelden, wordt niet gestopt door bestaande methoden van bleken ²² en kunnen het gebruik van fluorescente probes beperken RNA en eiwit distributiepatronen bepalen. Het gebruik van colorimetrische probes (bijv β-galactosidase) gevisualiseerd door overdracht beeldvorming kan deze beperking te overwinnen.

Tot slot, OPT heeft een groot potentieel voor de 3-dimensionale beeldvorming van laesies in de intima van muizen slagaders. Het vertegenwoordigt een aanzienlijke vooruitgang op 2-dimensionale methoden die over het algemeen arbeidsintensief en niet effectief totale laesie volume vertegenwoordigen. OPT is relatief snel, gemakkelijk en niet-destructief. Nieuwe ontwikkelingen in de beeldanalyse belofte om verder te verhogen de kracht en het nut van de techniek.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Operating Microscope	Zeiss, Germany		OPMI Pico i
Anesthetic Machine	Vet Tech, UK
Fluovac	Harvard Apparatus UK	340387
Fluosorber	Harvard Apparatus UK	340415
Bead Sterilizer	Fine Science Tools, UK	1800-45
Heated Mat	Fine Sceince Tools, UK	21061-10
Balance	Mettler Toledo	MS1602S	PB1502 of equivalent
Sutures	Ethicon, UK		5/0 Mersilk
Guidewire	Cook Inc, USA	C-PMS-251	0.014”
Suture Silk	Fine Science Tools, UK	18020-60	6/0 Mersilk
Surgical Tools	Fine Science Tools, UK	14058-09	Toughcut Iris scissors
Cohan-Vannas Spring Scissors	Fine Science Tools, UK	15000-01
Dumont #5/45 Forceps	Fine Science Tools, UK	11251-35
Moria Iris Forceps	Fine Science Tools, UK	11370-31
Halsted-Mosquito Hemostat	Fine Science Tools, UK	13008-12
Bulldog clips	Fine Science Tools, UK	18050-35
Bioptonics 3001 Tomograph	Bioptonics, UK
Magnetic OPT Mount	Bioptonics, UK
Computer	Dell Inc, UK
Peristaltic pump	Gilson	F117606	Minipuls 3
DataViewer software	Skyscan, Belgium	v.1.4.4
NRecon software	Skyscan, Belgium	v.1.6.8
CTan software	Skyscan, Belgium	v.1.12
Isoflurane	Merial Animal Health Ltd, UK	AP/Drugs/220/96	100% Inhalation vapor, liquid
Medical Oxygen	BOC Medical, UK	UN1072
Vetergesic	Alstoe Animal Health Ltd, UK		0.3 mg/ml
1% Lignocaine	Hamlen Pharmaceuticals, UK	LD1010	10 ml ampoule
EMLA Cream	Astra Zeneca, UK
Sodium Pentobarbital	Ceva Animal Health Ltd, UK
Western Diet	Research Diets, USA	D12079B	0.2% cholesterol
Phosphate Buffered Saline	Sigma UK	P4417
Heparin (Mucous)	Leo Laboratories, UK	PL0043/003GR	250,000 Units
Neutral Buffered Formalin	Sigma, UK	HT501128	10%
Ethanol	VWR BDH Prolabo, UK	20821.33	Absolute AnalaR
Agarose	Invitrogen, UK	16020050	Low melting point
Filter Paper	GE Healthcare, UK	113v	Whatman
Cyanoacrylate adhesive	Henkel, UK	4304	Loctite
Benzyl alcohol	Sigma, UK	B6630
Benzyl benzoate	Sigma, UK	402834
Methanol	VWR BDH Prolabo, UK	20856.296	100%