We beschrijven het gebruik van twee ratiometrische, genetisch gecodeerd biosensoren, die zijn gebaseerd op GFP, om mitochondriale redox staat en ATP-spiegels te controleren bij subcellulaire resolutie in levende gistcellen.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Ratiometrische Biosensoren dat mitochondriaal Redox Staat en ATP Meet in Living gistcellen
* These authors contributed equally
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Mitochondria rollen in vele cellulaire processen, van energiemetabolisme en calcium homeostase te controleren van cellulaire levensduur en geprogrammeerde celdood. Deze processen beïnvloeden en worden beïnvloed door de redox status en ATP productie mitochondria. Hier beschrijven we het gebruik van twee ratiometrische, genetisch gecodeerd biosensoren die mitochondriale redox staat en ATP niveaus kan detecteren bij subcellulaire resolutie in levende gistcellen. Mitochondriale redoxstatus wordt gemeten met redox-gevoelige Green Fluorescent Protein (roGFP) die is gericht op de mitochondriale matrix. Mito-roGFP bevat cysteïnes op posities 147 en 204 van GFP, die reversibel en omgevingsafhankelijke oxidatie en reductie, die op zijn beurt verandert de excitatie-spectrum van het eiwit ondergaan. MitGO-ATeam een Förster-energieoverdracht (FRET) probe waarin ε subeenheid van het F F o is 1-ATP synthase ingeklemd tussen FRET donor en acceptor fluorescent eiwitten. Binding van ATP aan de ε subeenheid resulteert in conformatie verandering in het eiwit dat brengen de FRET donor en acceptor in dichte nabijheid en zorgen voor fluorescentie resonantie energieoverdracht van de donor naar acceptor.
Inleiding
Mitochondriën zijn organellen essentieel voor ATP productie, biosynthese van aminozuren, vetzuren, heem ijzer zwavel clusters en pyrimidines. Mitochondriën ook spelen cruciale rollen in calcium homeostase, en bij de regulatie van apoptose. 1 Toenemend bewijs koppelingen mitochondriën tegen veroudering en leeftijd gerelateerde ziekten, waaronder de ziekte van Parkinson, de ziekte van Alzheimer, amyotrofe laterale sclerose en de ziekte van Huntington. 2 Terwijl individuen leven hun hele leven met veranderingen in mitochondriale eiwitten die worden geassocieerd met neurodegeneratieve aandoeningen, de ziekte symptomen pas later in het leven. Dit gee....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
1. Transformatie van gistcellen de Biosensoren
- Transformeren de gewenste giststam met plasmide dragende mito-roGFP of mitGO-ATeam2 met de lithiumacetaat methode 27.
- Om transformatie te bevestigen met het plasmide gedragen biosensor en tot verlies van het plasmide voorkomen, selecteert en transformanten op het geschikte selectieve synthetische compleet medium (SC-Ura voor mito-roGFP of SC-Leu voor mitGo-ATeam2) te behouden. Als de fluorescente probe werd gesubkloneerd in een ander plasmide dan de hier beschreven, gebruikt u de geschikte selectieve voedingsbodem. Visualiseren transformanten door fluorescentie microscopie te bevestigen da....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
Het meten van mitochondriale redox staat met mito-roGFP
Hier laten we zien dat mito-roGFP1 heeft het dynamische bereik van veranderingen in mitochondriale redox toestand detecteren van volledig geoxideerd tot gereduceerd levende gistcellen, zonder de gist celgroei of mitochondriale morfologie. Ten eerste, vinden we cellen die mitochondria-gerichte GFP en roGFP1 groeien in normale tarieven (Figuur 1A). De maximale groeisnelheid, zoals gemeten door de maximale helling van de groe.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
Hier beschrijven we methoden om mito-roGFP1 en mitGO-ATeam2 gebruiken als biosensoren om mitochondriale redox staat en ATP-niveau te beoordelen in levende gistcellen. Wij vinden dat de expressie van plasmide gedragen mito-roGFP1 of mitGO-ATeam resultaten in kwantitatieve doelstelling voor mitochondria, zonder enig duidelijk effect op de mitochondriale morfologie of distributie of op de cellulaire groei. 3 Mito-roGFP1 kan detecteren veranderingen in de mitochondriale redox toestand van zeer geoxideerd tot ster.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
Geen belangenconflicten verklaard.
Dankbetuigingen
Dit werk werd ondersteund door de awards van HHMI 56006760 tot JDV, de National Institutes of Health (NIH) (2 TL1 RR 24158-6) te DMAW, en van de Ellison Medical Foundation (AG-SS-2465) en het NIH (GM45735, GM45735S1 en GM096445) naar LP. GM45735S1 werd afgegeven vanaf de NIH onder de Amerikaanse Terugwinning en Reinvestment Act van 2009. De microscopen gebruikt voor deze studies werden ondersteund in het kader door middel van een NIH / NCI subsidie (5 P30 CA13696).
....Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| Reagenten | |||
| Antimycin A | Sigma-Aldrich (St. Louis, MO) | 1397-94-0 | Opgelost in ethanol tot een stockoplossing van 2 mg/ml. |
| SGlyc (synthetisch glycerol-gebaseerd) gistgroeimedium *verzenden voor SGlyc-Ura **verzenden voor SGlyc-Leu | Oplossen in H2O. Breng pH aan op 5,5 met NaHCO3. Autoclaveer. Ingrediënten: 0,67% Gist stikstofbasis zonder aminozuren 3% Glycerol 0,05% Glucose 2 mg/ml adenine 2 mg/ml uracil* 1 mg/ml L-arginine 1 mg/ml L-histidine 1 mg/ml L-leucine** 3 mg/ml L-lysine 2 mg/ml L-methionine 4 mg/ml L-fenylalanine 2 mg/ml L-tryptofaan 3 mg/ml L-tyrosine | ||
| SC (synthetisch compleet, glucose-gebaseerd) gistgroeimedium *verzenden voor SGlyc-Ura **verzenden voor SGlyc-Leu | Oplossen in H2O. Breng pH aan op 5,5 met NaHCO3. Autoclaveer. Ingrediënten: 0,67% Gist stikstofbasis zonder aminozuren 3% Glucose 2 mg/ml adenine 2 mg/ml uracil* 1 mg/ml L-arginine 1 mg/ml L-histidine 1 mg/ml L-leucine** 3 mg/ml L-lysine 2 mg/ml L-methionine 4 mg/ml L-fenylalanine 2 mg/ml L-tryptofaan 3 mg/ml L-tyrosine | ||
| Valap | Combineer de ingrediënten in een 1:1:1 (w:w:w) verhouding. Smelt door onderdompeling in een H2O-bad van 70 °C. Verdeel in glazen petrischalen. Bewaar op kamertemperatuur. Ingrediënten: Vaseline petroleumgelei, harde paraffine, lanoline | ||
| Uitrusting en software | |||
| Voorgezuiverde Gold Seal Rite-on Micro Slides | Thomas Scientific (Swedesboro, NJ) | 3050 | Grootte: 25 x 75 mm; Dikte: 0,93 tot 1,05 mm |
| Hoge prestatie dekglasjes, No. 1,5, 18x18 mm | Zeiss (Thornwood, NY) | 474030-9000-000 | Deze zijn minder variabel in dikte (170±5 μm) dan standaard dekglasjes, wat sferische aberratie vermindert en de prestaties van 3D-beeldvorming verbetert |
| Fisherbrand Microscoop Dekglas, No. 1,5 | Fisher Scientific (Pittsburgh, PA) | 12-545E | Grootte: 22 x 22 mm, No. 1,5 dikte (170 μm) |
| A1 laser scanning confocal microscoop met spectraal detector en 100x/1,49 NA Apo-TIRF objectief | Nikon (Melville, NY) | ||
| AxioObserver.Z1 microscoop uitgerust met een 100x/1.3NA EC Plan-Neofluar objectief (Zeiss) en Orca ER gekoelde CCD camera (Hamamatsu) en bestuurd door Axiovision software | Zeiss (Thornwood, NY); Hamamatsu (Hamamatsu City, Japan) | ||
| Volocity 3D beeldanalysesoftware | Perkin Elmer (Waltham, MA) | Restauratiemodule voor deconvolutie; Kwantitatieve module voor verhoudingsberekening en meting | |
| ImageJ software | National Institutes of Health (Bethesda, MD) | http://rsb.info.nih.gov/ij/ |
Referenties
- Rizzuto, R., De Stefani, D., Raffaello, A., Mammucari, C. Mitochondria as sensors and regulators of calcium signalling. Nature reviews. Molecular Cell Biology. 13 (9), 566-578 (2012).
- Nunnari, J., Suomalainen, A. Mitochondria: in sickness and in health. Cell. 148 (6),....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
