Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

Ratiometrische Biosensoren dat mitochondriaal Redox Staat en ATP Meet in Living gistcellen

21.1K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/50633

⸱

22 juli 2013

 ,  ,  ,  , 
1Department of Pathology and Cell Biology, Columbia University, 2Herbert Irving Comprehensive Cancer Center, Columbia University

* These authors contributed equally

In dit artikel

Samenvatting

We beschrijven het gebruik van twee ratiometrische, genetisch gecodeerd biosensoren, die zijn gebaseerd op GFP, om mitochondriale redox staat en ATP-spiegels te controleren bij subcellulaire resolutie in levende gistcellen.

Samenvatting

Mitochondria rollen in vele cellulaire processen, van energiemetabolisme en calcium homeostase te controleren van cellulaire levensduur en geprogrammeerde celdood. Deze processen beïnvloeden en worden beïnvloed door de redox status en ATP productie mitochondria. Hier beschrijven we het gebruik van twee ratiometrische, genetisch gecodeerd biosensoren die mitochondriale redox staat en ATP niveaus kan detecteren bij subcellulaire resolutie in levende gistcellen. Mitochondriale redoxstatus wordt gemeten met redox-gevoelige Green Fluorescent Protein (roGFP) die is gericht op de mitochondriale matrix. Mito-roGFP bevat cysteïnes op posities 147 en 204 van GFP, die reversibel en omgevingsafhankelijke oxidatie en reductie, die op zijn beurt verandert de excitatie-spectrum van het eiwit ondergaan. MitGO-ATeam een Förster-energieoverdracht (FRET) probe waarin ε subeenheid van het F F o is 1-ATP synthase ingeklemd tussen FRET donor en acceptor fluorescent eiwitten. Binding van ATP aan de ε subeenheid resulteert in conformatie verandering in het eiwit dat brengen de FRET donor en acceptor in dichte nabijheid en zorgen voor fluorescentie resonantie energieoverdracht van de donor naar acceptor.

Inleiding

Mitochondriën zijn organellen essentieel voor ATP productie, biosynthese van aminozuren, vetzuren, heem ijzer zwavel clusters en pyrimidines. Mitochondriën ook spelen cruciale rollen in calcium homeostase, en bij de regulatie van apoptose. 1 Toenemend bewijs koppelingen mitochondriën tegen veroudering en leeftijd gerelateerde ziekten, waaronder de ziekte van Parkinson, de ziekte van Alzheimer, amyotrofe laterale sclerose en de ziekte van Huntington. 2 Terwijl individuen leven hun hele leven met veranderingen in mitochondriale eiwitten die worden geassocieerd met neurodegeneratieve aandoeningen, de ziekte symptomen pas later in het leven. Dit geeft aan dat veranderingen in mitochondria leeftijd die pathologie naar voren toe. Inderdaad, wordt mitochondriale fitness gecorreleerd met de algemene gezondheid van de cellen en de levensduur in gist en zoogdiercellen. 3,4 We beschrijven hier hoe genetisch gecodeerd, ratiometrisch fluorescerende biosensoren gebruiken om twee cruciale kenmerken van mitoc beoordelenhondria in levende gistcellen: redoxtoestand en ATP niveaus.

Mitochondriale functie in aërobe energie mobilisatie is goed ingeburgerd. Mitochondriale redox staat een product te verminderen en oxiderende species in het organel, waaronder NAD + / NADH, FAD / FADH 2, NADP + / NADPH, glutathion / disulfide glutathion (GSH / GSSG) en reactieve zuurstof species (ROS). Ontkoppelen mitochondriën of hypoxie invloed mitochondriale respiratoire activiteit en verandert de verhouding van NAD + naar NADH in het organel. ROS, die producten met inefficiënte elektronenoverdracht tussen complexen van de elektronen transportketen in het binnenste mitochondriale membraan, evenals van de deaminering van aminen door monoamine oxidase in de buitenste mitochondriale membraan 5, beschadiging lipiden, eiwitten en nucleïnezuren en hebben in verband gebracht met veroudering en aanverwante neurodegeneratieve ziekten 6,7,8. ROS spelen ook een rol bij de signaaloverdracht in mitochondria, door oxidatie van GSH. Bijvoorbeeld, NADH dehydrogenase niet alleen bijdraagt ​​aan ROS productie, maar ook wordt gereguleerd door interacties met de glutathion zwembad 9,10. α-Ketoglutaraat dehydrogenase en aconitase, onderdelen van de TCA-cyclus, vertonen verminderde activiteit in oxiderende omgevingen 11,12.

Inderdaad, wordt redox-afhankelijke regulatie van aconitase activiteit behouden van bacteriën tot zoogdieren 13,14. Zo is het toezicht op de redox staat en ATP niveaus van mitochondria is cruciaal voor het begrijpen van hun functie en rol in de ziekte pathologie.

Biochemische methoden zijn gebruikt om de redox toestand of ATP niveaus van hele cellen te beoordelen of geïsoleerde mitochondria. Gebruikte methoden om de redox toestand van gehele cellen of geïsoleerde mitochondria beoordelen op basis van metingen van de niveaus van de redox pair GSH / GSSG 15. De luciferine-luciferase-systeem wordt vaak gebruikt om mitochondriale metenATP niveaus in zowel permeabel gehele cellen of geïsoleerde mitochondria. 16,17,18,19,20 In deze bepaling bindt aan luciferase en ATP katalyseert de oxidatie van luciferine en chemiluminescentie uit. 21 De intensiteit van het uitgezonden licht is evenredig met de van ATP in het reactiemengsel. 22

Deze methoden zijn fundamentele informatie onthuld over mitochondriale functie, zoals de vaststelling dat patiënten met neurodegeneratieve ziekten, zoals de ziekte van Alzheimer hebben abnormaal lage ATP. 23 Evenwel kunnen zij niet worden gebruikt voor beeld levende intacte cellen. Bovendien methoden op basis van hele cellen analyses gemiddeld redox state of ATP in alle compartimenten van de cel. Metingen in geïsoleerde organellen zijn potentieel problematisch omdat mitochondriale redox state-of ATP-niveaus kan veranderen tijdens subcellulaire fractionering. Tot slot, recente studies in ons laboratorium en anderen geven aan datmitochondriën in individuele cellen heterogeen functie, dat op zijn beurt de levensduur van moeder en dochtercellen. 3 Er bestaat derhalve behoefte aan mitochondriale ATP en redoxstatus meten levende cellen met subcellulaire resolutie.

De biosensoren voor mitochondriale beschreven zijn beide gebaseerd op GFP. Redox-gevoelige GFP (roGFP) 24,25 is een GFP variant waarin oppervlakgeëxponeerde cysteïnen worden toegevoegd aan het molecuul. roGFP, zoals wild-type GFP, heeft twee excitatie pieken (bij ~ 400 nm en 480 nm ~) en een emissie piek bij ~ 510 nm. Oxidatie van de cysteïneresten in roGFP resulteert in een toename van excitatie bij -400 nm. Vermindering van die cysteïnen gunsten excitatie bij ~ 480 nm. Zo is de verhouding van 510 nm emissie bij excitatie van roGFP bij 480 nm en 400 nm toont de relatieve hoeveelheid van gereduceerde en geoxideerde roGFP, waarbij de redox toestand van het milieu de fluorofoor weerspiegelt.

Twee versionen van roGFP worden veel gebruikt: roGFP1 en roGFP2. Beide bevatten dezelfde cysteïne inserties. roGFP1 gebaseerd op de wild-type GFP en roGFP2 gebaseerd op S65T GFP, die efficiënter excitatie bij 480 nm en minder efficiënte excitatie bij 400 nm ten opzichte van wtGFP 24. roGFP1 is minder pH-gevoelig dan roGFP2 en zijn dynamische bereik strekt zich verder in de lagere bereik. Aldus kan roGFP1 meer nuttig om meer verminderen compartimenten zoals mitochondria of cytosol en vakken met variabele pH, zoals endosomen. roGFP2 biedt helderder signaal en, in sommige studies, een groter dynamisch bereik dan roGFP1 24,26. Studies in Arabidopsis thaliana blijkt dat de tijd die reageren op veranderingen in redox toestand gelijk voor beide sensoren (t ½ voor oxidatie, 65 en 95 sec en t ½ tot beperking, 272 en 206 sec voor roGFP1 en roGFP2 respectievelijk). 26

MitGO-ATeam2 is een minimaal invasieve, betrouwbaresensor die mitochondriale ATP meet in de gist Saccharomyces cerevisiae. GO-ATeam een Förster-energieoverdracht (FRET) probe die bestaat uit de ε-subeenheid van de F F o 1-ATP synthase ingeklemd tussen FRET donor en acceptor fluorescerende eiwitten (GFP en oranje fluorescerend eiwit (OFP), respectievelijk). 27 binding van ATP aan de ε-subeenheid leidt tot conformatieveranderingen in het eiwit die brengen de FRET-donor in de nabijheid van de acceptor en zorgen voor energieoverdracht van donor naar acceptor. Er zijn twee varianten van de GO-ATeam, GO-ATeam1 en GO-ATeam2. GO-ATeam2 een hogere affiniteit voor MgATP dan GO-ATeam1, waardoor het ge-schikt voor potentieel lagere [ATP] in mitochondria opzichte van de cytosol. 27

De mitochondriale redox toestand sonde, construeerden we een fusie-eiwit (mito-roGFP1) bestaande uit roGFP1 gefuseerd met de ATP9 leader sequentie eennd expressie van een centromeer verkregen (low copy number) plasmide van gist expressie onder controle van de sterke glyceraldehyde-3-fosfaatdehydrogenase (GPD) promoter (p416GPD, Addgene). We gebruikten roGFP1 de redox status van mitochondria sonde in de context van de veroudering van het model schimmel Saccharomyces cerevisiae. We vinden dat roGFP1 kan detecteren veranderingen in mitochondriale redox toestand die tijdens veroudering en in reactie op beschikbaarheid van voedingsstoffen, maar heeft geen zichtbaar nadelig effect op gistcellen. We zien ook variabiliteit in de redox toestand van de mitochondriën in individuele levende gistcellen, een bevinding die het belang van een biosensor met subcellulaire ruimtelijke resolutie onderstreept.

MitGO-ATeam2 is een variant van GO-ATeam2, waarbij de signaalsequentie van mitochondriale cytochroom c oxidase subeenheid VIII A toegevoegd aan de aminoterminus van GO-ATeam2 heeft. 27 We pasten de mitGO-ATeam2 probe (vriendelijk verschaft door het laboratorium van H. Noji, Instituut of Wetenschappelijk en Industrieel Onderzoek, Universiteit van Osaka, Japan) voor gebruik in gist door subkloneren het, via Xba1 en HindIII plaatsen, in de gistexpressievector pAG415GPD-ccdB (Addgene, Cambridge, MA, USA), dat is een low-copy plasmide met de sterke constitutieve GPD promoter. We uitgedrukt mitGO-ATeam2 in gist, aanbod door tegenkleuring met de DNA-bindende kleurstof DAPI, dat lokaliseert uitsluitend mitochondriën, waar het als een effectieve probe om fysiologische veranderingen in mitochondriale ATP te meten.

roGFP en GO-ATeam zijn zowel genetisch gecodeerd. Daardoor kunnen ze worden geïntroduceerd en stabiel gehandhaafd in intacte cellen en informatie over redoxstatus of ATP in individuele, levende cellen. Bovendien hebben beide biosensoren monitoren veranderingen in redox staat of ATP-niveaus die optreden onder fysiologische omstandigheden. 28 Beide sondes zijn ook ratiometrische. Dientengevolge, worden de metingen die met deze probes niet door change's in biosensor concentratie of monster verlichting of de dikte. Tot slot, zowel biosensoren bieden subcellular ruimtelijke resolutie. Inderdaad, roGFP is gericht op mitochondria, ER, endosomen en peroxisomen 24 en kan detecteren veranderingen in redox status van elk van deze organellen, grotendeels onafhankelijk van de pH.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

1. Transformatie van gistcellen de Biosensoren

  1. Transformeren de gewenste giststam met plasmide dragende mito-roGFP of mitGO-ATeam2 met de lithiumacetaat methode 27.
  2. Om transformatie te bevestigen met het plasmide gedragen biosensor en tot verlies van het plasmide voorkomen, selecteert en transformanten op het geschikte selectieve synthetische compleet medium (SC-Ura voor mito-roGFP of SC-Leu voor mitGo-ATeam2) te behouden. Als de fluorescente probe werd gesubkloneerd in een ander plasmide dan de hier beschreven, gebruikt u de geschikte selectieve voedingsbodem. Visualiseren transformanten door fluorescentie microscopie te bevestigen dat zij uitdrukking aan de tl-biosensor en vertonen normale mitochondriale morfologie.

2. De groei van cellen en voorbereiding voor Imaging

Celfunctie en respons op behandeling met geneesmiddelen sterk afhankelijk celdichtheid metabolische activiteit. De beste resultaten worden verkregen wanneer cellenactief delende (mid-log fase ~ 0,5-1 x 10 7 cellen / ml). De meest betrouwbare manier om de mid-log fase kweken van constante dichtheid te genereren is het enten van een stationaire fase pre-culture.

  1. Bereid een stationaire-fase pre-cultuur: kies een enkele kolonie van getransformeerde cellen uit een bord en enten selectieve vloeibare media (5 ml in een ml conische bodem buis 50). Groeien bij 30 ° C onder schudden bij 225 rpm totdat de optische dichtheid van de kweek bij 600 nm (OD 600) een plateau (24-48 uur) heeft bereikt.
  2. Bereid een mid-log-fase cultuur voor observatie: de juiste omvang van de pre-cultuur aan 5 ml van selectieve media enten in een 50 ml conische bodem buis. YPD media autofluorescente en mag niet worden gebruikt voor deze studies. Gebruik synthetische compleet, glucose gebaseerd, uitval (SC-Ura) media. Cellen groeien bij 30 ° C, onder schudden bij 225 rpm, gedurende 4-16 uur, totdat deze mid-log fase (~ 0,5-1 x 10 7 cellen / ml) te bereiken. Celdichtheid worden bepaalddoor het meten van OD 600, de spectrofotometer te kalibreren op de juiste OD 600 lezen bepalen. Op onze Beckman DU530 (Beckman Coulter, Indianapolis, IN), mid-log fase komt overeen met een OD 600 van 0.1-0.3.

Mito-roGFP1 detecteert schommelingen in het organel in reactie op metabole veranderingen. Bijvoorbeeld, in deze test mitochondriale redox status verandert als gist groeien fermenteerbare koolstofbronnen (bv. glucose, zoals in SC media) versus niet-fermenteerbare koolstofbron (bijv. glycerol, zoals in SGlyc media), en zelfs in verschillende batches van hetzelfde media. Gebruik daarom dezelfde batch van de media voor alle experimenten.

  1. Cellen zijn klaar voor de concentratie (zie stap 2.4) en beeldvorming indien geen behandeling wordt uitgevoerd. Als cellen worden behandeld, incubeer cellen met de juiste behandeling en verder met de volgende stap.
  2. Concentraat 1 ml van de cultuur door centrifugeren bij 6000 xg gedurende 15 sec enresuspensie van de celpellet in 20 pl media. Deze voorwaarden maximaliseren het aantal onderscheiden cellen in het gezichtsveld.
  3. Breng 2 ul van de geresuspendeerde cellen een dia. Dek af met een dekglaasje (nr. 1.5, bij voorkeur high-performance 170 ± 5 micrometer dik), en sluit de randen van het dekglaasje met duidelijke nagellak of valap (zie reagentia). Om verzegelen valap, smelt een kleine hoeveelheid op een metalen spatel met het over een Bunsen brander vlam, dan verspreid een kleine hoeveelheid langs de randen van het dekglaasje.
  4. Handhaaf cellen bij 30 ° C tijdens de beeldvorming. Een objectieve kachel het 100x olie-immersie objectief voor imaging werkt goed voor deze toepassing. Onder deze omstandigheden, mitochondriale morfologie, redoxtoestand en ATP niveaus ongewijzigd blijven tijdens beeldvorming voor 10-15 minuten.

3. Imaging Setup

  1. Setup voor de beeldvorming mito-roGFP1 op een wide-field fluorescentiemicroscoop
    De stappen hier zijn afgestemd op de AxioObserver.Z1 microscoop uitgerust met een Colibri LED excitatiebron, een wide-field Orca ER camera en AxioVision acquisitie software. Fotobleken van beide kanalen en photoconversion van geoxideerde mito-roGFP1 wordt aanzienlijk verminderd gebruik van LED-verlichting in vergelijking met kwik booglamp verlichting (zie hieronder).
    Om signaalkwaliteit en resolutie te maximaliseren, gebruikt u de hoogste numerieke opening mogelijk in het doel, en de kleinste vergroting die voldoende ruimtelijke resolutie biedt. Bovendien, voor de mito-roGFP imaging, controleert u of de doelstelling zendt zowel bij 365 nm. De 100x/1.3NA EG PlanNeofluar objectief (Zeiss) werkt goed voor deze toepassing.
    De acquisitie software configureren om de geoxideerde en gereduceerde mito-roGFP1 soorten vangen. We maken gebruik van de volgende voorwaarden.
    1. Het kanaal voor geoxideerde mito-roGFP te gebruiken excitatie 365 nm (100% vermogen LED) en een emissie-filter voor GFP, zoals de 38 HE filter set (Zeiss) configureren met de meegeleverde excitation filter verwijderd uit de kubus. Verwijdering van de excitatie-filter kan zowel excitatie bij 365 nm en 470 nm zonder de noodzaak om filters te schakelen, waardoor haalbare tijdsresolutie.
    2. Het kanaal voor verlaagde mito-roGFP configureren excitatie gebruiken bij 470 nm (100% LED vermogen) en, zoals hierboven vermeld, dezelfde emissie-filter blok voor de geoxideerde mito-roGFP. Stel de camera in op 1x1 binning om ruimtelijke resolutie te optimaliseren.
    3. Stel software az stack bestaande uit 11 segmenten met 0,5 urn afstand, verzamelen beide kanalen op elke positie z verwerven. Deze wijze van overname is langzamer dan het verwerven van elke z stack op zijn beurt, maar het voorkomt artefacten als gevolg van mitochondriale beweging tussen verwerving van de geoxideerde en gereduceerde kanalen.
    4. Afbeelding meerdere cellen om de juiste belichting te bepalen, het produceren van een sterke, maar niet verzadigen signaal. Het is belangrijk om de verhouding van belichtingstijden handhaven gedurende geoxideerde en gereduceerde mito-roGFP1 voor experiments. Als bijvoorbeeld de belichtingstijden geoxideerde en gereduceerde mito-roGFP1 zijn 300 en 100 msec, respectievelijk dan de belichtingstijd voor geoxideerde mito-roGFP1 moet 3 maal die niet verminderd mito-roGFP voor alle experimenten.
  2. Setup voor de beeldvorming mitGO-ATeam2 op een spectrale confocale microscoop
    ATP niveaus met behulp mitGO-ATeam2, de fluorescentie van GFP (emissie maximaal 510 nm) gekwantificeerd moet worden onderscheiden van die van OFP (emissie maximaal 560 nm). Er zijn fluorescentie filter sets die de fluorescentie uitgestraald door deze fluoroforen lossen. Echter, vinden we dat een spectrale detector, beschikbaar op veel laser scanning confocale microscopen, het beste werkt voor deze toepassing. Een spectrale detector scheidt de fluorescentie-emissie in vele onderdelen (meestal 32 of meer) volgens golflengte. Diverse bands aangrenzende golflengte kunnen worden gecombineerd in een beeld kanaal. De golflengten worden gecombineerd empirisch worden gekozen om signaal van G maximaliserenFP en OFP terwijl het vermijden crossover van signaal dat zou beschamen de FRET metingen. Gebruik de hoogste numerieke opening lens beschikbaar. We maken gebruik van een 100x/1.49 of 60x/1.49 Apo-TIRF lens. We maken gebruik van de Nikon A1R confocale microscoop NIS Elements-software. De acquisitie software configureren om de ATP-gebonden en ATP-ongebonden mitGO-ATeam2 soorten vangen. We maken gebruik van de volgende voorwaarden.
    1. Stel pinhole tot 1,0 Airy-eenheden (AU), die op ons systeem overeenkomt met az resolutie van ongeveer 0,42 micrometer.
    2. Stel scan zoom aan de Nyquist sampling limiet, die ruimtelijke informatie in de afbeelding zal maximaliseren benaderen. Op ons systeem de pixelgrootte is 0,12 micrometer.
    3. Omdat mitochondriën kan bewegen tijdens beeldvorming, kan het nuttig zijn om beeldvorming snelheid te verhogen door het bijsnijden van het veld tot 512 x 256 pixels. De totale tijd die nodig is om een ​​frame in ons systeem is 1,0 sec, waaronder een 2-voudige scan gemiddelde. Afhankelijk van de gewenste ruimtelijke resolutie, kan het gebied verder worden bijgesneden om in toenemendee tijdsresolutie.
    4. Excite bij 488 nm, en het verzamelen van emissie 500-520 nm voor GFP, en 550-580 nm voor OFP. Werkelijke optimale waarden kunnen variëren met de kenmerken van het beeldvormingssysteem.
    5. De optimale laservermogen voor ons systeem is tussen 6.0 en 6.4%. De optimale laservermogen zal variëren voor elke microscoop systeem, maar zal idealiter zo laag als mogelijk, terwijl nog steeds het produceren van een interpreteerbaar beeld. Een intern of extern vermogen meter aan veranderingen in het laservermogen, die normaliter na verloop van tijd in een optisch systeem te controleren.
    6. Pas detector gain en verlichting lichtintensiteit aan de gedetecteerde bereik van pixelwaarden te maximaliseren, maar het signaal te voorkomen verzadigen, voor zoveel cellen mogelijk. Niet analyseert alle cellen die meer dan 1% verzadigde pixels. Afbeelding alle monsters met hetzelfde doel, laservermogen, scan zoom, pixelgrootte, gain en offset.

4. Image Acquisition

  1. Zoek het middelpunt pla ne van de cellen van belang met doorvallend licht te minimaliseren bleken de fluorescente probe.
  2. Na het lokaliseren van een of meer cellen van interesse, het verzamelen van een z-serie de hele diepte van een typische cel (ongeveer 7 urn) met een stapgrootte van 0,5 urn.
  3. Afbeelding andere cellen van de rente op de glijbaan, maar doe geen afbeelding een dia langer dan 15 minuten. Na 15 min op de dia, cellen verliezen levensvatbaarheid.

5. Analyse

Mitochondriale ATP niveau wordt bepaald door het meten van die bij 510 nm de verhouding van de mitGO ATeam2-emissie bij 560 nm 27 De redox toestand van het organel wordt gemeten als de geoxideerde gereduceerd tot (R / O) verhouding van mito-roGFP;. Ie emissie bij 510 nm na excitatie bij 470 nm gedeeld door emissie bij 510 nm na excitatie bij 365 nm. Voor de berekening van de verhouding, we aftrekken achtergrond en bepaalt een drempelwaarde voor pixels die behoren tot de fluorescerende mitochondria.

tent "> Publiek domein (bijvoorbeeld ImageJ 30) of in de handel verkrijgbaar (bv. Volocity, Perkin Elmer) software kan worden gebruikt voor de analyse van mito-roGFP1 of mitGO-ATeam2. Afhankelijk van de software die wordt gebruikt voor het verwerven en voor de analyse, de beelden moet eerst worden geconverteerd naar een ander formaat, zoals TIFF, voordat ze openen in de analyse software. Wanneer beelden worden omgezet, is het essentieel om te verifiëren dat pixelwaarden niet gedurende de verwerking worden gewijzigd. Analyse van mito-roGFP1 data, met beide programma's wordt hieronder beschreven. Program menu's en opties om binnen elk menu worden in vet cursief aangegeven.

5.1 ImageJ analyse

  1. Open afbeeldingen en het type verandering naar 32 bit: Beeld → Type → 32 bit.
  2. Teken een regio van belang (ROI) in een gebied waar er geen cellen. Bereken de gemiddelde intensiteit in deze ROI: Analyze → Meet.
  3. Trek de berekende gemiddelde achtergrond van de stapel: Proces → Math → Aftrekken.
  4. Met behulp van de afgetrokken z-stack, vind het midden segment en drempel op mitochondriën: Afbeelding → ​​Pas → Drempel en klik op Toepassen op het raam Threshold. Toepassen op alle segmenten in de stapel. Controleer Stel achtergrond pixels te NaN.
  5. Maak de verhouding z stack: Proces → Beeld Calculator Verdeel de verminderde stack door de geoxideerde z stack voor mito-roGFP1 analyse. Verdeel de 560 nm afbeelding (ATP gebonden) door de 510 nm afbeelding (ATP ongebonden) voor mitGO-ATeam2 analyse.
  6. Teken een ROI rond het gebied van belang. Kies Analyze → Extra → ROI Manager, en klik op Toevoegen om de ROI te nemen. Meerdere gebieden kunnen worden opgeslagen in de manager. In ROI Manager, selecteert u alle ROI's, kies dan Merts → Multi-Measure om alle stapel schijfjes meten. Gegevens exporteren naar een spreadsheet voor analyse.

5.2 Volocity analyse

  1. Importeer afbeeldingen in een Volocity bibliotheek en maak een sequentie van beelden met 2 kanalen.
  2. Teken een regio van belang (ROI) in een gebied waar er geen cellen. Kies: Extra → Ratio.
  3. Gebruik Volocity naar de achtergrond te berekenen: Get Van ROI.
  4. Pas de drempel om mitochondriale structuren bevatten.
  5. De optie om een ​​regenboog LUT toepassing op de verhouding kanaal. De intensiteit-gemoduleerde kanaal kan produceren een afbeelding minder luidruchtige presen-tie, maar het mag niet worden gebruikt voor de kwantificering van gemiddelde verhouding.
  6. Selecteer het tabblad Meting, selecteert u de verhouding tussen kanaal en teken een ROI rond het gebied van belang. Meet de verhouding kanaal, afgezien van nul waarden. Meerdere gebieden kunnen worden gekozen en gemetentegelijkertijd. Gegevens exporteren naar een spreadsheet voor analyse.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

Het meten van mitochondriale redox staat met mito-roGFP

Hier laten we zien dat mito-roGFP1 heeft het dynamische bereik van veranderingen in mitochondriale redox toestand detecteren van volledig geoxideerd tot gereduceerd levende gistcellen, zonder de gist celgroei of mitochondriale morfologie. Ten eerste, vinden we cellen die mitochondria-gerichte GFP en roGFP1 groeien in normale tarieven (Figuur 1A). De maximale groeisnelheid, zoals gemeten door de maximale helling van de groe...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

Hier beschrijven we methoden om mito-roGFP1 en mitGO-ATeam2 gebruiken als biosensoren om mitochondriale redox staat en ATP-niveau te beoordelen in levende gistcellen. Wij vinden dat de expressie van plasmide gedragen mito-roGFP1 of mitGO-ATeam resultaten in kwantitatieve doelstelling voor mitochondria, zonder enig duidelijk effect op de mitochondriale morfologie of distributie of op de cellulaire groei. 3 Mito-roGFP1 kan detecteren veranderingen in de mitochondriale redox toestand van zeer geoxideerd tot ster...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

Geen belangenconflicten verklaard.

Dankbetuigingen

Dit werk werd ondersteund door de awards van HHMI 56006760 tot JDV, de National Institutes of Health (NIH) (2 TL1 RR 24158-6) te DMAW, en van de Ellison Medical Foundation (AG-SS-2465) en het NIH (GM45735, GM45735S1 en GM096445) naar LP. GM45735S1 werd afgegeven vanaf de NIH onder de Amerikaanse Terugwinning en Reinvestment Act van 2009. De microscopen gebruikt voor deze studies werden ondersteund in het kader door middel van een NIH / NCI subsidie ​​(5 P30 CA13696).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
 Reagenten
Antimycin ASigma-Aldrich (St. Louis, MO)1397-94-0Opgelost in ethanol tot een stockoplossing van 2 mg/ml.
SGlyc (synthetisch glycerol-gebaseerd) gistgroeimedium *verzenden voor SGlyc-Ura
**verzenden voor SGlyc-Leu		Oplossen in H2O. Breng pH aan op 5,5 met NaHCO3. Autoclaveer.

Ingrediënten:
0,67% Gist stikstofbasis zonder aminozuren
3% Glycerol
0,05% Glucose
2 mg/ml adenine
2 mg/ml uracil*
1 mg/ml L-arginine
1 mg/ml L-histidine
1 mg/ml L-leucine**
3 mg/ml L-lysine
2 mg/ml L-methionine
4 mg/ml L-fenylalanine
2 mg/ml L-tryptofaan
3 mg/ml L-tyrosine
SC (synthetisch compleet, glucose-gebaseerd) gistgroeimedium *verzenden voor SGlyc-Ura
**verzenden voor SGlyc-Leu		Oplossen in H2O. Breng pH aan op 5,5 met NaHCO3. Autoclaveer. Ingrediënten:
0,67% Gist stikstofbasis zonder aminozuren
3% Glucose
2 mg/ml adenine
2 mg/ml uracil*
1 mg/ml L-arginine
1 mg/ml L-histidine
1 mg/ml L-leucine**
3 mg/ml L-lysine
2 mg/ml L-methionine
4 mg/ml L-fenylalanine
2 mg/ml L-tryptofaan
3 mg/ml L-tyrosine
ValapCombineer de ingrediënten in een 1:1:1 (w:w:w) verhouding. Smelt door onderdompeling in een H2O-bad van 70 °C. Verdeel in glazen petrischalen. Bewaar op kamertemperatuur. Ingrediënten:
Vaseline petroleumgelei, harde paraffine, lanoline
 Uitrusting en software
Voorgezuiverde Gold Seal Rite-on Micro SlidesThomas Scientific (Swedesboro, NJ)3050Grootte: 25 x 75 mm; Dikte: 0,93 tot 1,05 mm
Hoge prestatie dekglasjes, No. 1,5, 18x18 mmZeiss (Thornwood, NY)474030-9000-000Deze zijn minder variabel in dikte (170±5 μm) dan standaard dekglasjes, wat sferische aberratie vermindert en de prestaties van 3D-beeldvorming verbetert
Fisherbrand Microscoop Dekglas, No. 1,5Fisher Scientific (Pittsburgh, PA)12-545EGrootte: 22 x 22 mm, No. 1,5 dikte (170 μm)
A1 laser scanning confocal microscoop met spectraal detector en 100x/1,49 NA Apo-TIRF objectiefNikon (Melville, NY) 
AxioObserver.Z1 microscoop uitgerust met een 100x/1.3NA EC Plan-Neofluar objectief (Zeiss) en Orca ER gekoelde CCD camera (Hamamatsu) en bestuurd door Axiovision softwareZeiss (Thornwood, NY); Hamamatsu (Hamamatsu City, Japan) 
Volocity 3D beeldanalysesoftwarePerkin Elmer (Waltham, MA)Restauratiemodule voor deconvolutie; Kwantitatieve module voor verhoudingsberekening en meting
ImageJ softwareNational Institutes of Health (Bethesda, MD)http://rsb.info.nih.gov/ij/

Referenties

  1. Rizzuto, R., De Stefani, D., Raffaello, A., Mammucari, C. Mitochondria as sensors and regulators of calcium signalling. Nature reviews. Molecular Cell Biology. 13 (9), 566-578 (2012).
  2. Nunnari, J., Suomalainen, A. Mitochondria: in sickness and in health. Cell. 148 (6), 1145-1159 (2012).
  3. McFaline-Figueroa, J. R., Vevea, J., et al. Mitochondrial quality control during inheritance is associated with lifespan and mother-daughter age asymmetry in budding yeast. Aging Cell. 10 (5), 885-895 (2011).
  4. Hamilton, M. L., Van Remmen, H., et al. Does oxidative damage to DNA increase with age. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 98, 10469-10474 (2001).
  5. Cadenas, E., Davies, K. J. Mitochondrial free radical generation, oxidative stress, and aging. Free Radical Biology & Medicine. 29 (3-4), 222(2000).
  6. Mammucari, C., Rizzuto, R. Signaling pathways in mitochondrial dysfunction and aging. Mechanisms of Ageing and Development. 131 (7-8), 536-543 (2010).
  7. Lin, M. T., Beal, M. F. Mitochondrial dysfunction and oxidative stress in neurodegenerative diseases. Nature. 443 (7113), 787-795 (2006).
  8. Schon, E. A., Przedborski, S. Mitochondria: the next (neurode)generation. Neuron. 70 (6), 1033-1053 (2011).
  9. Taylor, E. R., Hurrell, F., Shannon, R. J., Lin, T. -K., Hirst, J., Murphy, M. P. Reversible glutathionylation of complex I increases mitochondrial superoxide formation. The Journal of Biological Chemistry. 278 (22), 19603-19610 (2003).
  10. Beer, S. M., Taylor, E. R., et al. Glutaredoxin 2 catalyzes the reversible oxidation and glutathionylation of mitochondrial membrane thiol proteins: implications for mitochondrial redox regulation and antioxidant defense. The Journal of Biological Chemistry. 279 (46), 47939-47951 (2004).
  11. Tretter, L., Adam-Vizi, V. Inhibition of Krebs cycle enzymes by hydrogen peroxide: A key role of [alpha]-ketoglutarate dehydrogenase in limiting NADH production under oxidative stress. The Journal of Neuroscience: The Official Journal of the Society for Neuroscience. 20 (24), 8972-899 (2000).
  12. Nulton-Persson, A. C., Szweda, L. I. Modulation of mitochondrial function by hydrogen peroxide. The Journal of Biological Chemistry. 276 (26), 23357-23361 (2001).
  13. Gardner, P. R., Fridovich, I. Effect of glutathione on aconitase in Escherichia coli. Archives of Biochemistry and Biophysics. 301 (1), 98-102 (1993).
  14. Gardner, P. R., Raineri, I., Epstein, L. B., White, C. W. Superoxide radical and iron modulate aconitase activity in mammalian cells. The Journal of Biological Chemistry. 270 (22), 13399-13405 (1995).
  15. Schafer, F., Buettner, G. Redox environment of the cell as viewed through the redox state of the glutathione disulfide/glutathione couple. Free Radical Biology and Medicine. 30 (11), 1191-1212 (2001).
  16. Maechler, P., Wang, H., Wolheim, C. B. Continuous monitoring of ATP levels in living insulin secreting cells expressing cytosolic firefly luciferase. FEBS Lett. 422, 328-332 (1998).
  17. Ouhabi, R., Boue-Grabot, M., Mazat, J. P. Mitochondrial ATP synthesis in permeabilized cells: Assessment of the ATP/O values in situ. Anal. Biochem. 263, 169-175 (1998).
  18. Strehler, B. L., Totter, J. R. Firefly luminescence in the study of energy transfer mechanism in substrates and enzymes determinations. Arch. Biochem. Biophys. 40, 28-41 (1952).
  19. Lemasters, J. J., Backenbrock, C. R. Adenosine triphosphate: Continuous measurement in mitochondrial suspension by firefly luciferase luminescence. Biochem. Biophys. Res. Commun. 55, 1262-1270 (1973).
  20. Wibom, R., Lundin, A., Hultman, E. A sensitive method for measuring ATP formation in rat muscle mitochondria. Scand. J. Clin. Lab. Invest. 50, 143-152 (1990).
  21. Manfredi, G., Spinazzola, A., Checcarelli, N., Naini, A. Assay of Mitochondrial ATP Synthesis in Animal Cells. Methods in Cell Biology, Mitochondria. Pon, L. A., Schon, E. A. 65, Academic Press. New York. 133-145 (2001).
  22. DeLuca, M. Firefly luciferase. Adv. Enzymol. Relat. Areas Mol. Biol. 44, 37-68 (1976).
  23. Atamna, H., Frey, W. H. Mechanisms of mitochondrial dysfunction and energy deficiency in Alzheimer's disease. Mitochondrion. 7, 297-310 (2007).
  24. Hanson, G. T., Aggeler, R., et al. Investigating mitochondrial redox potential with redox-sensitive green fluorescent protein indicators. J. Biol. Chem. 279 (13), 13044-13053 (2004).
  25. Dooley, C. T., Dore, T. M., Hanson, G. T., Jackson, W. C., Remington, S. J., Tsien, R. Y. Imaging dynamic redox changes in mammalian cells with green fluorescent protein indicators. J. Biol. Chem. 279 (21), 22284-22293 (2004).
  26. Schwarzländer, M., Fricker, M. D., et al. Confocal imaging of glutathione redox potential in living plant cells. Journal of Microscopy. 231 (2), 299-316 (2008).
  27. Nakano, M., Imamura, H., Nagai, T., Noji, H. Ca2+ regulation of mitochondrial ATP synthesis visualized at the single cell level. ACS Chem Biol. 6 (7), 709-715 (2011).
  28. Berg, J., Hung, Y. P., Yellen, G. A genetically encoded fluorescent reporter of ATP:ADP Ratio. Nature Methods. 6 (2), 161-166 (2009).
  29. Gietz, R. D., Woods, R. A. Transformation of yeast by lithium acetate/single-stranded carrier DNA/polyethylene glycol method. Methods in Enzymology. 350, 87-96 (2002).
  30. Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nature Methods. 9, 671-675 (2012).
  31. Patterson, G. H., Lippincott-Schwartz, J. A photoactivatable GFP for selective photolabeling of proteins and cells. Science (New York, N.Y.). 297 (5588), 1873-1877 (2002).
  32. Dairaku, N., Kato, K., et al. Oligomycin and antimycin A prevent nitric oxide-induced apoptosis by blocking cytochrome c leakage. J. Lab. Clin. Med. 143 (3), 141-153 (2004).
  33. Cannon, M. B., Remington, S. J. Re-engineering redox-sensitive green fluorescent protein for improved response rate. Protein Sci. , 45-57 (2006).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Tags

ATP-biosensorenroGFP MitochondriënFRET ATP-probeGistmitochondriënFluorescentiemicroscopieBeeldanalyseThresholding-protocolSubcellulaire resolutie
Ratiometrische Biosensoren dat mitochondriaal Redox Staat en ATP Meet in Living gistcellen
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan de bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleidsoverzicht

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.