Modellen en methoden om vervoer van Drug Delivery Systems Across Cellular Barrières Evalueer

Samenvatting

Vele therapeutische toepassingen vereisen een veilig en efficiënt transport van drugs vervoerders en hun lading over cellulaire barrières in het lichaam. Dit artikel beschrijft een aanpassing van bestaande methoden om de snelheid en het mechanisme van het vervoer van drugs nanocarriers (NC's) over cellulaire barrières, zoals de gastro-intestinale (GI) epitheel evalueren.

Samenvatting

Sub-micrometer dragers (nanocarriers; NC's) te verbeteren werkzaamheid van geneesmiddelen door het verbeteren van de oplosbaarheid, stabiliteit, omlooptijd, targeting en release. Bovendien doorkruisen cellulaire barrières in het lichaam is cruciaal voor zowel de orale toediening van therapeutische NC's in het verkeer en vervoer van het bloed naar de weefsels, waar interventie nodig is. NC transport over cellulaire barrières wordt bereikt door: (i) de paracellulaire route via tijdelijke verstoring van de knooppunten die aangrenzende cellen of (ii) de transcellulaire route, waarbij materialen worden geïnternaliseerd door endocytose, in het cellichaam getransporteerd en uitgescheiden interlock aan de andere celoppervlak (transyctosis). Levering in heel cellulaire barrières kunnen worden vergemakkelijkt door het koppelen van therapeutica of hun dragers met targeting agents die specifiek binden aan het celoppervlak merkers betrokken bij het transport. Hier bieden we methoden om de omvang en het mechanisme van NC transport over een model celbarrière, while metench bestaat uit een monolaag van gastro-intestinale (GI) epitheelcellen gegroeid op een poreus membraan in een Transwell insert. Vorming van een permeabiliteitsbarrière wordt bevestigd door metingen transepithele elektrische weerstand (TEER), transepitheliaal transport van een controle-stof, en immunokleuring van tight junctions. Als voorbeeld, worden ~ 200 nm polymeer NC's gebruikt die een therapeutische lading dragen en zijn bekleed met een antilichaam dat een cel-oppervlak determinant richt. Het antilichaam of therapeutische lading gemerkt met ^125I voor radioisotoop gemerkte opsporing en NC's worden toegevoegd aan de bovenste kamer via celmonolaag gedurende variërende tijdsperioden. NC geassocieerd met de cellen en / of naar de onderliggende kamer worden gedetecteerd. Meting van gratis ¹²⁵ Ik laat aftrekken van de gedegradeerde fractie. De paracellulaire route wordt beoordeeld door het bepalen van mogelijke veranderingen door NC vervoer tot de dam parameters hierboven beschreven. Transcellulaire vervoer iTussen bepaald door het aanpakken van het effect moduleren endocytose en transcytose wegen.

Inleiding

Cellulaire barrières in het lichaam fungeren als een gateway tussen de externe omgeving en de interne compartimenten. Dit geldt voor de epitheliale bekleding scheidt het extern blootgestelde oppervlak van de gastro-intestinale (GI) kanaal en de bloedbaan ^1-3. Cellulaire belemmeringen vertegenwoordigen ook de interface tussen de bloedbaan en de parenchym en cellulaire componenten van weefsels en organen. Dit geldt voor de binnenste endotheliale bekleding van bloedvaten, zoals de bloed-long barrière, de bloed-hersenbarrière, enz. ¹ Het vermogen om deze cellulaire barrières te doorkruisen in het lichaam is cruciaal voor efficiënte levering van therapeutische en diagnostische middelen in de circulatie en weefsels / organen waar interventie nodig is.

Om de levering van therapeutische of diagnostische middelen te verbeteren, kunnen deze verbindingen in sub-micrometer nanocarriers (NC's) worden geladen. Deze drug delivery vehicles kunnen worden geformuleerd met verschillendechemie en structuren om drugs oplosbaarheid, bescherming, farmacokinetiek, de release en de stofwisseling ^4,5 optimaliseren. NC kunnen worden gefunctionaliseerd met affiniteit of richtende delen (bijvoorbeeld antilichamen, peptiden suikers, aptameren, enz.) om hechting aan gebieden van het lichaam waar de therapeutische werking vereist ^2,6 vergemakkelijken. Targeting van NC's naar determinanten op het oppervlak van cellulaire barrières kunnen het vervoer verder te vergemakkelijken in en / of over deze voeringen ^2,6.

De rol van selectief transport van stoffen tussen twee omgevingen vereist een aantal unieke functies onder cellagen. Een dergelijke functie is celpolariteit, waarbij de apicale membraan tegenover het lumen van holten varieert van het basolaterale membraan gericht weefsel interstitium met betrekking tot membraan morfologie en samenstelling van lipiden, transporters en ² receptoren. Een ander kenmerk betreft intercellulaire junctions verbinden aangrenzende cellen. Regulatie van de eiwitten die krappe kruispunten, met name junctionele adhesiemoleculen (files), occludins en Claudins vormen, moduleren de barrièrefunctie selectief toestaan ​​of niet transport van stoffen tussen cellen, bekend als paracellulaire vervoer, waardoor passage van materialen uit het lumen naar de basolaterale ruimte ^3. Binding van vele natuurlijke en synthetische elementen (leukocyten, moleculen, deeltjes en drug delivery systemen) om cellulaire barrières in het lichaam cel-junction opening induceren, die voorbijgaand en relatief onschadelijke of meer langdurig zijn en dus onveilig toegang van ongewenste stoffen over de barrière ^2,5,7-9. Bijgevolg kan dit traject worden bepaald door het meten van de transepitheliale elektrische weerstand (TEER) en passieve paracellulaire diffusie van moleculen (hierin genoemd paracellulaire lekkage), waarbij verminderde weerstand tegen elektrische stroom of verhoogde paracellulaire lekkage een inert verbinding in de basolaterale ruimte geven opening van de cel contacten, respectievelijk ^5,10,11. Ter aanvulling van deze methoden, kan een van de tight junction eiwitten hierboven genoemde worden gekleurd om hun integriteit te beoordelen, waar vlekken moeten verschijnen geconcentreerd bij de cel-cel grenzen rondom de cel periferie ^5,10,12.

Alternatief kan geneesmiddelafgiftesystemen die specifieke celoppervlak determinanten zoals die geassocieerd met clathrine beklede putjes of kolf-vormige membraan invaginations genoemd caveolae, gericht vesiculaire opname activeren in cellen door endocytose, die een weg voor geneesmiddelafgifte intracellulaire compartimenten ^{5, 13.} Bovendien kan endocytose leiden tot transport van vesikels in het cellichaam voor vrijgave aan de basolaterale zijde een fenomeen transyctosis of transcellulair transport ^14. Daarom kan kennis van de kinetiek en het mechanisme van endocytose worden gebruikt voor een intracellulaire exploiterennd transcellulaire drug delivery, die een relatief veilige en gecontroleerde wijze van levering biedt in vergelijking met de paracellulaire route. Het mechanisme van endocytose worden beoordeeld modulatoren van klassieke routes (clathrine-en-caveolin endocytose en macropinocytose) of niet-klassieke routes (zoals bij celadhesie molecuul (CAM)-gemedieerde endocytose) ^5,13,15 .

Dat intracellulair verkeer vaak bestudeerd in standaard putjes of dekglaasjes, het ontbreken van een basolaterale compartiment sluit cel polarisatie en de mogelijkheid om transport te bestuderen in cellagen. Om dit probleem te omzeilen, is transport over cel monolagen werden lang bestudeerd met Transwell inzetstukken ^10,11,16,17, die bestaan ​​uit een bovenste (apicaal) kamer, een poreus membraan permeabel waar cellen hechten en een hecht monolaag, en een onderste (basolaterale) kamer (figuur 1). In deze configuratie kan het transport worden gemeten in deapicale naar basolaterale richting door toediening van een behandeling in de bovenste kamer, na het transport door de cel monolaag en de onderliggende poreuze membraan, en uiteindelijk verzamelen van het medium in de onderste kamer voor het kwantificeren van transportgoed. Vervoer in de basolaterale-to-apicale richting kan ook worden gemeten door de eerste toediening aan de Tweede Kamer en de daaropvolgende verzameling van de bovenste kamer ^5,10,12,16. Verschillende technieken bestaan ​​om de vorming van barrièrelaag op transwells, waaronder TEER en paracellulaire transport assays controleren, zoals hierboven beschreven. Bovendien kan het permeabele filter waarop cellen gekweekt worden verwijderd beeldverwerkingsanalyses (bijv. fluorescentie, confocale, elektronenmicroscopie) als verdere bevestiging van de cel monolaag model en het mechanisme van transport. Keuze van het membraan, die beschikbaar is in verschillende poriegrootte, materialen en oppervlakken, is afhankelijk van verschillende factors zoals de omvang van stoffen of voorwerpen worden vervoerd, celtype, en imaging methode ^16,18-20. Transwell inzetstukken ook gecontroleerd en kwantificatie van vervoer te vergemakkelijken ten opzichte van complexe zoogdiersystemen, als volumes van de kamers en celoppervlak bekend constanten. Hoewel veel factoren betrokken bij in vivo afgifte worden geëlimineerd, waaronder de aanwezigheid van darmslijmvlies, schuifspanning, spijsverteringsenzymen, immuuncellen, enz. Dit kleine schaal in vitro model biedt nuttige voorafgaande informatie over transport.

Als een voorbeeld voor de aanpassing van deze methoden om NC transport te bestuderen over cellulaire barrières ^10,11,16,17 illustreren, beschrijven we hier een geval waarin het potentieel voor NC transport over de GI epitheel werd gemodelleerd door het beoordelen van de passage van een model drug delivery systeem via een monolaag van menselijke epitheliale colorectale adenocarcinoma (Caco-2 cellen). Hiertoe cellen werden gekweekt in Transwell inzetstukken, een 0,8 um porie polyethyleentereftalaat (PET) filter (6,4 mm diameter), die transparant is en kan worden gebruikt voor microscopie. De status van de barrièrelaag wordt gevalideerd door TEER, apicale naar basolaterale transport van een controlestof, albumine en fluorescentie microscopie visualisatie van een element van de tight junctions, occludin eiwit. Een model van gerichte polymeer NC wordt gebruikt, bestaande uit 100 nm, niet biologisch afbreekbare polystyreen nanodeeltjes. NC worden bekleed door oppervlakte adsorptie met een targeting antilichaam alleen of een combinatie van een gericht antilichaam en therapeutisch lading, waarbij elke component met ¹²⁵ I radioisotoop tracering kan worden gemerkt. In het gekozen voorbeeld, het antilichaam intercellulaire adhesiemolecuul-1 (ICAM-1) herkent een eiwit op het oppervlak van GI epitheel (en andere) cellen, waarvan is aangetoond dat intracellulair transcellulair transport o vergemakkelijken f drug carriers en hun lading ^21. De lading alfa-galactosidase (α-Gal) een therapeutisch enzym voor behandeling van de ziekte van Fabry, een erfelijke lysosomale stapelingsziekte ^22.

De beklede NC, ongeveer 200 nm groot, toegevoegd aan de apicale kamer via cel monolaag en geïncubeerd bij 37 ° C gedurende variërende tijdsperioden, waarna ^125I op NC kan worden gedetecteerd gekoppeld aan de cel monolaag en / of getransporteerd naar de basolaterale kamer onder de cellen. Aanvullende bepaling van vrije ¹²⁵ Ik laat aftrekken van de gedegradeerde fractie en de schatting van gecoate NC vervoer. Het mechanisme van transport wordt verder bepaald door onderzoek van veranderingen in de barrièrelaag betrekking tot de paracellulaire route, door de hierboven beschreven parameters, terwijl transcellulair transport wordt bepaald door het onderzoeken van veranderingen in het transport wanneer moduleren wegen van endocytose en transcytose.

NHOUD "> Deze methoden geven waardevolle informatie over cellulaire barrière modellen, de mate en snelheid van transport van een drug delivery systeem, en het mechanisme van dit vervoer, helemaal die interpretatie van de mogelijkheden voor drug delivery over cellulaire barrières.

Protocol

1. Het kweken van een monolaag van cellen in Transwell Inserts

1. In een steriele, bioveiligheidsniveau 2 celkweek kap, plaatst 0,8 mm porie PET Transwell inserts in een 24-well plaat (4 wells per conditie, voor statistische significantie) met een pincet. Alle materialen die gebruikt de kap moet worden gesteriliseerd met ethanol.

Opmerking: De poriegrootte van de filter moet worden geselecteerd in overeenstemming met de gemiddelde grootte van de NC gebruikte transport mogelijk over het membraan. Ook, om statistisch significante resultaten, elke experimentele conditie is minimaal vier herhalingen (wells) binnen hetzelfde experiment, en minimaal 3 onafhankelijke experimenten.

2. Bereid celkweekmedium DMEM medium aangevuld met 4,5 g / l glucose, 15% foetaal runderserum en 1% Pen strep en verhit tot 37 ° C in een waterbad.
3. Verdunnen menselijke epitheliale colorectaal adenocarcinoom (Caco-2-cellen) in cel medium en plaats200-400 ul van de cel oplossing in het bovenste (apicale) kamer van de Transwell insert, bij een dichtheid van 1,5 x 10 ⁵ cellen / cm ^2. Vul het onderste (basolaterale) kamer met 700-900 pi cel medium.
4. Cultuur cellen bij 37 ° C, 5% _CO2 en 95% vochtigheid gedurende 16-21 dagen vervangen medium in de bovenste en onderste kamer om de 3-4 dagen, met de in stap 1.3 volumes. Vervang medium in de onderstaande volgorde de druk boven (in plaats van onder) de celmonolaag doen: Zuig het medium uit de onderste kamer, Zuig het medium van de bovenste kamer, vult de bovenkamer met vers medium en vul de onderste kamer met vers medium.

2. Validatie van de GI Epitheliaale permeabiliteitsbarrière behulp Transepitheliaal Elektrische weerstand (TEER) en Immunokleuring van tight junctions

1. Voor opslag op korte termijn (minder dan 2 weken), dompel STX100 elektroden in een elektrolyt oplossingtie (0,1-0,15 M KCl of NaCl). Sluit de elektrode aan op de elektrode in de meter EVOM volt-ohm zodat het systeem intern kortgesloten elektrode en symmetrie wordt gehandhaafd. Voor de lange-termijn opslag, spoelen met dH ₂ O en op te slaan in een droge, donkere toestand.
2. De elektroden steriliseren, onderdompelen in ethanol gedurende 15 minuten en aan de lucht drogen gedurende 15 sec. Alternatief kunnen de elektroden worden opgeslagen in een UV kap. Spoel de elektroden in een steriele elektrolytoplossing (fosfaatbuffer zoutoplossing, PBS) of 0,1-0,15 M KCl of NaCl-oplossing, voor elke weerstandsmeting.
3. Met de meter volt-ohm ingesteld op weerstand instelling verticaal plaatst elektroden in een putje met de Transwell insert met de korte elektrode in de bovenste kamer en de lange elektrode in de onderste kamer raakt de bodem van de put. Zodra de EVOM aflezing stabiliseert, noteer de weerstand waarde (uitgedrukt in ohm; Ω) voor elk putje.
4. Bereken weerstand (resistance genormaliseerd tot gebied; Ω × ² cm) van de monsters door het aftrekken achtergrond weerstand (TEER van transwell inserts zonder cellen) en vermenigvuldigen met membraanoppervlak. Weerstandswaarden zijn meestal in de literatuur. (Zie bespreking)
5. Herhaal metingen elke 1-2 dagen tot TEER waarden tot een maximum en plateau aangeeft vorming van een barrièrelaag, die typisch duurt 2-3 weken vanaf het moment van cel platting. Plateau TEER waarden en tijd die nodig is om de barrière integriteit bereiken kan variëren naargelang de cel passage nummer.
6. Om de aanwezigheid van krappe kruispunten in celmonolagen met hoge TEER (gelijk aan of boven de drempelwaarde voor barrièrevorming) controleren, repareren cellen door incubatie met koude 2% paraformaldehyde gedurende 15 minuten. Daarna, was cellen met PBS en incubeer ze gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur met 1 ug / ml anti-occludin. Was de cellen opnieuw met PBS en incubeer ze gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur met 7,5 ug / ml fluorescently-gelabelde secundaire antilichamen. Gebruik putten met lage TEER als negatieve controle voor barrière-vorming.

Opmerking: Als alternatief voor anti-occludin kunnen antilichamen alternatieve tight junction eiwitten worden gebruikt.

7. Accijnzen voorzichtig het filter membraan waarop de vaste monolaag is bevestigd, en monteren op dia's voor beeldvorming met behulp van epifluorescentie of confocale microscopie.

3. Evalueren transepitheliaal transport van Gerichte Carriers

1. Label de targeting antilichaam (monoklonaal antilichaam tegen ICAM-1, anti-ICAM, in dit voorbeeld) met ^125I, zoals eerder beschreven ^7. Gebruik Bradford assay te schatten eiwitconcentratie en een gamma-teller tot ¹²⁵ I inhoud op het antilichaam te bepalen, bereken dan de specifieke activiteit in tellingen per minuut (CPM) / mg gelabeld antilichaam.

Opmerking: Om de controle op specificiteit, returf procedure etikettering muis IgG, die zal worden gebruikt om niet-gerichte beklede NC bereiden. Om het vervoer van een therapeutische lading studeren, herhaal dan de procedure labelen van de lading, bijvoorbeeld alfa-galactosidase (α-Gal) in dit voorbeeld. Alternatieven kunnen worden gebruikt voor het doelgericht agens, niet-specifieke controle, of therapeutische lading. Alternatieve werkwijzen kunnen ook worden gebruikt om verbindingen te labelen en schat de concentratie van de gemerkte tegenhangers.

2. Paar het gelabelde gericht antilichaam (anti-ICAM in ons voorbeeld) op het oppervlak van NC. In dit voorbeeld, incubeer polystyreen nanobeads (100 nm diameter) gedurende 1 uur bij kamertemperatuur met ^{125I-anti-ICAM} aan de oppervlakte adsorptie toe, zoals beschreven ^7.

Opmerking: Voor de niet-specifieke controle gebruiken ¹²⁵ I-IgG. Om het vervoer van een lading te traceren, gebruiken een combinatie van targeting antilichaam en ^125-gemerkte cargo (α-Gal in ons voorbeeld).

3. Centrifugeer bij 13.000 xg gedurende 3 minuten en verwijder de niet-gecoate tegenhangers in het supernatant door aspiratie. Resuspendeer de pellet bevattende beklede NC met 1% runderserumalbumine (BSA) in PBS door pipetteren en ultrasone trillingen gering vermogen om mogelijke deeltjes aggregaten (20-30 korte pulsen) verstoren.
4. Voor NC karakterisering, meten grootte, polydispersiteit, en ζ-potentieel van gecoate deeltjes met behulp van dynamische lichtverstrooiing (volgens de instructies van de leverancier), en kwantificeren van het aantal ^125-gelabeld targeting antilichaam moleculen (bijv. anti-ICAM) op het deeltje oppervlak met behulp van een gamma-teller.

Opmerking: Deze methoden kunnen worden herhaald voor niet-specifieke en therapeutische tegenhangers. De grootte van de beklede deeltjes varieert rond 200 nm.

5. Add ^{125I-antilichaam} NC (bijv. ^{125I-anti-ICAM} NC; 56 nCi / ml) aan de bovenste kamer boven confluente Caco-2 monolagen met TEER &# 8805; 350 Ω × cm ² (zie Overleg) over achtergrond (16-21 dagen na het zaaien). Incubeer bij 37 ° C gedurende een of meer gewenste tijdsintervallen. Meet TEER (paragraaf 2.3) voor en na incubatie de effecten van NC op de barrièrelaag beoordelen.

Opmerking: Deze procedure kan herhaald worden voor niet-specifieke en therapeutische tegenhangers.

6. Verzamel medium uit de bovenste en onderste kamers en was ze een keer met 0,5 ml DMEM bij 37 ° C (bovenste kamer) of 1 ml dH ₂ O (Tweede Kamer). Verzamel de wasbeurten voor de meting van de totale radio-isotoop content met behulp van een gamma-teller.
7. Voor het meten van de celfractie te snijden de permeabele filter, bijvoorbeeld met een scheermesje uitgesneden rond de randen en incubeer in een gammateller buis met 1% Triton X-100 gedurende 10 min (om de celinhoud vrij) vóór meetcel -geassocieerde totale radioactiviteit.
8. Voor het meten van ¹²⁵ I regehuurd van NC's tijdens het vervoer of als gevolg van mogelijke afbraak, eerste mix-300 ul van het monster (van de boven, onder, of celfracties) met 700 ul van 3% BSA in PBS en 200 ul trichloorazijnzuur (TCA). Incubeer bij kamertemperatuur gedurende 15 minuten. Ondertussen deze tijd, het meten van de totale radioactiviteit van dit monster in een gamma-teller.
9. Centrifugeer TCA monsters bij 3000 xg gedurende 5 minuten aan intacte eiwit (pellet) scheiden van het gedegradeerde eiwit of ^125I fractie (supernatant). Kwantificeren van de radioactiviteit van de gratis ¹²⁵ I fractie en aftrekken wordt deze waarde van de totale radioactiviteit gemeten voor centrifugeren. Dit zal de hoeveelheid gemerkt eiwit dat niet wordt afgebroken bieden.

4. Mechanisme van transepitheliaal transport van Gerichte nanocarriers

1. Etiket albumine met ¹²⁵ I zoals beschreven in paragraaf 3.1 en eerder gemeld ^7.

Opmerking: Albumine is een 66.5kDa eiwit en derhalve een relatief grote inhoud. Hoewel een geldige controle voor passieve transport van grote objecten (bijv. 200 nm NC hier gebruikt) moet worden vervangen door kleinere inerte tracer moleculen bij het bestuderen transport van kleinere geneesmiddeldragers (zie discussie).

2. Om paracellulaire transport bepalen middels albumine paracellulaire lekkage cultuur Caco-2 monolagen op Transwell inzetstukken zoals hierboven beschreven.
3. De bovenste kamer medium boven de cel monolaag, voeg hetzij ^{125I-albumine} alleen (negatieve controle die het basale niveau van lekkage) of ^{125I-albumine} en niet-radioactief gemerkt antilichaam gericht NC (zoals beschreven in paragraaf 3.5). Incubeer bij 37 ° C gedurende de geselecteerde tijdsinterval (s), die moet overeenkomen met die onderzocht bij het testen NC transport. Meet TEER (paragraaf 2.3) voor, tijdens en na incubatie, verzamel alle fracties van de totale ^125I en ^125I vrij metingen aangegeven. punt 3 Opmerking: Gelijktijdige toevoeging van ^{125I-albumine} en niet-radioactief gemerkte controle IgG NC kan worden gebruikt als een controle.
4. Als een positieve controle voor het openen intercellulaire juncties, voeg celmedium bevattende 5 mM H ₂ O ₂ om de bovenste en onderste kamers van de Transwell insert en incubeer bij 37 ° C gedurende 30 minuten. Meet daarna TEER (paragraaf 2.3) en voeg ¹²⁵ I-albumine om de bovenste kamer van de geselecteerde tijdsintervallen. Meet TEER op verschillende tijdstippen gedurende de incubatie TEER waarde bederf veroorzaakt door H ₂ O ₂ geïnduceerde opening van de cel knooppunten identificeren.
5. Parallel experimenten evalueren transcellulaire vervoer, ook wel transcytose, van ¹²⁵ I-gerichte NC's door incubatie samenvloeiing Caco-2 monolagen met ofwel 50 uM monodansylcadaverine (MDC, remmer van clathrin endocytose), 1 ug / ml filipin (remmer van caveolar -gemedieerde endocytose), 0,5 uM Wortmannin (remmer van fosfatidylinositol 3-kinase [PI3K], die deze macropinocytose) of 20 pM [5 - (N-ethyl-N-isopropyl) amiloride] (EIB, remmer van macropinocytose en CAM-gemedieerde endocytose ^15).

Opmerking: ^125I-IgG NC en ^{125I-albumine} worden gebruikt als negatieve controles voor het effect van deze remmers en andere methoden (bv. siRNA technieken) kunnen hogere selectieve inhibitie.

6. Meet TEER (paragraaf 2.3) voor, tijdens en na incubatie van de cellen met remmers en radioactief gemerkt materiaal, als extra controle voor het effect van de remmers op de monolaag permeabiliteit.

Resultaten

Als bevestiging van onze cel model transepitheliaal transport gerichte NC bestuderen, Figuur 2 toont dat Caco-2 cel monolagen uitgeplaat bij een dichtheid van 1,5 x 10 ⁵ cellen / cm ² confluentie bereikten ~ Dag 12 en onderhouden monolaag integriteit tot dag 18, aangegeven TEER (Figuur 2A). Dit werd bevestigd door de aanwezigheid van occludin-positieve krappe kruispunten (Figuur 2B) in monolagen met hoge TEER (390 Ω × cm ^2, Dag 14), in v...

Discussie

De hierboven besproken werkwijzen kan een cel model voor het bestuderen transport gerichte NC in cellulaire barrières worden vastgesteld, zoals het voorbeeld van Caco-2 epitheelcellen, waarvan evalueren vervoer van het GI lumen in het bloed bij betrokken is van orale drug delivery systemen. Kweken van GI epitheliale celmonolagen in transwell inserts ingeschakeld meting van TEER en fluorescentie immunostaining van krappe kruispunten om de vorming van een cel permeabiliteitsbarrière bevestigen. Vervolgens radiolabeling va...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Transwell inserts	BD Falcon	353095
Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM), 1x	Cellgro	10-013-CM
Fetal Bovine Serum (FBS)	Cellgro	35-015-CV
Pen Strep	Gibco	15140
Human epithelial colorectal adenocarcinoma (Caco-2) cells	ATCC	HTB-37TM
125Iodine	Perkin Elmer	NEZ033H002MC	Radioactief gevaar
Phosphate Buffer Saline (PBS)	Gibco	14190-235
Bovine Serum Albumin (BSA)	Equitech Bio	BAH-66
Paraformaldehyde (16%)	Fisher Scientific	15710
Mouse Immunoglobulin G (IgG)	Jackson ImmunoResearch	015-000-003
Mouse monoclonal antibodies to human ICAM-1 (anti-ICAM)	Marlin 1987
α-Galactosidase, van groene koffiebonen	Sigma	G8507-25UN
FITC latex beads, 100 nm	Polysciences, Inc.	17150
Triton X-100	Sigma	234729-500ML
Trichloroacetic acid (TCA)	Fisher Scientific	SA433-500
Occludin antilichaam (Y-12), geiten polyklonaal anti-mens	Santa Cruz Biotechnology	Sc-27151
Monodansylcadaverine (MDC)	Sigma	D4008
Filipin	Sigma	F9765
5-(N-ethyl-N-isopropyl) amiloride (EIPA)	Sigma	A3085
Wortmannin	Sigma	W1628
Gammateller	Perkin Elmer	Wizard2
Volt-ohm meter	World Precision Instruments	EVOM2
TEER elektroden	World Precision Instruments	STX100	Elektroden beschikbaar voor verschillende well-plates
Dynamic Light Scattering (DLS)	Malvern	Nano-ZS90