Methodenartikel

Concurrent Kwantificering van Cellulaire en extracellulaire componenten van biofilms

10.3K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/50639

⸱

10 december 2013

 ,  ,  , 
1Department of Dental Materials, College of Dentistry, University of Oklahoma Health Sciences Center, 2Department of Biostatistics and Epidemiology, College of Public Health, University of Oklahoma Health Sciences Center, 3Department of Biological Sciences, School of Mathematics and Natural Sciences, The Copperbelt University

In dit artikel

Samenvatting

Een protocol voor de gelijktijdige kwantificering en vergelijking van drie cellulaire en extracellulaire componenten binnen biofilms wordt gepresenteerd. De methodologie omvat het gebruik van confocale laserscanningmicroscopie, software voor biofilmstructuuranalyse en -visualisatie, en statistische analysesoftware.

Samenvatting

Confocale laserscanmicroscopie (CLSM) is een krachtig hulpmiddel voor het onderzoek van biofilms. Zeer weinig onderzoeken hebben met succes de gelijktijdige verdeling van meer dan twee componenten binnen biofilms gekwantificeerd omdat: 1) de selectie van fluorescerende kleurstoffen met minimale spectrale overlap gecompliceerd is, en 2) kwantificering van meerdere fluorochromen een multifactorieel probleem vormt. Doelen: Een methodologie rapporteren om gelijktijdige 3-dimensionale verdelingen van drie cellulaire/extracellulaire componenten van biofilms die op relevante substraten zijn gekweekt, te kwantificeren en te vergelijken. Methoden: De methode bestaat uit verschillende, onderling verbonden stappen waarbij biofilmgroei, kleuring, CLSM-beeldvorming, biofilmstructurele analyse en visualisatie en statistische analyse van structurele parameters betrokken zijn. Biofilms van Streptococcus mutans (stam UA159) werden gedurende 48 uur gekweekt op steriele monsters van Point 4 en TPH3 harscomposieten. De monsters werden vervolgens gedurende 60 seconden ondergedompeld in Biotène PBF (BIO) of Listerine Total Care (LTO) mondwater, of water (controlegroep; n=5/groep). Biofilms werden gekleurd met fluorochromen voor extracellulaire polymere stoffen, eiwitten en nucleïnezuren voordat ze met CLSM werden beeldvormd. Biofilmstructurele parameters, berekend met behulp van ISA3D beeldanalysesoftware, waren biovolume en gemiddelde biofilmdikte. Gemengde modellen statistische analyses vergeleken structurele parameters tussen mondwater en controlegroep (SAS-software; α=0.05). Volocity-software maakte visualisatie mogelijk van 3D-verdelingen van overeengeslagen biofilmcomponenten (fluorochromen). Resultaten: Mondwater BIO produceerde biofilmstructuren die significant verschilden van de controle (p<0.05) op beide harscomposieten, terwijl LTO geen verschillen produceerde (p>0.05) op een van beide producten. Conclusies: Deze methodologie kwantificeerde en vergeleek efficiënt en succesvol gelijktijdige 3D-verdelingen van drie belangrijke componenten binnen S. mutans biofilms op relevante substraten, waardoor twee uitdagingen voor gelijktijdige beoordeling van biofilmcomponenten werden overwonnen. Deze methode kan ook worden gebruikt om de werkzaamheid van antibacteriële/antifouling-middelen tegen meerdere biofilmcomponenten te bepalen, zoals getoond met mondwaters. Bovendien heeft deze methode een brede toepassing omdat het vergelijking van 3D-structuren/architectuur van biofilms in een verscheidenheid van disciplines mogelijk maakt.

Inleiding

Biofilms zijn gestructureerde microbiële gemeenschappen die zijn ingekapseld in een zelf geproduceerde extracellulaire matrix en zijn bevestigd aan biologische of inerte oppervlakken1. Biofilms vertegenwoordigen een veelvoorkomende levensstijl voor veel bacteriën en worden gevormd door het in fasen overgaan van vrij zwevende (planktonische) cellen naar complexe gemeenschappen van meerdere soorten. De inherente resistentie van biofilms tegen antimicrobiële middelen ligt aan de basis van veel aanhoudende en chronische bacteriële infecties1,2, zoals aangetoond door orale biofilms (tandplak). Cariogene micro-organismen zoals mutans streptokokken verwerken sucrose en andere koolhydraten om een extracellulaire matrix te produceren en zuren te genereren die de tandstructuur kunnen demineraliseren en tandbederf kunnen veroorzaken. De meeste biofilmmatrices zijn biopolymeren die bestaan uit cellulaire en extracellulaire componenten zoals exopolysacchariden (EPS), eiwitten en nucleïnezuren3,4.

Confocale laserscanningmicroscopie (CLSM), de meest gebruikte techniek voor fluorescentiebeeldvorming, heeft de optische beeldvorming in de biologie radicaal getransformeerd omdat het de mogelijkheid heeft om 3D-beelden van gehydrateerde biologische structuren te verzamelen zonder fixatie5,6,7. Deze niet-destructieve techniek omvat het verzamelen van beelden van dunne secties binnen een gebied van belang op het specimen op zo'n manier dat de bijdrage van buiten-focus licht wordt verwijderd. De kwaliteit en resolutie van beelden die met CLSM worden vastgelegd, is beter dan wat haalbaar is met behulp van bredeveldfluorescentiemicroscopie. Een groot nadeel van CLSM is dat het scannen van beelden plaatsvindt met een lagere snelheid dan met breedveldmicroscopietechnieken, waarbij volledige beelden tegelijkertijd worden verzameld5. Echter, met een groter aanbod aan fluorochromen, lasers en filters is CLSM een van de meest gebruikte technieken geworden voor multispectrale beeldvorming5,7.

Eerdere studies hebben aangetoond dat CLSM een nuttig hulpmiddel is voor het onderzoeken van de structuur of architectuur van biofilms door één of twee fluorescente tags of kleurstoffen te gebruiken om een beter begrip te krijgen van de verdeling van EPS en cellen binnen biofilms, en vooral binnen de extracellulaire matrix7,8. In theorie is fluorescente kleuring/labeling van meerdere componenten wenselijk voor het onderzoeken van de gedetailleerde structuur en co-lokalisatie van cellulaire en extracellulaire componenten binnen biofilms. Echter, gelijktijdige analyse van verschillende componenten binnen biofilms kan een uitdaging zijn omdat: 1) de selectie van fluorescente kleurstoffen met minimale spectra overlap gecompliceerd is, en 2) kwantificering van meerdere fluorochromen een multifactorieel probleem vormt. Co-lokalisatie met behulp van meerdere fluorochromen vereist het gebruik van zeer specifieke kleurstoffen met minimale spectra interferentie om bleed-through effecten te voorkomen, wat optreedt wanneer twee fluorochromen significant overlap hebben in hun spectra piek, waardoor de ene sterker wordt geëxciteerd dan de andere9. Idealiter zouden fluorochromen met excitatiespectra die elkaar niet overlappen de beste resultaten opleveren, maar het is erg moeilijk om kleurstoffen te vinden die aan dit criterium voldoen. In plaats daarvan wordt de selectie van kleurstoffen geoptimaliseerd door fluorochromen te kiezen waarvan de emissiespectra minimale overlap hebben, waardoor de kleurstoffen één voor één kunnen worden bekeken binnen een beperkte observatiegolflengteband9.

Superpositie van fluorescentiebeelden is waarschijnlijk de meest gebruikte methode voor het evalueren van de gelijktijdige verdeling van fluorochromen. Co-lokalisatie van de verschillende componenten verschijnt als een overlap van verschillende kleuren door meerdere kanalen gecreëerd door de onderzochte fluorochromen10. De hulpmiddelen voor het weergeven van meerkanaalsfluorescentiebeelden als samengevoegde kleurbeelden zijn beschikbaar in de meeste CLSM-software en biologische beeldanalysesoftware. Hoewel superpositie van beelden nuttig is voor ruimtelijke evaluatie van co-lokalisatie, kunnen de beelden alleen kwalitatief worden onderzocht door visuele analyse. Dit levert een beperkte hoeveelheid informatie op, omdat deze representaties over het algemeen niet nuttig zijn voor het kwantificeren van co-lokalisatie onder verschillende experimentele omstandigheden, noch bepalen ze of de co-lokalisatie toevallige samenvalling overschrijdt11. Zeer weinig onderzoeken hebben tot nu toe kwantitatieve methoden gebruikt om de 3-dimensionale structuur van biofilms en biofilmcomponenten te analyseren, en nog minder hebben het effect van antibacteriële behandelingen of antifoulingmaatregelen op biofilmcomponenten gekwantificeerd.

Het doel van dit onderzoek was om een methodologie te rapporteren voor kwantificering en vergelijking van de gelijktijdige 3-dimensionale verdelingen van drie cellulaire en extracellulaire componenten van biofilms. De methode bestaat uit duidelijke maar onderling verbonden stappen die betrekking hebben op biofilmgroei, kleuring, CLSM-beelden van biofilms, biofilmstructuuranalyse en visualisatie, en statistische analyse van structurele parameters. De biofilmgroei-assay maakt biofilmgroei mogelijk op relevante substraten en produceert biofilmstructuren die reproduceerbaar zijn. De combinatie van een nieuwe gelijktijdige kleuring van EPS-, eiwit- en nucleïnezuurcomponenten met de meting van 3D-biofilmstructurele parameters resulteert in kwantificeerbare verdelingen van componenten binnen biofilms. Statistische analyse van de biofilmstructurele parameters vergemakkelijkt evaluatie van biofilms onder specifieke experimentele omstandigheden (bijv. na behandeling met mondwater), zoals zal worden beschreven in de volgende sectie.

Protocol

1. Bereiding van media en reagentia

  1. Maak 300 ml overnight-kweekmedium (THY; 3% Todd Hewitt Broth bereid volgens de instructies van de fabrikant, aangevuld met 0,3% gistextract in ultrapuur water) en autoclaveer dit. Bewaar dit tot 2 maanden bij kamertemperatuur.
  2. Maak 1 L THY-agar (3% Todd Hewitt Broth, 0,3% gistextract en 1,5% agar in ultrapuur water), autoclaveer en laat afkoelen tot 60 °C voordat het in Petrischalen wordt gegoten. Bewaar dit tot 3 maanden bij 4 °C.
  3. Maak 150 ml biofilm-groeimedium (0,5X TY aangevuld met 10 mM sucrose; 1,5% tryptone, 0,5% gistextract en 10 mM sucrose in ultrapuur water) en steriliseer dit door filtratie. Bewaar dit tot 1 maand bij kamertemperatuur.
  4. Maak 1 L fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS; 8 g NaCl, 0,2 g KCl, 1,44 g Na2HPO4 en 0,24 g KH2PO4 in ultrapuur water) en autoclaveer dit. Bewaar dit enkele maanden bij kamertemperatuur.
  5. Maak 600 ml 10 mM Tris-HCl-buffer aangevuld met 10 mM CaCl2 in ultrapuur water (TC-buffer; pH 7,2) en autoclaveer dit. Bewaar dit enkele maanden bij kamertemperatuur.
  6. Autoclaveer 1 L ultrapuur water. Bewaar dit enkele maanden bij kamertemperatuur.

2. Fabricage van het specimen

  1. Fabriceer schijfvormige monsters van Point 4 (PF) en TPH3 (TP) tandheelkundige composietresins in een op maat gemaakte roestvrijstalen vorm in twee lagen. Elke laag wordt 40 sec lichtgepolymeriseerd met een LED-uithardingslamp. De twee producten hebben enigszins verschillende samenstellingen en vulgraad, waardoor ze verschillende oppervlaktetopografieën produceren waarop de biofilms zullen worden gekweekt.
    1. Monsters van relevante substraten kunnen worden gefabriceerd met behulp van gevestigde protocollen uit andere disciplines in plaats van stap 2.1.
  2. Afwerken en polijsten de monsters tot een acceptabele uiteindelijke oppervlakteafwerking, bijv. door gebruik te maken van een semi-automatische slijp- en polijstmachine. Spoel de gepolijste monsters met ultrapuur water en droog ze met perslucht.
  3. Steriliseer de monsters met ethyleenoxidegas of een alternatieve sterilisatiemethode.

3. Biofilmgroei

  1. Inoculeer een enkele kolonie S. mutans in 4 ml overnight-kweekmedium (stap 1.1). Incubeer dit gedurende 16-18 uur bij 37 °C. De optische dichtheid (OD600) van de kweek moet ≥0,9 zijn.
    1. Het is aanbevolen om een kolonie te gebruiken van plaatculturen die twee keer zijn overgeplaatst vanuit een oorspronkelijke voorraad, omdat dit leidt tot een consistentere biofilmgroei.
  2. Maak een 1:100 verdunning met de overnight-kweek (stap 1.1) in 10 ml biofilmgroeimedium (stap 1.3).
  3. Breng steriele composietresine monsters (bijv. PF, TP) over naar steriele 12-wellplaten.
  4. Voeg 2,5 ml van het verdunde kweekmedium (stap 3.2) toe aan de wells voor de behandelingsgroepen (mondspoelmiddel) en de controlegroepen. Voeg 2,5 ml steriel, niet-geïnoculeerd biofilmgroeimedium toe aan de wells voor de steriliteitscontrole.
  5. Kweek de biofilms onder micro-aerofiele omstandigheden. Plaats de platen op een shaker bij 100 rpm in een incubator bij 37 °C gedurende 24 uur.
  6. Aspireer na 24 uur aseptisch het medium uit alle wells en was deze twee keer met steriele PBS (stap 1.4; 2,5 ml/well), waarbij de PBS na elke wasbeurt wordt geaspireerd. Vul elke well opnieuw aan met 2,5 ml vers biofilmgroeimedium en incubeer nogmaals 24 uur onder identieke omstandigheden als in de vorige stap, voor een totale biofilmgroeitijd van 48 uur.
  7. In plaats van de bovenstaande stappen kunnen biofilms van andere soorten op substraten worden gekweekt met behulp van gevestigde protocollen.

4. Antibacteriële behandelingen/mondwaterspoelingen

  1. Aspireer het medium nadat de biofilmgroei is voltooid.
  2. Voeg 2,5 ml Biotène PBF (BIO) of Listerine Total Care (LTO) mondspoelmiddel, of een andere behandelingsmethode, toe aan de wells van de behandelingsgroepen, en voeg 2,5 ml steriel ultrapuur water toe aan de well van de controlegroep. Dompel de monsters gedurende 60 sec onder, volgens de instructies van de fabrikant, terwijl de platen worden geschud op een orbitale schudmachine bij 150 rpm. Aspireer onmiddellijk zowel het mondspoelmiddel als het ultrapure water uit de wells.
  3. Was de monsters 5x gedurende 15 sec per wasbeurt met steriel ultrapuur water op de orbitale schudmachine bij 150 rpm, waarbij het water na elke wasstap wordt geaspireerd.
  4. In plaats van de bovenstaande stappen kunnen andere antibacteriële middelen worden getest met behulp van gevestigde protocollen.

5. Kleuring

  1. Bereid de kleurendiluties voor de biofilmanalyse.
    1. Bereid een voorraadoplossing van 5 mg/ml Concanavalin A, Alexa Fluor 647 conjugaat (AF) in 0,1 M natriumbicarbonaat pH 8,3. Bewaar dit gedurende enkele maanden bij -20 °C in eenmalige aliquots, aangezien herhaaldelijk invriezen en ontdooien wordt afgeraden. Gebruik deze AF-voorraadoplossing om een verdunning van 250 μg/ml in TC-buffer te bereiden.
    2. Bereid een verdunning van 10 μM in TC-buffer met behulp van de 5 mM Syto 9 voorraadoplossing (SY), zoals geleverd door de fabrikant. Bewaar de resterende SY-voorraadoplossing gedurende enkele maanden bij -20 °C.
    3. Bereid een 10x verdunning in steriel ultrapuur water met behulp van de 5.000x Sypro Red voorraadoplossing (SR), zoals geleverd door de fabrikant. Bewaar de resterende SR-voorraadoplossing gedurende enkele maanden bij -20 °C.
  2. Was alle biofilms 2x met TC-buffer (2,5 ml/well) door de plaat voorzichtig met de hand te zwenken; laat de tweede wasbeurt 30 min bij kamertemperatuur in de plaat staan. Aspireer vervolgens.
  3. Plaats een druppel van 50 μl AF-kleurstof op elk biofilmmonster. Kleur 30 min bij kamertemperatuur, beschermd tegen licht. Was 2x met TC-buffer (2,5 ml/well) en aspireer na elke wasbeurt.
  4. Volg dit met een druppel van 50 μl SY-kleurstof op elk biofilmmonster. Kleur 30 min bij kamertemperatuur, beschermd tegen licht. Was 2x met steriel ultrapuur water (2,5 ml/well) en aspireer na elke wasbeurt.
  5. Plaats tot slot een druppel van 50 μl SR-kleurstof op elk biofilmmonster. Kleur 30 min bij kamertemperatuur, beschermd tegen licht. Was 3x met steriel ultrapuur water (2,5 ml/well) en aspireer na elke wasbeurt.
  6. Breng de monsters over naar een 6-well plaat, waarbij één monster per well in 6 ml steriel ultrapuur water wordt geplaatst om confocale microscopie te faciliteren.

6. Beeldvorming met behulp van confocale laser-scanning microscopie

  1. Leg beelden vast van elke component (kleuring) binnen de biofilms van de behandelings- en controlegroepen met behulp van een confocale laser scanning microscoop volgens de instellingen weergegeven in Tabel 1. In deze studie werd een 63X diplens met een numerieke apertuur van 0,9 en een werkafstand van 2,2 mm gebruikt.
    Biofilm kleuringsschema; lasergolflengten (nm) en emissiebanden (nm) voor EPS, nucleïnezuren, eiwitten.
    Tabel 1. Instellingen van de confocale laser scanning microscoop.

  1. Stel de scanmaat in op 250 μm x 250 μm en een minimale pixelresolutie van 512 x 512 om CLSM-beelden te verkrijgen met een resolutie die geschikt is voor kwantitatieve analyse.
  2. Gebruik de SY-kleuring om de bovenste en onderste punten van de biofilm-beeldstack in te stellen, en stel vervolgens de z-stap zo in dat deze geschikt is voor kwantitatieve analyse (0,6 μm voor deze studie). Optimaliseer vóór het uitvoeren van een scan de beeld- en kleuringsparameters (i.e. PMT-voltage en offset) met de QLUT-optie. Er werd een kleur-opzoektabel gebruikt om pseudokleuren toe te wijzen aan elke kleuring (groen voor SY, rood voor SR en blauw voor AF) om elke biofilmcomponent beter onderscheidbaar te maken in de 3D-reconstructie.
  3. Veramel CLSM-beelden bij 400 Hz met sequentiële scanning in de "between stacks"-modus om de opname van beelden van meerdere kleuringen binnen dezelfde biofilm te optimaliseren.

7. Structurele analyse van de biofilm

  1. Analyseer de verzamelde CLSM-beelden met behulp van beeldanalyse-software voor biofilms. De volgende stappen beschrijven het gebruik van ISA3D-software12 om de structurele parameters van de verzamelde biofilmbeelden te berekenen.
    1. Kopieer de CLSM-beeldbestanden voor elke biofilm naar de map 'Images', zoals gespecificeerd in de handleiding van de software. Zorg ervoor dat de door de software vereiste naamconventie voor CLSM-bestanden wordt gevolgd. De software maakt analyse van bestanden in submappen in batchmodus mogelijk, wat de analyse van biofilms uit de behandelings- en controlegroepen in één run faciliteert.
    2. Voer de x-, y- en z-asdimensies van de CLSM-beelden in de velden dxy en dz van het hoofddialoogvenster in. Selecteer de instellingen voor drempelwaarde en afstandskaarting, zoals beschreven in de handleiding van de software (voor deze studie werden respectievelijk Otsu en Quasi-Euclidean gebruikt). Voer een geschikte naam in voor het resultatenbestand en start vervolgens het programma. Er wordt een resultatenbestand gegenereerd in de ISA-map.
    3. Bekijk het resultatenbestand om waarden te verkrijgen voor twintig 3D-structurele parameters12, zoals biovolume en gemiddelde biofilmdikte (gemeten in deze studie), die de 3D-distributie van elk component (kleuring) binnen de biofilm kwantificeren.

8. Visualisatie van de biofilmstructuur

  1. Maak met behulp van beeldanalyse-software een reconstructie van de overlappende componenten (kleuringen) binnen elke biofilm. De volgende stappen beschrijven het gebruik van Volocity-software voor het maken van 3D-reconstructies.
    1. Maak voor elke biofilm een bibliotheek door de CLSM-beeldbestanden in de software te kopiëren, zoals beschreven in de handleiding.
    2. Gebruik de menuoptie 3D Renderer om een gereconstrueerd 3D-beeld te produceren op basis van de CLSM-beelden van elke biofilm (voor deze studie is het HR Opacity-formaat gebruikt).
    3. Draai het 3D-beeld zodat alle biofilms op een vergelijkbare manier zijn georiënteerd ten opzichte van de x-, y- en z-coördinatenassen. Maak een snapshot van de correct georiënteerde biofilm-reconstructie en exporteer deze snapshot vervolgens in TIFF-, JPEG- of een ander geschikt formaat.
  2. Voer op de gereconstrueerde beelden een visuele analyse uit van de gelijktijdige distributie van EPS, eiwitten en nucleïnezuurcomponenten binnen de biofilms.
  3. Gebruik de correlatiecoëfficiënt van Pearson en de overlapcoëfficiënt van Manders om een colocalisatie-analyse uit te voeren van meerdere biofilmcomponenten (colocalisatie is in deze studie niet gemeten).

9. Statistische analyse

  1. Gebruik afzonderlijke statistische analyses met mixed models om de gemiddelde waarden van structurele parameters tussen de mondspoelingsgroep en de controlegroep te vergelijken (α=0.05). Voor deze studie werd SAS-software gebruikt om de statistische analyse uit te voeren.

Resultaten

Representatieve resultaten voor de behandelingen (mondspoelmiddelen) en de onbehandelde controlegroep worden weergegeven in Tabel 2 en Figuur 1 en 2. Tabel 2 toont de gemiddelde waarden en standaarddeviaties van de biofilm structurele parameters biovolume (μm3) en gemiddelde biofilm dikte (μm), die zijn berekend met ISA3D-software. De structurele parameters van biofilms behandeld met mondspoelmiddel die significant verschilden van die van biofilms in de controlegroep (p<0.05) hebben gemiddelde waarden en standaarddeviaties die in het rood zijn gemarkeerd. De resultaten van de statistische analyses met mixed models toonden aan dat mondspoelmiddel BIO biofilmstructuren produceerde die significant verschilden van de controle (p<0.05) op beide composieten, terwijl mondspoelmiddel LTO geen significante verschillen produceerde (p>0.05) op geen van beide composieten. De resultaten laten duidelijk zien dat de cellulaire en extracellulaire biofilmcomponenten die na de twee behandelingen met mondspoelmiddel overbleven, verschilden. Er moet ook worden opgemerkt dat de S. mutans biofilms die groeiden op de twee substraten (PF en TP) verschilden in 3D-structuur, hoewel ze onder vergelijkbare omstandigheden waren gegroeid en beide substraten waren gepolijst met vergelijkbare schuurmiddelen.

De gelijktijdige distributie van EPS, eiwitten en nucleïnezuren binnen biofilms kan worden gevisualiseerd via de 3D-reconstructies die zijn gegenereerd met Volocity-software. Figuur 1 en 2 tonen representatieve reconstructies van biofilms uit de controlegroep, respectievelijk gegroeid op PF- en TP-harscomposieten. De blauwe kleuring vertegenwoordigt EPS binnen S. mutans-biofilms, de groene kleuring toont nucleïnezuren en de rode kleuring toont eiwitten. De tussenliggende ruimte kan worden ingenomen door water of andere niet-fluorescentieel gelabelde biofilmcomponenten.

3D-spreidingsdiagram, dynamische datavisualisatie, grafiek, interactief onderzoeksinstrument, analytisch display.
Figuur 1. Een representatieve 3D-reconstructie van S. mutans-biofilm gegroeid op PF-harscomposiet in de controlegroep (niet behandeld met mondspoelmiddel). Gelijktijdige overlay van de drie kleuringen binnen een enkele biofilm maakt de simultane visualisatie van EPS (blauwe kleuring), nucleïnezuren (groene kleuring) en proteïnecomponenten (rode kleuring) binnen S. mutans-biofilmen mogelijk. (1 Unit = 24 μm). Klik hier om de figuur in een groter formaat te bekijken.

Visualisatie van 3D-cellulaire structuur, fluorescentiemicroscopie, ruimtelijke data-analyse, wetenschappelijke grafiek.
Figuur 2. Een representatieve 3D-reconstructie van S. mutans biofilm gegroeid op TP-harscomposiet in de controlegroep (niet behandeld met mondspoelmiddel). Gelijktijdige overlay van de drie kleuringen binnen één biofilm maakt de simultane visualisatie van EPS (blauwe kleuring), nucleïnezuren (groene kleuring) en proteïnecomponenten (rode kleuring) binnen S. mutans biofilms mogelijk. (1 Unit = 24 μm). Klik hier om de figuur in een groter formaat te bekijken.

ComposietresinePunt 4TPH3
MondspoelingComponentBV (μm3)MT (μm)BV (μm3)MT (μm)
Biotène PBFNucleïnezuren279,517±53,2919.32±2.80195,033±42,0147.45±3.70
EPS344,902±56,38635.22±17.19197,840±62,3519.83±7.26
Eiwitten298,796±62,86854.21±21.65216,033±66,65424.33±39.64
Listerine Total CareNucleïnezuren355,707±110,44426.45±14.21273,296±47,32313.43±2.89
EPS494,099±180,59264.90± 26.68329,150±47,14534.35±30.32
Eiwitten348,416±161,31658.68±47.28303,150±54,70534.18±41.46
Controle (onbehandeld)Nucleïnezuren388,375±42,15251.15±40.66327,809±39,40017.08±1.65
EPS660,448±173,19791.37±74.84363,850±67,61228.33± 15.07
Eiwitten517,274±119,475127.96±73.84353,161±56,51821.17±4.41

Tabel 2. Gemiddelde waarden en standaarddeviaties van het biovolume (BV) en de gemiddelde biofilmdikte (MT) van biofilms behandeld met BIO of LTO, of onbehandeld gelaten (controlesgroep). Structurele parameters van biofilms behandeld met mondspoelmiddelen die significant verschilden van die van biofilms in de controlegroep (p<0.05) hebben gemiddelde waarden en standaarddeviaties die in het rood zijn gemarkeerd.

Discussie

De verwerving van CLSM-beelden moet worden uitgevoerd op de manier en in het formaat dat nodig is voor de kwantificering van biofilms en voor colocalisatiesanalyse, zodat de verdeling van signaalintensiteit in elk beeld een betrouwbare weergave is van de verdeling van elke fluorofoor in de biofilm-stack. De signaalintensiteit moet onderscheidbaar zijn van ruis en achtergrond10,11, onaangetast door autofluorescentie van het substraat en met minimale overslag vanwege spectrale interferentie tussen de gebruikte fluoroforen11. Ruis is een onvermijdelijke beperking van fluorescentiemicroscopie11, en de beeldkwaliteit kan soms worden beperkt om technische of logistieke redenen. Identificatie van fluoroforen met minimale spectrale overlap is cruciaal voor het succes van deze methode, maar kan gecompliceerd zijn. Bovendien stelt de kwantificering van meerdere fluoroforen een multifactorieel probleem. Daarom is het niet verwonderlijk dat zeer weinig onderzoeken met succes de gelijktijdige verdeling van meer dan twee componenten binnen de structuren van biofilms hebben gekwantificeerd.

Het doel van deze studie was om een methodologie te rapporteren die bestaat uit verschillende maar onderling verbonden stappen voor de kwantificering en vergelijking van de gelijktijdige 3-dimensionale verdelingen van drie cellulaire en extracellulaire componenten binnen biofilms. De beschreven biofilmgroeiassay staat biofilmgroei toe op relevante substraten en produceert biofilmstructuren die reproduceerbaar zijn, zoals aangetoond door de resultaten die worden gerapporteerd in Tabel 1. De combinatie van een nieuwe gelijktijdige kleuring van EPS, eiwitten en nucleïnezuurcomponenten met de meting van 3D-biofilmstructurele parameters resulteert in kwantificeerbare verdelingen van componenten binnen biofilms. Kwalitatieve visuele analyse van de gelijktijdige verdeling van EPS, eiwitten en nucleïnezuur binnen de biofilms is mogelijk via de reconstructie van overlappende kleuringen binnen elke biofilm. De ISA3D-software12 bevat verschillende unieke structurele parameters zoals fractale dimensie, homogeniteit en biofilm-ruwheidscoëfficiënt naast traditioneel gemeten parameters zoals porositeit en biofilmdikte om de kwantificering van de 3D-structuren van biofilms te verbeteren. Statistische analyse van de biofilmstructurele parameters vergemakkelijkt relevante vergelijkingen van biofilms onder specifieke experimentele omstandigheden zoals antibacteriële/antifouling-effectiviteit (bijv. na behandeling met mondspoelingen) of in de tijd (temporele effecten).

Deze methodologie kwantificeerde en vergeleek efficiënt en succesvol de gelijktijdige 3D-verdelingen van drie belangrijke componenten binnen S. mutans-biofilms die werden gekweekt op relevante substraten, waardoor twee uitdagingen voor de gelijktijdige beoordeling van biofilmcomponenten werden overwonnen. Deze methode kan ook worden gebruikt om de effectiviteit van antibacteriële behandelingen of antifoulingmaatregelen tegen meerdere biofilmcomponenten te bepalen, zoals getoond met behulp van mondspoelingen in deze studie. Bovendien kunnen de meeste van de hierboven beschreven protocollen worden vervangen door protocollen voor de fabricage van relevante substraten en biofilmgroeiassays van relevante micro-organismen. Daarom heeft deze methode een brede toepassing omdat het de vergelijking van 3D-structuren/architectuur van in vitro en in vivo biofilms in een verscheidenheid van disciplines mogelijk maakt, waaronder de medische, tandheelkundige, geologische en mariene wetenschappen.

Openbaarmakingen

De auteurs verklaren dat ze geen concurrerende financiële belangen hebben. Productie en gratis toegang tot dit artikel wordt gesponsord door Leica Microsystems.

Dankbetuigingen

De financiering voor deze studie werd verstrekt door de National Institutes of Health/NIDCR-subsidie 1R15DE019566-01A1. Dr. Jim Henthorn (OUHSC Flow and Image Cytometry Laboratory) wordt erkend voor het bieden van technische assistentie bij confocale laserscanmicroscopie. Dr. Fernando Esteban Florez (Afdeling Tandheelkundige Materialen) wordt erkend voor het bieden van technische assistentie tijdens het filmen van deze video.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Bacto AgarBecton, Dickinson and Company214010
Bacto Todd Hewitt BrothBecton, Dickinson and Company249240
Yeast Extract, GranulatedEMD Millipore1.03753.0500
Bacto TryptoneBecton, Dickinson and Company211705
OmniPur SucroseEMD Millipore8510
Potassium Chloride, ACS reagent, 99.0-100.5%Sigma-AldrichP3911-500G
Potassium Phosphate, monobasic, ≥99.0%, ACS reagentSigma-AldrichP0662-500G
Sodium ChlorideSigma-AldrichS9888-500G
Sodium Phosphate, Monobasic, MonohydrateEMD MilliporeSX0710-1
Tris(hydroxymethyl)aminomethane, 99.8+%, ACS reagentSigma-Aldrich252859-500G
Concanavalin A, Alexa Fluor 647 ConjugateInvitrogenC21421
Syto 9InvitrogenS34854
Sypro RedInvitrogenS12012 of S6653
Biotène PBF Oral RinseGlaxoSmithKlineN/A
Listerine Total CareMcNeil-PPC, Inc.N/A

Referenties

  1. Costerton, J. W., Stewart, P. S., Greenberg, E. P. Bacterial biofilms: a common cause of persistent infections. Science. 284, 1318-1322 (1999).
  2. Hall-Stoodley, L., Costerton, J. W., Stoodley, P. Bacterial biofilms: from the natural environment to infectious diseases. Nat. Rev. Microbiol. 2, 95-108 (2004).
  3. Yang, Y., Sreenivasan, P. K., Subramanyam, R., Cummins, D. Multiparameter assessments to determine the effects of sugars and antimicrobials on a polymicrobial oral biofilm. Appl. Environ. Microbiol. 72, 6734-6742 (2006).
  4. Klein, M. I., Xiao, J., Heydorn, A., Koo, H. An analytical tool-box for comprehensive biochemical, structural and transcriptome evaluation of oral biofilms mediated by mutans streptococci. J. Vis. Exp. , (2011).
  5. Conchello, J. A., Lichtman, J. W. Optical sectioning microscopy. Nat. Methods. 2, 920-931 (2005).
  6. Robinson, J. P. Principles of confocal microscopy. Methods Cell Biol. 63, 89-106 (2001).
  7. Neu, T. R., Kuhlicke, U., Lawrence, J. R. Assessment of fluorochromes for two-photon laser scanning microscopy of biofilms. Appl. Environ. Microbiol. 68, 901-909 (2002).
  8. Wood, S. R., et al. Architecture of intact natural human plaque biofilms studied by confocal laser scanning microscopy. J. Dental Res. 79, 21-27 (2000).
  9. Chen, M. Y., Lee, D. J., Tay, J. H., Show, K. Y. Staining of extracellular polymeric substances and cells in bioaggregates. Appl. Microbiol. Biotechnol. 75, 467-474 (2007).
  10. Zinchuk, V., Zinchuk, O., Okada, T. Quantitative colocalization analysis of multicolor confocal immunofluorescence microscopy images: pushing pixels to explore biological phenomena. Acta Histochem. Cytochem. 40, 101-111 (2007).
  11. Dunn, K. W., Kamocka, M. M., McDonald, J. H. A practical guide to evaluating colocalization in biological microscopy. Am. J. Physiol. Cell Physiol. 300, C723-C742 (2011).
  12. Beyenal, H., Donovan, C., Lewandowski, Z., Harkin, G. Three-dimensional biofilm structure quantification. J. Microbiol. Methods. 59, 395-413 (2004).

Herprints en machtigingen

Trefwoorden

Kwantificering van biofilmconfocale microscopieextracellulaire polymere stoffenkleuring van nucle nezureneiwitkleuringstructurele analyse van biofilm3D beeldreconstructiestatistische analysebehandeling met mondwaterStreptococcus mutans
Concurrent Kwantificering van Cellulaire en extracellulaire componenten van biofilms
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleid

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.