Antilichaamkleuring in C. Elegans Een 'Freeze-Cracking "

Samenvatting

"Freeze-kraken," een werkwijze voor het blootstellen van de inwendige weefsels van de nematode C. elegans antilichamen voor eiwit lokalisatie, wordt aangetoond.

Samenvatting

Om C. vlek elegans met antilichamen, moet de doorlatende cuticula worden omzeild door chemische of mechanische methoden. "Freeze-kraken" is een methode die wordt gebruikt om fysiek trek de cuticula van nematoden door het comprimeren van nematoden tussen twee aanhangend dia's, ze in te vriezen, en de dia's uit elkaar te trekken. Freeze-kraken is een eenvoudige en snelle manier om toegang tot de weefsels krijgen zonder chemische behandeling en kan worden gebruikt met een verscheidenheid van fixeermiddelen. Dit leidt echter tot het verlies van veel van de monsters en de vereiste compressie mechanisch vervormt het monster. Praktijk is nodig om het herstel van de monsters met een goede morfologie maximaliseren. Freeze-kraken kan worden geoptimaliseerd voor specifieke fixatie voorwaarden terugwinning van monsters of lage niet-specifieke kleuring, maar niet voor alle parameters tegelijk. Voor antilichamen die zeer moeilijk fixatie omstandigheden dit vereisen en tolereren de chemische behandelingen nodig zijn om chemisch permeabiliseren de cuticula, treatment van intacte nematoden in oplossing de voorkeur. Wanneer het antilichaam is een lichtere oplossing of als de optimale fixatie voorwaarden bekend, vries-kraken levert een zeer nuttige manier om snel assay het antilichaam en kunnen specifieke subcellulaire en cellulaire lokalisatie informatie opleveren voor het antigeen van belang.

Inleiding

Om de cellulaire en subcellulaire lokalisatie van eiwitten te bepalen, hebben wetenschappers traditioneel gemerkte weefsels met antilichamen geselecteerd om specifiek bepaalde eiwitten herkent ^1. In sommige model organismen zoals C. elegans, antilichaam kleuring is vaak vervangen door moleculaire genetische technieken, die sneller resultaten opleveren. Deze omvatten transformeren organismen constructen bestaande uit genfusies tussen de promoter en coderende regio van het gen van interesse en groen fluorescerend proteïne. Echter, moleculaire technieken zijn onderhevig aan een aantal voorwerpen, waaronder problemen met het kennen van de ware promotor en veranderingen in expressie van de constructen een groot aantal kopieën (gebruikelijke technieken in C. elegans) ^2,3. Daarom kleuring met antilichamen blijft een doel voor veel wetenschappers bestuderen eiwit functie in vivo.

Kleuring weefsels met antilichamen kan moeilijk zijn, omdat eentibodies mogen alleen hun antigeen herkennen in een bepaalde conformatie ^1. Bijvoorbeeld kunnen antilichamen alleen gedenatureerde of intacte antigeen vast op een bepaalde manier herkennen en het antigeen in situ niet herkennen. Het probleem van antilichaam kleuring in nematoden wordt verergerd door het feit dat de cuticula van de nematode vormt een betrekkelijk ondoordringbare barrière, toegang van antilichamen aan weefsels blokkeren.

Er zijn verschillende methoden voor antilichaam kleuring in C. elegans (besproken in onze vorige werk ^4). Intacte vlek "wormen werden methoden ontwikkeld om bevriezen en ontdooien in een relatief hard fixeermiddel (formaldehyde of glutaaraldehyde), de vries-dooi cycli helpen de cuticula kraken snelle penetratie van het fixeermiddel ⁵ toestaan. Na fixatie werd de cuticula permeabel de penetratie van het antilichaam mogelijk te maken; methoden inbegrepen behandeling met reductiemiddelen, collagenase of beide ^5-7. Deze treatments bewaard morfologie, maar vaak verminderd of vernietigd antilichaam herkenning. Alternatieve methoden omvatten dissectie ⁸ tot antilichaam penetratie mogelijk te maken.

"Freeze-kraken" is een manier om toegang tot het inwendige van de semi-intacte worm krijgen zodat antilichaam kleuring ^9-10. Freeze-kraken kan worden uitgevoerd met verschillende fixatie omstandigheden terwijl het vermijden collagenase en vermindering behandelingen. De nematoden worden geplaatst tussen twee kleefstoffen dia, bevroren, en de glijbanen zijn gescheiden, terwijl de meeste van de nematode aan de onderkant glijbaan en veel van de cuticula van de bovenste slede. De onderste dia kan in fixatief worden geplaatst en de gehele dia met gehandeld nematoden wordt overgedragen via de antilichaamkleuring procedure. De methode doet dit moment twee grote problemen. Ten eerste is het moeilijk om de juiste hoeveelheid druk nodig om de nematoden splitsen zonder serieus vervormen toepassen. Ook een in de wormen zal niet saankruisen om ofwel dia, en gaan verloren in de lijm of spoelingen. Echter, met de juiste glijbanen en praktijk de methode snel nematoden opleveren redelijke morfologie die kunnen worden gebruikt met een grote verscheidenheid van fixeermiddelen en antilichamen.

De werkwijze kan enigszins variëren, afhankelijk van het doel van de experimentator. Indien kleuring van enkele nematoden gewenst (bijvoorbeeld om te bepalen of een transformant antilichaam kleuring is veranderd), dan schuift met maximale hechting (maar hogere achtergrondkleuring) kunnen worden gebruikt, zoals laboratorium bereide objectglaasjes met extra polylysine (zie hieronder). Voor formaldehyde of glutaaraldehyde fixatie, moeten hogere hechting slides (-laboratorium vervaardigde polylysine slides) worden gebruikt, omdat aaltjes zich meer slecht op polylysine na deze fixaties. Als wildtype nematoden worden gefixeerd met methanol en / of aceton, dan schuift met lagere hechting en lagere achtergrond kleuring worden gebruikt (commercieel of laboratory bereid dia). Indien verschillende antilichamen en fixeermiddelen worden gebruikt in het laboratorium, kan een selectie dia tevoren worden bereid en opgeslagen totdat ze nodig.

Nadat is toegang gekregen tot de nematode weefsel, antilichaamkleuring procedures te volgen standaard methoden (met een langere incubaties kenmerk van weefsels in plaats van cellen ^1,11).

Protocol

OPMERKING: Meerdere protocol stappen worden met opties voor de set-up en voorbereiding afhankelijk van de specifieke omstandigheden van het experiment. In deze gevallen worden alternatieve stappen voorgesteld als A, B, C, enz. Het protocol met alternatieve stappen is beschreven in figuur 1.

1. Voorbereiding van Polylysine gecoate glaasjes

Drie verschillende soorten dia worden gebruikt, afhankelijk van het gewenste compromis tussen gemak van bereiding, relatieve adhesie en niet-specifieke binding van het antilichaam. Details van dia voorbereiding alternatieven worden hieronder in stappen 1A-1C in volgorde van toenemende hechting en complexiteit gegeven. Slides van deze verschillende werkwijzen kunnen samen worden gebruikt voor een experiment.

1A. Geen glijbaan voorbereiding

In de handel verkrijgbare polylysine gecoate glaasjes bieden lage wrijvingscoëfficiënt en lage achtergrond.

1B. Slide preparation optimaal voor methanol-aceton fixatie

Medium hechting en lage achtergrond.

1. Bereid een polylysine oplossing dompelen van de dia: Voeg 400 mg zeer hoog molecuulgewicht (150.000 - 300.000 D) poly-L-lysine tot 200 ml dubbel gedestilleerd water. Voeg 2 ml 10% natriumazide voorraad (eindconcentratie 0,1%) als conserveermiddel. LET OP: droog natriumazide is reactief en alle vormen zijn giftig. Dragen masker en handschoenen, terwijl een gewicht poeder tot 10% voorraad te maken met tweemaal gedestilleerd water.
2. Veeg enkele einde matglas dia's met niet-pluizende doekjes, het verwijderen van vlekken en deeltjes. Dit moet ook gedaan worden op dia's gekocht met de aanduiding "voorgereinigde."
3. Plaats de glaasjes back-to-back in een houder, Coplin pot of andere dia vlekken container, houden berijpte randen en niet helemaal perfect uitgelijnd (later scheiding gemakkelijker te maken). Plaats slice houder bekerglas met 70% ethanol (reagenskwaliteit alcohol niet noodzakelijk) met 1% HCl in diverstilde water of vul vlekken potje om niveau van glazuur. Rock dia in oplossing gedurende ten minste 5 minuten. LET OP: Deze oplossing is bijtend, draag handschoenen. OPMERKING: Deze oplossing kan meerdere keren worden hergebruikt (tot enkele maanden).
4. Spoel dia's in running gedestilleerd water gedurende 1 minuut.
5. Droge dia volledig in een stofvrije omgeving ofwel door het plaatsen in een 40-60 ° C oven gedurende 30-60 minuten of door hem overnacht bij kamertemperatuur.
6. Incubeer dia's in polylysine oplossing (die unfrosted delen) op rocker gedurende 15 minuten.
7. Herhaal het drogen van dia's.
8. Herhaal polylysine oplossing incubatie en droogstappen.
9. Scheid de dia's met behulp van een slanke metalen voorwerp, zoals een dunne wegen spatel. Als ze goed worden nageleefd, zijn ze moeilijk te scheiden. Draag geschikte veiligheidsuitrusting (veiligheidsbril) en werken op de bank boven papier (na gebruik worden weggegooid), aangezien kleine stukjes glas kunnen vliegen los wanneer dia's worden gescheiden.
10. Store dia's in schoon(Stofvrij) dia doos bij 4 ° C totdat het nodig is.

1C. Schuif voorbereiding optimaal voor formaldehyde fixatie

Hoogste hechting maar hoge achtergrond.

1. Plaats de glaasjes bereid met methode 1B flat in een stofvrije, ovenvaste schaal (voor het drogen in de oven) of op een vlakke stofvrije ondergrond (voor de lucht drogen).
2. Plaats een 20-60 ul druppel van de oplossing polylysine midden op elke dia.
3. Droge dia geheel in de oven of bij kamertemperatuur. De polylysine zal achter bleke ovalen laten zoals het verdampt. Deze ovalen zijn zeer lijm. Helaas, ze binden ook aan de primaire en secundaire antilichamen, zelfs na het opspannen.
4. Store slides in schone (stofvrije) dia doos bij 4 ° C totdat het nodig is.

2. Voorbereiding van Frozen Nematoden Slides

Bereid nematoden voor kleuring door het volledig spoelen vrij van bacteriën met behulp van methode 2A (voor borden van nematoden) of2B (voor individuele nematoden).

2A. Voorbereiding van dia's uit platen van nematoden

1. Plaats een plat stuk metaal op droog ijs naar prechill.
2. Gebruik gedestilleerd water en een glazen pipet (vermindert verlies van wormen) of micropipet om wormen van NGM plaat met bacteriën te spoelen in een 1,5 ml microfugebuis. Platen kunnen worden gesynchroniseerd of gemengd leeftijden, doe platen niet met veel dauers (moeilijk te kraken) of uitgehongerd wormen (verhoogde autofluorescence), tenzij noodzakelijk.
3. Spoel de wormen 3-4x met gedestilleerd water tot vrij van bacteriën. (Om verlies van wormen verlagen gebruiken dezelfde glazen pipet.) Om wormen pellet, ofwel laat ze op de bank zitten voor 3-5 minuten (om vooral volwassenen te verzamelen aan de onderkant van de buis) of spin 30 sec bij ~ 1000 rpm (~ 500 g) in een tafelblad centrifuge (voor volwassenen, larven en embryo verzamelen).
4. Verwijder het meeste water uit buis met wormen, waardoor ongeveer tweemaal de hoeveelheid water wormen (maar tenminste 25 ui totaal volume).
5. Label matte kant van de "onderkant" (behandeld in stap 1) polylysine dia's met onuitwisbare inkt en plaats dia's op teller naast de container met droog ijs, het label naar boven.
6. Hebben een gelijk aantal vaste (schoongeveegd maar niet polylysine behandeld) "top" dia's beschikbaar.
7. Plaats ~ 25 ul wormen in water op de "bodem" hechtend glijden en verspreiden de vloeistof die de wormen over het centrale gedeelte van de schuif met de zijkant van pipetpunt.
8. Laat de wormen af ​​te wikkelen gedurende 30 seconden tot 2 minuten. Als de schuif geschikt kleverig, de uiteinden van de wormen houden zij contact met de dia.
9. Houd de onderkant dia in de ene hand en plaats de bovenste dia over de bodem glijden zodat alle, maar de bevroren delen elkaar overlappen. De vloeistof moet de dia's iets uit elkaar te houden, zodat de wormen iets bewegen nog steeds Laat de dia's glijden over elkaar -. Dit verdraait de wormen.
10. Druk voorzichtig recht naar beneden slicht op de bovenste dia, met behulp van de duimen en wijsvingers van elke hand. Met het ideale hoeveelheid druk, zal een paar van de grootste hermafrodieten aan de rand van de dia scheuren, terwijl de meeste volwassenen en larven contact met elkaar dia maar intact blijven.
11. Onmiddellijk en zorgvuldig (zonder slippen) zet de dia's op het stuk metaal op droog ijs. De dia's moeten lijken bevroren binnen een minuut. Blijf op droog ijs gedurende 5 minuten totdat het helemaal bevroren.
12. Op dit punt kan dia in gelabelde vakken bij -80 ° C worden bewaard gedurende enkele dagen. (Als ze worden bewaard weken bij -80 ° C, zal het water begint weg te sublimeren en de wormen zullen niet zo goed vlekken). Als dia's worden bewaard bij -80 ° C, laat ze 'opwarmen' op droog ijs gedurende 10 minuten vóór kraken.
13. Ga naar stap 3 (fixatie).

2B. Voorbereiding van de dia's van de individuele nematoden

1. Plaats een plat stuk metaal op droog ijs naar voorgheuvel.
2. Gebruik een worm pick individuele nematoden dragen aan een druppel water op een NGM plaat om ze te bevrijden van bacteriën. Nematoden (s) moet goed gevoed aan autofluorescentie afnemen, indien mogelijk. Herhaal transfer naar nieuwe plekjes van water als nodig tot worm (s) zijn vrij van bacteriën.
3. Label matte kant van de "onderkant" polylysine dia's met onuitwisbare inkt en plaats dia's op teller naast de container met droog ijs, het label naar boven. Hebben een gelijk aantal minder adherent "top" (onbehandeld) slides beschikbaar.
4. Plaats een 5-10 ul druppel water op het gebied van de onderste schuif dubbel-behandeld met polylysine. Gebruik het grotere volume als de overdracht van meer wormen, te voorkomen dat het water verdampt voordat deze is voltooid.
5. Breng de worm (s) om de daling van water met de worm oogst, met behulp van de microscoop om te kijken als de wormen zinken om de kleverige dia oppervlak aanraakt. Breng zo weinig als een worm tot wel 20 + wormen per druppel.
6. Houd de onderkant slide in de ene hand en plaats de bovenste dia over de bodem glijden zodat alle, maar de bevroren delen elkaar overlappen.
7. Onmiddellijk en zorgvuldig (zonder slippen of comprimeren) de dia's die op de stuk metaal op droog ijs. Blijf op droog ijs gedurende 5-30 minuten. (Niet deze dia's op te slaan op lange termijn, als de dia's gemakkelijk uitdrogen.)
8. Ga naar stap 3 (fixatie).

3. Bevestiging

Fixatieven zijn nodig om 'fix' het antigeen op zijn plaats in de cel, door ofwel precipitatie ("lichte fixatie") of cross-linking ("harde fixatie") het antigeen. Fixatie kan antigeniciteit verstoren; meest bekende antilichamen werken het beste met een bepaalde fixatie aandoening. Voor nieuwe antilichamen, moet een reeks fixatie omstandigheden getest.

Voor bevestiging, de eerste stap is fosfaatgebufferde zoutoplossing maken. Volgende fix dia's met nematoden voor antilichaamkleuring volgens methode A (lichtlossen met behulp van methanol en aceton) of B (harder fix met behulp van formaldehyde of glutaaraldehyde).

1. Bereid een steriel 10x PBS (fosfaat gebufferde zoutoplossing) stock-oplossing door het toevoegen van 80 g NaCl, 2,0 g KCl, 27,2 g Na ₂ HPO ₄ • H ₂ 0, 2,4 g KH ₂ PO _4, 20 ml 10% natriumazide voorraad. Om deze stamoplossing te maken, wegen uit natriumazide poeder tot 10% oplossing te maken met tweemaal gedestilleerd water. Roer zoutoplossing met zacht vuur totdat het is opgelost. LET OP: droog natriumazide is reactief en alle vormen zijn giftig. Dragen masker en handschoenen tijdens het werken met droge natrium azide of oplossingen.
2. Laat zoutoplossing cool (Tris pH is temperatuurgevoelig), vervolgens de pH tot 7,2 met 1-10 M NaOH. Top tot 1 L met dubbel gedestilleerd water en autoclaaf te steriliseren. Bewaren bij kamertemperatuur en verdun tot 1x zo nodig met steriel dubbel gedestilleerd water. LET OP: NaOH is bijtend - draag handschoenen tijdens het gebruik.

3A. Licht vast te stellen met behulp van methanol-aceton

1. Put 100% methanol, 100% aceton en 1 x met fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS) in kleurbakjes op ijs prechill minstens 10 minuten. LET OP: Methanol en aceton zijn giftig, draag handschoenen.
2. Neem een ​​paar van de onderste en bovenste dia's uit het droogijs, snel draai ze uit elkaar, en onmiddellijk dompel de "onderkant" slide in ijskoud methanol gedurende 2 minuten. De "top" slide worden weggegooid.
3. Overdracht dia uit methanol koude aceton ijs gedurende 4 minuten. Als de dia's had veel wormen, de meeste (90%) zal eraf vallen in de fix, zelfs met de best voorbereide dia's. Als enkele worm dia's goed waren voorbereid, moet de wormen blijven aangehouden.
4. Plaats of dompel de dia's in de pot met PBS (af te spoelen fixatief) en ga verder met stap 4 (vlekken).

3B. Hard fix formaldehyde of glutaaraldehyde

1. Verdun reagenskwaliteit formaldehyde of glutaaraldehyde oplossing 1x PBS tot 0,5-4% eindconcentratie. Aliquots (1,5 ml) may opgeslagen stevig afgedicht bij -20 tot -30 ° C, ontdooien monsters op ijs net voor gebruik. OPMERKING: formaldehyde oplossingen verloop van tijd en blootstelling aan de lucht. LET OP: formaldehyde en glutaaraldehyde zijn giftig, draag handschoenen en werken in de kap.
2. Neem een ​​paar van de onderste en bovenste dia's uit het droogijs, snel draai ze uit elkaar, en onmiddellijk het "bottom" slide met wormen in de platte schaal met deksel. (De bovenste dia kan worden weggegooid).
3. Onmiddellijk Pipetteer 200 ul toxische fixatief boven het midden van het gebied van de dia met wormen. De fixerende zal gedeeltelijk bevriezen in plaats, dan smelten tot een groter gebied van de dia te dekken.
4. Als de wormen zijn niet volledig bedekt met fixatief, onmiddellijk en voorzichtig meer fixatief met behulp van een micropipet. Sta niet toe dat fixatief te stromen over de rand van de dia.
5. Bedek de schaal met een deksel en laat gedurende 10 minuten tot overnacht bij kamertemperatuur. Zorg ervoor dat de schotel wordt bevochtigd indien langer incubaties are gebruikt - dit kan worden gedaan door het toevoegen van gevouwen natte-pluizende doekjes aan het gerecht. Laat de doekjes de dia's te raken.
6. Na fixatie is voltooid, voorzichtig pipet het fixeermiddel met losse wormen in een 1,5 ml buis en dompel de dia in een kleuring pot met PBS.
7. Draai de buis met wormen die los op hoge snelheid kwam gedurende 30 sec tot pellet. Spoel de wormen tweemaal met PBS, dan verwerken parallel aan de wormen op de glijbaan (van stap in microfuge buizen, niet op dia).
8. Ga verder met stap 4 (vlekken).

4. Antilichaam kleuring

Het antilichaam kleuring protocol is vergelijkbaar met standaardprotocollen voor elk weefsel op dia. Dit protocol is hetzelfde voor alle dia ongeacht de bereiding in stap 1-3.

1. Bereid antilichaambuffer door mengen van 700 ml dubbel gedestilleerd water, 100 ml 10 x PBS, 5 ml Triton X-100 (0,5% eind), 2 ml 0,5 M EDTA pH 8 (1 mM eind), 1 g BSA (0,1% eind), 5 ml 10% natrium azide-oplossing (0,05% definitief). pH op 7,2 met HCl, voeg vervolgens dubbel gedestilleerd water tot 1 liter, bewaar bij 4 ° C.
2. Bereid Block door aanmaken ezel serum met dubbel gedestilleerd water, dan is het toevoegen van 5 ml serum tot 45 ml antilichaam buffer (laatste 10% serum).
3. Bereid primaire en secundaire antilichaam Solutions door verdunning van antilichaam in antilichaam buffer plus 1% BSA. Aanbevolen verdunningen zijn 1:50-1:2,000 voor primaire antilichamen en 1:1,000-1:5,000 voor secundaire antilichamen (Cy3or OG488 geconjugeerde ezel antilichamen tegen species gebruikt om primaire antilichaam te verhogen).
4. Bereid DAPI voorraad door het mengen van 2,5 mg / ml in dubbel gedestilleerd water; winkel in 8 ul porties ingevroren bij -30 ° C. LET OP: DAPI is een giftige DNA-bindende kleurstof, draag handschoenen bij het wegen en doseren in porties.
5. Bereid 10 ml Mounting Medium door het mengen van 200 mg n-propylgallaat, 0,3 ml 1 M Tris pH 9, 2,7 ml dubbel gedestilleerd water in een 15 ml conische buis. Verhit bij 65 ° C gedurende ongeveer 10 minuten totdat het is opgelost.7 ml glycerol en een 8 pi aliquot van DAPI en vortex goed. Aliquot medium in 1,5 ml buizen, wikkel in folie en bewaar in het donker bij 4 ° C (zowel lucht en licht degraderen de middellange - als het wordt meer geel, gooi in Biohazard afval). LET OP: n-propylgallaat is een reactieve anti-oxidant, draag handschoenen bij het wegen.
6. Overdracht dia een kleuring pot met Blok 1 uur bij kamertemperatuur of overnacht bij 4 ° C (gedurende de nacht voorkeur voor harde fix). Vermijd het schudden aan het verliezen wormen voorkomen.
7. Transfer glijdt naar pot met primair antilichaam of plaats dia's flat in een bevochtigde schotel en top elk met 100-500 ul primair antilichaam kleuring. Incubeer dia's overnacht bij 4 ° C zonder schudden.
8. Na het primaire antilichaam incubatie, overdracht glijdt naar pot PBS kleuring.
9. Filter Block via trechter filtreerpapierbekleding en bewaar bij 4 ° C, als steriel gefiltreerd elke 1-2 weken, kan Block opnieuw worden gebruikt voor 1 of meerdere maanden. Evenzo, filteren en op te slaanprimaire antilichaam bij 4 ° C voor hergebruik (tot 10 of meer ronden van kleuring).
10. Rinse schuift drie keer (~ 20 min elk) in antilichaam buffer.
11. Plaats objectglaasjes secundair antilichaam in een lichtdichte houder kleuring en incubeer 4 uur bij kamertemperatuur of overnacht bij 4 ° C.
12. Transfer glijdt naar pot PBS kleuring. Filter en bewaar secundair antilichaam bij 4 ° C voor hergebruik (tot 10 of meer ronden van kleuring).
13. Rinse schuift drie keer (~ 20 min elk) in antilichaam buffer.
14. Transfer schuift aan PBS en laat in PBS (minuten tot overnacht bij 4 ° C) tot klaar om te monteren.
15. Werk snel op afzonderlijke dia's, zodat de wormen aan de voorzijde van dia nat blijven. Verwijder een dia uit de PBS, droog weer van de dia met een pluisvrije doek, en leg ze op keukenpapier.
16. Plaats ~ 20 pi fixeermiddel dan wormen zodat er ongeveer gelijke delen medium en PBS op dia tilt Schuif de twee oplossingen te mengen. CautION: Mounting medium is giftig.
17. Tilt slide dus matrand lager en oplossing verzamelt buurt glazuur, plaats dan een rand van 24 x 60 mm dekglaasje on oplossing.
18. Sluit voorzichtig het dekglaasje om luchtbellen (die bleken te verhogen en verstoren bezoeker) te minimaliseren. Wanneer u zeepbellen, til de rand van het dekglaasje langzaam, relower het dan zonder het schuiven van de dekglaasje over de wormen.
19. Droog voorzichtig de rand van de dia zonder het verplaatsen van het dekglaasje, door het comprimeren van de randen met een niet-pluizende doek. De relatief droge rand van de glijbaan moet zichtbaar zijn rondom de rand van het dekglaasje
20. Dicht de dekglaasje met 2-3 lagen nagellak. Dia's kunnen in een vlakke dia houder worden geplaatst tijdens de bereiding en de opslag te beschermen tegen licht. Zodra slide goed afgesloten en droog, reinig het dekglaasje en achterkant van de glijbaan.
21. Goed afgesloten dia's in het donker dagen houdbaar bij 4 ° C of weken bij -20 ° C. Over langere perioden, DAPI staining van DNA en de meeste groene kleurstoffen (bijv. 488 nm excitatie) vervagen. Verzegelt het dekglaasje met meer nagellak als nodig is, bijvoorbeeld na het gebruik van olie-immersie lens.

Resultaten

Wanneer wormen behoren worden gecomprimeerd, gebarsten, en licht vast kan vrijwel de gehele worm toegankelijk antilichaam kleuring (zie figuur 2). De locatie van de kernen zoals aangegeven door DAPI kleuring geeft aan welke delen van de worm intact Wanneer de wormen worden onderworpen aan een hardere fixeermiddel, zoals formaldehyde, kan de morfologie van de worm vervormen (zoals gezien door de onnatuurlijke golvende uiterlijk van de spieren in figuren 3A-D). Een ander veel voorkomend p...

Discussie

De gevries kraken protocol is een van de manieren voor antilichaamkleuring in C. elegans. Het biedt een relatief eenvoudige manier om wormen te kleuren, maar vereist specifieke reagentia en de praktijk voor een optimaal resultaat. Kritische stappen (geschetst in figuur 1) zijn: 1) de voorbereiding glijbaan (zie stap 1 en 2) manuele compressie van de nematoden (zie stap 2 en 3) snelle fixatie (zie stap 3). Ten eerste, om de hechting van de nematoden op de dia maximaliseren, is het het beste om d...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
poly-L-lysine slide (ESCO merk)	Fisher	12-545-78	Ook slides van het merk Sigma zijn geschikt
poly-L-lysine hydrobromide	Sigma	P1524	BELANGRIJK: Merk en hoog moleculair gewicht van polylysine is cruciaal
single frosted edge slides	Fisher	48312-002	Andere merken zijn geschikt
natriumazid	Sigma	S2002-25G	TOXISCH, draag handschoenen en een masker tijdens het wegen van poeder om 10% voorraad te maken. Draag handschoenen bij het pipetten van de stockoplossing
coplin kleuringsvat	VWR	47751-792	Andere merken zijn geschikt
5-slide mailer	Electron Microscopy Science	71549-01	Een van de vele verschillende merken van kleine slidehouders, geschikt voor kleuring
Paraformaldehyde	VWR	MK262159	BELANGRIJK: Regelmatige formalineoplossingen (37% formaldehyde) zijn NIET geschikt. Ofwel 1) Los kristallijne paraformaldehyde op in fosfaatbuffer en bewaar in kleine aliquoten ingevroren. Ofwel 2) koop paraformaldehyde in electronenmicroscopie kwaliteit in aliquoten. TOXISCH - draag handschoenen; verwijder overtollig via de goot met water.
Glutaraldehyde-oplossing, 25% in water	Sigma	G 5882	BELANGRIJK: koop glutaraldehyde in electronenmicroscopie kwaliteit in ampullen; TOXISCH - draag handschoenen; verwijder overtollig via de goot met water.
Triton X-100	VWR	EM-9410	Andere merken zijn geschikt
Bovine Serum Albumine	Fisher	ICN820451	Andere merken zijn geschikt
Donkey Serum, gelyofiliseerd	Jackson Immunoresearch	017-000-121	Andere merken zijn geschikt
Cy3 Donkey anti-Muis IgG multi-labeling	Jackson Immunoresearch	715-165-150	Dit bedrijf wordt aanbevolen voor hoogwaardige multi-label (affiniteit uitgeput) antilichamen. Selecteer de juiste kleurstof en antigeen (dier gebruikt om primaire antilichamen op te wekken).
n-propylgallaat	Fisher	ICN10274750	Andere merken zijn geschikt
DAPI, 4’,6’-diamidino-2-fenylindole dihydrochloride	Sigma	D 9542	TOXISCH. Draag handschoenen en doseer in kleine aliquoten en bevries om blootstelling te minimaliseren
Whatman #1 15 cm diameter filters	Fisher	09805G
Dekglas #1 1/2 rechthoek 24 x 60 mm	VWR	48393-252	#1 1/2 dikte is optisch het beste
Microscoop slide map	VWR	48429-092	Andere merken zijn geschikt