Transsynaptische Tracing van Perifere Targets met pseudorabiësvirus Gevolgd door Cholera toxine en Gebiotinyleerde Dextran Amines Double Labeling

Samenvatting

Transsynaptisch traceren is een krachtig hulpmiddel geworden voor het analyseren van centrale efferente regulatie van perifere doelwitten via multi-synaptische circuits. Hier presenteren we een protocol dat gebruik maakt van het transsynaptische pseudorabiësvirus om een functionele hersencircuit te identificeren en lokaliseren, gevolgd door klassieke tract tracing-technieken om specifieke verbindingen in het circuit tussen geïdentificeerde groepen neuronen te valideren.

Samenvatting

Transsynaptische tracing is uitgegroeid tot een krachtig instrument dat wordt gebruikt om de centrale afferenten dat perifere doelen door middel van multi-synaptische circuits regelen analyseren. Deze benadering is het meest uitgebreid gebruikt in de hersenen door gebruikmaking van de varkens- pathogeen pseudorabies virus (PRV) ^1. PRV niet infecteert mensapen, waaronder de mens, dus wordt het meest gebruikt in studies op kleine zoogdieren, vooral knaagdieren. De pseudorabiës stam PRV152 drukt de verbeterde groen fluorescerend eiwit (eGFP) reportergen en slechts kruist functionele synapsen retrogradely door de hiërarchische volgorde van de synaptische verbindingen weg van de plaats van infectie ^2,3. Andere PRV stammen hebben verschillende microbiologische eigenschappen en kan in beide richtingen (PRV-Becker en ^PRV-Kaplan) 4,5 vervoerd worden. Dit protocol zal uitsluitend met PRV152. Door het leveren van het virus in een perifere locatie, zoals spieren, het mogelijk om de binnenkomst van het virus in t beperkenHij hersenen door middel van een specifieke set van neuronen. Het resulterende patroon van eGFP signaal over de hersenen oplost dan de neuronen die zijn verbonden met de oorspronkelijk geïnfecteerde cellen. Aangezien het gedistribueerde karakter van transsynaptische tracing met pseudorabiësvirus maakt interpreteren specifieke verbindingen binnen een geïdentificeerde netwerk moeilijk presenteren we een gevoelige en betrouwbare werkwijze gebruik gebiotinyleerd dextran amines (BDA) en choleratoxine subunit B (CTB) voor het bevestigen van de verbindingen tussen cellen geïdentificeerd met behulp PRV152. Immunochemische detectie van BDA en CTB met peroxidase en DAB (3, 3'-diaminobenzidine) werd gekozen omdat ze effectief blootleggen cellulaire processen, waaronder distale dendrieten ^6-11.

Inleiding

Transsynaptische tracing is uitgegroeid tot een krachtig instrument dat wordt gebruikt om de centrale afferenten dat perifere doelen door middel van multi-synaptische circuits regelen analyseren. Deze benadering is het meest uitgebreid gebruikt in de knaagdierhersenen door gebruikmaking van de varkens- pathogeen pseudorabies virus (PRV), vooral de verzwakte stam PRV-Bartha eerst beschreven in 1961 ^12. Hier presenteren we een protocol voor het identificeren van de motor corticale representatie van bepaalde spieren of spiergroepen met een recombinant pseudorabies virusstam (PRV152) die het versterkt groen fluorescent proteïne (eGFP) reportergen ^2. De beschreven methode maakt gebruik van het gedrag van neurotrope virussen, die infectieus nageslacht dat kruis synapsen met andere neuronen besmetten binnen een functioneel circuit ^3,4,13 produceren. PRV152, die isogeen met PRV-Bartha, maar kruist synapsen retrogradely door de hiërarchische volgorde van de synaptische verbindingen weg van de plaats van infectie ^{3,5 <}/ sup>. Door juist de perifere plaats van infectie beheersen is het mogelijk om de binnenkomst van het virus in de hersenen door middel van een specifieke subgroep van motorneuronen beperken. Omdat het virus infecteert achtereenvolgens ketens verbonden neuronen, zal het resulterende patroon van eGFP signaal over de hersenen dan het oplossen van de netwerk van neuronen die zijn aangesloten op de oorspronkelijk geïnfecteerde cellen.

Een bijkomend voordeel van het gebruik virus neurale tracing is de amplificatie van het reporter proteïne (eGFP in dit geval) in geïnfecteerde cellen. Deze signaalversterking biedt een niveau van gevoeligheid die de detectie van zelfs schaars projecties maakt. Bijvoorbeeld, een dun uitsteeksel van vibrissa motorische cortex het gezicht motorneuronen regelen van de whiskers werd gevonden in ratten middels viraal tot expressie green fluorescent protein ^14; eerdere studies niet aan deze projectie te vinden met behulp van klassieke tracers zonder reporter genamplificatie ^11,15. HelaasVeel tracing virale vectoren, zoals die gebruikt in de aangehaalde onderzoek niet synapsen kruisen, waardoor het gebruik ervan voor het opsporen multi-synaptische circuits beperken.

Terwijl de presentatie duidelijke voordelen voor het identificeren van het netwerk van cellen die deelnemen in een motorcircuit, de gedistribueerde aard van transsynaptische tracing met PRV-152 maakt het interpreteren van specifieke verbindingen binnen het circuit moeilijk. Daarom presenteren we een eenvoudige methode voor het valideren van specifieke verbindingen binnen circuits geïdentificeerd met PRV-152 door double-labeling gebruikt gebiotinyleerd dextran amines (BDA) en choleratoxine subunit B (CTB). Het gecombineerde gebruik van BDA en CTB is een gevestigde aanpak voor het opsporen van verbanden tussen specifieke sets van neuronen ^6-8,11. Wanneer samen gebruikt worden, kunnen deze twee tracers worden gevisualiseerd in dezelfde sectie in twee kleuren DAB (3, 3'-diaminobenzidine) ¹⁶ procedure. Hoog molecuulgewicht BDA (BDA10kDa) werd gekozen voor dit protocol omdat yields gedetailleerde etikettering van neuronale processen ^6,7,9. Bijkomende voordelen van BDA10kDa zijn de volgende: het is bij voorkeur in de richting anterograde ^6-8 vervoerd; Het kan worden geleverd door iontoforetische of druk injectie ^6-8; kan worden gevisualiseerd door een eenvoudige avidine-gebiotinyleerde HRP (ABC) procedure ^17; en kan worden afgebeeld door licht- of elektronenmicroscopie ^6,7,18. Immunochemische detectie van CTB met peroxidase en DAB werd gekozen retrograde labeling van motoneuronen omdat het effectief is bij het ​​openbaren cellulaire processen, waaronder distale dendrieten ^10,19. We hebben onlangs gebruikt deze benadering van de vocale motor route bij muizen te identificeren en een dunne aansluiting van de primaire motorische cortex aan de larynx motorische neuronen, die eerder werd aangenomen afwezig ²⁰ te onthullen.

Protocol

OPMERKING: Alle dierlijke procedures zijn beoordeeld en door de Duke University Institutional Animal Care en gebruik Comite goedgekeurd.

1. opslaan pseudorabiësvirus

1. We krijgen levend virus (PRV152) uit het laboratorium van Dr. Lynn Enquist aan Princeton University met een titer van 1 x 10 ⁹ pfu / m. Het protocol om het virus te genereren is gepubliceerd ^2.
2. Aliquot het virus bij 20 pi per buis in een BSL-2 bioveiligheid kast en bewaar bij -80 ° C onder de juiste omstandigheden bioveiligheid.
3. Dooi een hoeveelheid van PRV onmiddellijk alvorens te injecteren.

2. Chirurgische Voorbereiding voor injecties in de spier

1. Induceren algemene anesthesie door intramusculaire injectie van ketamine-xylazine (100 mg / kg ketamine, 10 mg / kg xylazine) en een geschikt verdovingsmiddel vlak houden via isofluorane.
2. Bescherm de hoornvliezen van een oftalmische zalf.
3. Bereid thij chirurgische plaats volgens de aseptische techniek door trimmen haren en ontsmetten van de chirurgische site met afwisselende scrubs van Betadine en 70% alcohol (minimaal 3 cycli). Zorg ervoor dat steriele doeken gebruiken om chirurgische gebieden te dekken. Zorg ervoor om zich te houden aan steriele technieken gedurende de procedures.
4. Maak een huidincisie en onthullen de spieren van belang. Bijvoorbeeld, om de cricothyroideus larynx spier moet eerst het bovenliggende gedeelte van de sternohyoid spier te verwijderen.
5. Verzegelen elke doorsneden spieren Vetbond weefsel lijm.

3. Injectie van PRV in Spier

1. Laad de 10 ul injectiespuit Nanofil systeem met vers ontdooide PRV oplossing, voeg een 34 G roestvrijstalen naald, en zorgvuldig monteren op de stereotaxische apparaat.
2. Langzaam duidelijk de dode ruimte en controleer of de oplossing verlaat het micro-tip. Gooi vloeistof als bioharzard afval.
3. Met een stereotaxische microfositioning apparaat zorgvuldig plaats de micro-tip in de spier van de rente en langzaam vult de spier tot lichte zwelling zichtbaar is. De injectiesnelheid zal variëren afhankelijk van de grootte van de spier en volume te injecteren. Zo moet vijf injecties met 200 nl (1 pl totaal) met een snelheid van 4 nl / sec 1 min uit elkaar worden gemaakt op dezelfde plaats op de cricothyroideus spier vullen. Verplaats de spuit naar de volgende spieren plaats (de laterale cricoarytenoid in dit geval) en herhaal de injectieprocedure. Slechts doorboren eenmaal elke spier.
4. Trek de micro na vijf minuten.
5. Verzegeling van de breuk in de fascia met Vetbond weefsel lijm.
6. Nadat alle injecties zijn voltooid, sluit de wond met behulp Vetbond weefsel lijm. Afhankelijk van uw lokale instellingsgeneeskunde richtlijnen het gebruik van dieren, hechtingen of wond clips kunnen worden gebruikt.
7. Bewaak het dier tot borstligging en zorgen voor pijnstilling, voedsel, water, en de zorg die nodig zijn door yonze institutionele richtlijnen het gebruik van dieren.
8. Na de experimenteel bepaalde overlevingstijd (in dit geval 90 hr labelen ^2e orde corticale neuronen), offer het dier door een overdosis pentobarbital en perfuseren transcardially met 0,9% zoutoplossing, gevolgd door 4% formaldehyde in 0,1 M PBS.
9. Verwijder na bevestig de hersenen in 4% formaldehyde gedurende 24 uur.
10. Cryoprotect de hersenen in fosfaatbuffer bevattende 30% sucrose gedurende tenminste 48 uur.

4. Immunochemische Detectie van eGFP

1. Snijd secties 40 urn op een glijdende microtoom en sla drijvende secties in 0,1 M PBS. Dunnere, bijvoorbeeld 30 urn, kan worden gebruikt bij het kleuren gemonteerde profielen.
2. Quench secties 30 min in 0,3% H ₂ O ₂ in PBS beschermd tegen licht.
3. Blokkeer niet-specifieke antigenen in de secties 30 min in PBS met 0,3% Tween 20 bij normale geit serum van de Vectastain Elite kit (VE kit).
4. Incubate geblokkeerd secties voor 3,5 uur bij konijnen anti-eGFP (1: 1000) bij kamertemperatuur.
5. Was secties driemaal in PBS gedurende 5 min, daarna incubeer ze gedurende 1 uur bij geiten anti-konijn secundair antilichaam uit de VE set bij kamertemperatuur.
6. Bereid de ABC-oplossing uit de VE kit volgens instructies van de fabrikant.
7. Was secties driemaal in PBS gedurende 5 min, dan reageren ze 1 uur in ABC oplossing uit de kit VE bij KT.
8. Was secties driemaal in fosfaatbuffer gedurende 10 min, en ontwikkelen van 8 min in fosfaatbuffer, pH 7,4, bevattende 0,05% DAB (3, 3'-diaminobenzidine) en 0,015% H ₂ O _2.
9. Mount secties in SuperFrost Plus objectglaasjes en dehydrateren ze via een gegradeerde reeks alcohol (70%, 95%, 100% en 100% gedurende 5 min elk).
10. Duidelijk de secties via twee xyleen wast (5 min elk) en dekglaasje de dia's met Permount montage medium.
11. Afbeelding de gemonteerde secties op een microscoop. De DAB reactieproduct inside de cellen moeten bruine verschijnen. Gedigitaliseerde beelden kunnen kleuren omgekeerd om fijne processen markeren.

5. Chirurgische Voorbereiding voor Injectie van Tracers in hersengebieden Ontdekt door PRV Tracing

1. Induceren algemene anesthesie door intramusculaire injectie van ketamine-xylazine (100 mg / kg ketamine, 10 mg / kg xylazine) en een geschikt verdovingsmiddel vlak houden via isofluorane.
2. Bescherm de hoornvliezen van een oftalmische zalf.
3. Zet de kop in een passende stereotaxisch frame.
4. Bereid de chirurgische plaats volgens de aseptische techniek door trimmen haren en ontsmetten van de site met afwisselende scrubs van Betadine en 70% alcohol (minimaal 3 cycli).
5. Maak een hoofdhuid incisie en trekken de huid over de hersenen regio van belang.
6. Voer een kleine craniotomie op het juiste stereotaxische coördinaten. Bijvoorbeeld, de coördinaten laryngeally verbonden motorische cortex die door PRV traceren in eenn volwassen muis zijn 1,2 mm lateraal en 0,2 mm rostraal Bregma.

6. Injectie van Gebiotinyleerde Dextraan Amines in Brain

1. Bereid 7,5% gebiotinyleerd dextran amines (BDA) door het oplossen van 25 mg BDA (MW 10.000) in 333 pl steriele zoutoplossing.
2. Laad de Nanoject II micropipet met voldoende BDA oplossing voor de geplande injecties.
3. Langzaam duidelijk de dode ruimte en controleer of de oplossing is het verlaten van de micropipet tip.
4. Met behulp van een stereotaxische micropositionering apparaat zorgvuldig verlagen van de micropipet tip in de hersenen regio van belang en langzaam te injecteren BDA. Pas de injectiesnelheid afhankelijk van de grootte van het gebied te worden aangebracht. Zo dient 12 injecties van 4,6 nl made zijn op vier verschillende plaatsen 0,2 mm van elkaar (rostro-caudaal) aan de laryngeally verbonden motorische cortex bij volwassen muizen dekken. Het uiteindelijke injectievolume worden aangepast aan de grootte van het hersengebied plaats, Rekening houdend met dat label uit de injectie kern door diffusie door hersenweefsel en langs de processen van gelabelde neuronen kunnen verspreiden.
5. Dicht de craniotomie met tandheelkundige cement, en sluit de hoofdhuid wond met behulp Vetbond weefsel lijm.
6. Bewaak het dier tot borstligging en zorgen voor pijnstilling, voedsel, water, en de zorg die nodig zijn door de institutionele richtlijnen het gebruik van dieren.

7. Injectie van Cholera toxinesubeenheid b in Spier

1. Bereid 1% choleratoxine subunit B (CTB) door het oplossen van 1 mg van CTB in 100 ul steriele zoutoplossing.
2. Zes dagen na BDA injectie in de hersenen, voeren de chirurgische preparaat zoals hierboven beschreven voor PRV injectie in een spier.
3. Laad de 10 ul injectiespuit Nanofil systeem met CTB-oplossing, voeg een 34 G roestvrijstalen naald, en zorgvuldig monteren op de stereotaxische apparaat.
4. Voer de micro-injecties in de spier (s) van belang, zoals eerder debeschreven voor PRV.
5. Bewaak het dier tot borstligging en zorgen voor pijnstilling, voedsel, water, en de zorg die nodig zijn door de institutionele richtlijnen het gebruik van dieren.
6. Drie dagen na de injectie CTB, offeren het dier door een overdosis pentobarbital en perfuseren transcardiaal met 0,9% zoutoplossing, gevolgd door 4% formaldehyde in 0,1 M PBS.
7. Verwijder na bevestig de hersenen in 4% formaldehyde gedurende 24 uur.
8. Cryoprotect de hersenen in fosfaatbuffer bevattende 30% sucrose gedurende tenminste 48 uur.

8. Detectie van BDA en CTB in dezelfde secties

1. Snijd secties 40 urn op een microtoom en sla drijvende secties in 0,1 M PBS.
2. Quench secties 30 min in 0,3% H ₂ O ₂ in PBS beschermd tegen licht.
3. Bereid de ABC-oplossing uit de VE kit volgens instructies van de fabrikant.
4. Was secties driemaal in PBS gedurende 5 min, dan reageren ze 1 uur in ABC oplossing bij kamertemperatuur.
5. Was secties driemaal in fosfaatbuffer gedurende 10 min, en ontwikkelen van 8 min in fosfaatbuffer, pH 7,4, bevattende 0,05% DAB (3, 3'-diaminobenzidine), 0,015% H ₂ O ₂ en 0,05% nikkelchloride. De DAB reactie product in de cellen moeten zwart verschijnen.
6. Blokdelen gedurende 30 minuten in PBS met 0,3% Tween 20 met normaal konijnenserum van de Vectastain Elite Kit.
7. Incubate geblokkeerd secties voor 2 uur bij geiten anti-CTB (1: 10.000) bij kamertemperatuur.
8. Was secties driemaal in PBS gedurende 5 min, daarna incubeer ze gedurende 1 uur bij konijnen anti-geit secundair antilichaam uit de VE set bij kamertemperatuur.
9. Bereid de ABC-oplossing uit de VE kit volgens instructies van de fabrikant.
10. Was secties driemaal in PBS gedurende 5 min, dan reageren ze gedurende 30 min in ABC oplossing bij kamertemperatuur.
11. Was secties driemaal in fosfaatbuffer gedurende 10 min, en ontwikkelen tot 8 min in fosfaatbuffer, pH 7,4, bevattende 0,05% DAB (3, 3'-diaminobenzidine) en 0,015% H ₂ O _2. De DAB reactie product in de cellen moeten bruine verschijnen.
12. Mount secties in SuperFrost Plus objectglaasjes en dehydrateren ze via een gegradeerde reeks alcohol (70%, 95%, 100% en 100% gedurende 5 min elk).
13. Duidelijk de secties via twee xyleen wast (5 min elk) en dekglaasje de dia's met Permount montage medium.
14. Afbeelding de gemonteerde secties op een microscoop.

Resultaten

Kleuring voor eGFP moet beginnen tonen zwak signaal in primaire motorische neuronen ongeveer 72 uur na het injecteren PRV152 in de spier. De replicatie en transsynaptische transport van het virus zijn titer- en tijdsafhankelijke ^4. Ongeveer 90 uur na de injectie zal eGFP vlekken sterk signaal in ² e orde geïnfecteerde cellen te onthullen. Langere overleving tijden zullen ³ e en hogere orde cellen onthullen maar overleving tijden worden beperkt door de dodelijkheid van PRV op ongeveer 5 d...

Discussie

Er zijn een aantal zaken die in overweging moeten worden genomen bij de planning van een experiment met PRV152 ^4,21. Belangrijker, pseudorabiësvirus is dodelijk. Zoals eerder vermeld, mensapen, waaronder mensen zijn niet gevoelig voor infectie, maar juiste zorg moet worden uitgeoefend om andere dieren te beschermen. Volwassen muizen overleven doorgaans 5-7 dagen na inoculatie met de verzwakte stam PRV152. Daarom PRV152 niet geschikt voor experimenten die overleving langer dan één week nodig. Bovendien besmett...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Naam van reagens/materiaal	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
NanoFil Micro-injectiesysteem	World Precision Instruments	IO-Kit	34 G optie
Stereotaxische frame	David Kopf Instruments	Model 900
Nanoject II Auto-Nanoliter Injector	Drummond Scientific Company	3-000-204
Schuifmicrotoom	Leica	SM2010 R
[header]
VetBond	3M	1469SB
Isofluran (Forane)	Baxter	1001936060
Betadine Swab Stick	Cardinal Health	2130-01	200 tellen
Permount Montage Medium	Fisher Scientific	SP15-500
SuperFrost Plus dia's	Fisher Scientific	12-550-15
Biotinyleerdextran aminen	Invitrogen	D-1956	10.000 MW
Pseudorabies virus	Laboratorium van Dr. Lynn Enquist (Princeton University)	PRV152	Titel >1 x 107
Anti-Cholera Toxin B Subunit (Geit)	List Biological Laboratories	703
Cholera Toxin B Subunit	List Biological Laboratories	103B
Anti-eGFP	Open Biosystems	ABS4528
3, 3'-diaminobenzidine	Sigma-Aldrich	D5905	10 mg tabletten
Ethanol	Sigma-Aldrich	E7023	200 bewijs
Formaldehyde	Sigma-Aldrich	F8775	Verdun tot 4%
Waterstofperoxide	Sigma-Aldrich	H3410	30%
Ketamine HCl & Xylazine HCl	Sigma-Aldrich	K4138	80 mg/ml & 6 mg/ml
Nikkelchloride	Sigma-Aldrich	339350
Fosfaatbuffer	Sigma-Aldrich	P3619	1,0 M; pH 7,4
Fosfaat gebufferd zoutoplossing	Sigma-Aldrich	P5493	10x; pH 7,4
Natrium Pentobarbital	Sigma-Aldrich	P3761	50 mg/ml dosis
Sucrose	Sigma-Aldrich	S9378
Tween 20	Sigma-Aldrich	P1379
Xyleen	Sigma-Aldrich	534056	Histologisch graad
VECTASTAIN Elite ABC Kit	Vector Laboratories	PK-6101 (konijn); PK-6105 (geit)
Optixcare oogzalf	Vet Depot	1017992