Infinium Assay voor grootschalige SNP genotypering Toepassingen

Samenvatting

Een protocol wordt beschreven dat Illumina Infinium assays gebruikt om grootschalige genotypering uitgevoerd. Deze testen betrouwbaar kan genotype miljoenen SNPs over honderden individuele DNA-monsters in drie dagen. Eenmaal gegenereerd, kunnen deze genotypes worden gebruikt om te controleren associaties met verschillende ziekten of fenotypes.

Samenvatting

Genotypering varianten in het menselijk genoom blijkt een efficiënte methode om genetische associaties identificeren fenotypes zijn. De verdeling van de varianten in families of populaties kan identificatie van het genetische factoren van ziekten vergemakkelijken. Panel Illumina van genotypering BeadChips kunnen onderzoekers duizenden of miljoenen single nucleotide polymorfismen (SNP's) genotype of andere genomische varianten, zoals het aantal kopieën, over een groot aantal DNA-monsters te analyseren. Deze SNPs kunnen worden verspreid over het genoom of gerichte in specifieke regio om mogelijke ontdekking maximaliseren. De Infinium test is geoptimaliseerd voor hoge kwaliteit, nauwkeurige resultaten snel opleveren. Bij juiste instelling kan een enkele technicus verwerken van enkele honderden tot meer dan duizend DNA monsters per week, afhankelijk van het type array. Deze test helpt gebruikers bij elke stap, vanaf genomisch DNA en eindigend met het scannen van de matrix. Met behulp van fatsoen Reagegen worden monsters versterkt, gefragmenteerd, neergeslagen, opnieuw gesuspendeerd, gehybridiseerd met de chip, verlengd met een enkele base, gekleurd, en gescand op ofwel een iScan of Hi Scan hoge-resolutie optische imaging systeem. Een overnight stap is nodig om het DNA te amplificeren. Het DNA wordt gedenatureerd en isotherm geamplificeerd door geheel-genoom amplificatie, daarom is er geen PCR vereist. Monsters worden gehybridiseerd met de arrays in een tweede stap nachts. Op de derde dag, de monsters zijn klaar om te worden gescand en geanalyseerd. Geamplificeerde DNA kan worden opgeslagen in grote hoeveelheden, waardoor korrelarrays elke dag van de week te verwerken, daarbij maximaal debiet.

Inleiding

Het typen van single nucleotide polymorfismen (SNP's) is een belangrijke methode voor het identificeren risico varianten geassocieerd met de ziekte. Historisch gezien is de reikwijdte van de genotypering experimenten beperkt door de beschikbare technologie. Gel elektroforese gebaseerde genotyperingsmethoden zijn beperkt in monster-en SNP-throughput ^[1]. Het ontwikkelen van deze testen kunnen vaak arbeidsintensief zijn, een beroep op de make-up en de structuur van de regio rond de variant voor de optimalisatie ^[1]. TaqMan genotypering assays ontwikkeld door Life Technologies, kan een groot aantal monsters snel en met minimale technicus betrokkenheid werking [2], maar SNP multiplexen beperkingen blijft het totale aantal genotypen beperken tot ruim onder de een miljoen per dag ^{[3,4 ].} Sequenom Iplex platform kan ook draaien vele monsters in een keer, maar, aangezien minder dan honderd SNPs samen kunnen worden multiplexed, throughput is relatief lage algemene ^[5]. Beckman Coulter's SNP stroom technologietheoretisch produceren meer dan 3.000.000 genotypen per dag, maar dit technologische grenzen project bereik slechts maximaal achtenveertig SNPs per reactie ^[4,6]. Terwijl de GoldenGate assay bijna tweehonderd DNA-monsters per dag kan verwerken op honderden of duizenden SNPs per monster, de prijs per genotype is niet concurrerend met geavanceerde, ultra-high-throughput technieken bij het ​​typen meer dan drieduizend SNPs tegelijk ^{[4,7 ].} Om enkele miljoenen genotypes per dag verwerken, de schaal die nodig is voor grote genoom-brede associatie studies, array-hybridisatietesten zijn geworden van de meest kosteneffectieve optie op de markt.

Affymetrix's lijn van hybridisatie arrays en Illumina's lijn van Infinium-gebaseerde arrays staan ​​mogelijk honderden samples op honderdduizenden of miljoenen SNPs worden ingetypt in parallel ^[4,8]. Deze SNP's kunnen worden verspreid over het hele genoom, gelokaliseerd in de regio's van belang, zoals exOMES, of aangepast aan de voorkeur van de gebruiker. Deze arrays hebben het voordeel niet alleen in staat om nauwkeurig genotype een miljoen SNPs per monster tegelijk, maar ook copy number variation meten mogelijk onthulling chromosomale abnormaliteiten. Infinium uitgelijnd OMNI BeadChip arrays hebben momenteel de mogelijkheid om elke dag genotype tot bijna vijf miljoen markers per monster, met inbegrip van een half miljoen aangepaste loci, op tot bijna honderd monsters.

Aangezien de meeste ziekten hebben een genetische component, kunnen deze grootschalige experimenten cruciaal bij het vinden genen geassocieerd met ziekte. High-throughput genotypering zorgt voor een efficiënte genotype generatie steekproef zet groot genoeg is om overtuigend te sporen genetische associatie bij lagere minor allel frequenties. Hele genoom genotypering projecten kan worden gebruikt om gebieden te lokaliseren met statistisch significante case-control allel frequentie of aantal kopieën verschillen ^[9,10,11]. Volgens de National Human Genome Research Institute, genoom-brede associatie studies hebben geleid tot 1.490 afzonderlijke publicaties tussen 25 november 2008 en 25 januari 2013, als gevolg van de ontdekking van 8283 SNPs met een p-waarde van minder dan 1 x 10 ^-5 (zie http:// www.genome.gov/gwastudies/). Deze studies, die aandoeningen, variërend van hoogte naar teelbalkanker, profiteerde van de brede benadering wordt geboden door een genoom-brede analyse onderzocht. In gevallen zoals deze, kunnen hele regio's van belang aandacht ontsnapten was de reikwijdte van het typen te beperkend geweest. Aldus voor grootschalige associatietesten, een genoom-brede genotypering techniek is de techniek van keuze.

Verschillende versies van de Infinium test bestaat, elk bestemd voor gebruik met bepaalde typen arrays. De InfiniumUltra assay, besproken in de diepte beneden, is geschikt voor vele 12 - of 24-monsterarray chips. Deze vaak genotype meer dan honderdduizend SNPs per DNA-monster en de focus op targeted regio's, zoals op exome of aangepaste panelen. Andere assay versies kunnen worden tot andere soorten chips, zoals de hele genoom genotypering arrays. Echter, zoals alle Infinium assays delen een gemeenschappelijke basis en vooral verschillen alleen door het reagens namen, het reagens volumes, of de exacte kleuring reagens procedure, technieken geperfectioneerd aan een test versie kan vaak worden universeel toegepast. Andere arrays, zoals methylatie arrays, kan een nagenoeg identieke protocol, ook. Zorg moet worden genomen om alleen de versie van de test voor het soort chip gebruikt. Sommige soorten, zoals degenen meten van genexpressie niveau, zou het gebruik van een nonInfinium protocol nodig.

De monsters moeten worden verwerkt in batches. Bijvoorbeeld, de InfiniumUltra test prehybridisatie reageerbuizen bevatten voldoende volume 96 monsters uitgevoerd en de buizen niet worden ingevroren. Derhalve moeten monsters worden uitgevoerd in partijen van 96 monsters tegelijk. De monsters worden versterkt op de sparrent dag. Na ongeveer 1 uur van benchwork moeten de monsters in een convectieoven gedurende 20-24 uur verwarmd. De volgende dag, ongeveer 4 uur worden besteed fragmenteren, neerslaan, en resuspenderen van de monsters, waarna de monsters kunnen ofwel worden ingevroren voor toekomstig gebruik of gehybridiseerd met de chip. Laden chips duurt bijna 2 uur, waarna de monsters worden 's nachts gehybridiseerd gedurende 16-24 uur. Op de derde dag, de kleuring en uitbreiding stap duurt ongeveer 4 uur. Een verdere uur wordt besteed wassen, coaten en drogen van de chips. Tenslotte worden de arrays gescand, waarbij rekening kan 15-60 min / chip, afhankelijk van het gebruikte type.

Standaard laboratorium veiligheid en netheid voorzorgsmaatregelen toe te passen. Hoewel de amplificatie niet op PCR gebaseerde, afzonderlijke werkstations voor pre-en postamplification procedures nodig zijn om kans op besmetting te minimaliseren. Het identificatienummer van elk-kit geleverd reagens in gebruik moet aangemeld zijn een tracking vel. Reagegen moet worden vlak voor gebruik een paar keer voorafgaand aan de uitgifte ontdooid en omgekeerd. Het DNA worden ingetypt moeten hoogwaardige genomische DNA (260/280 absorptie verhouding van 1,6-2,0, 260/230 absorptie ratio onder 3.0), geïsoleerd door middel van standaard methoden en gekwantificeerd met een fluorometer zijn. Afbraak van DNA vaak een bijdragende factor in lage kwaliteit testresultaten. Doorgaans wordt 200 ng DNA nodig, maar dit bedrag kan variëren voor bepaalde soorten chip. Een Tecan-liquid handling robot kan vele stappen van het protocol te automatiseren en het minimaliseren van menselijke fouten als een factor.

Protocol

Day One

1. Voorbereiding

1. Doseer 200 ng van DNA in een diepe put, 96-sample plaat. Ten minste 96 monsters (volledige platen) worden uitgeplaat om te verzekeren geen reagens wordt verspild. Label de plaat met een door de kit barcode sticker en centrifuge het.
2. Om het volume normaliseren, laat de monsters in een lade of zuurkast gedurende de nacht de vloeistof verdampen. Bedek de plaat losjes af met een deksel of een papieren handdoek om stof buiten te houden.

2. Amplification

WAARSCHUWING: monsters moeten ondergaan versterking tenzij 4 uur beschikbaar zal zijn op de volgende dag voor de fragmentatie, neerslag, en resuspensie stappen.

1. Verwijder de box-bedrijf geleverde of pak van buizen label "Pre" van de -20 ° C vriezer (een tube van MA1, MA2, en MSM is voldoende voor elke set van 96 monsters). Set buizen van MA2 en MSM op de bank te ontdooien. Zet goed gekalibreerdoven ingesteld op 37 ° C.
2. Met behulp van een reagens bekken en een 10 ul, 8-kanaals pipet, afzien 4 pi DNA hersuspensiebuffer in elk putje om de monsters te rehydrateren. Het is niet noodzakelijk pipetpunten tussen elke kolom weggooien als zorg wordt besteed niet aanraakt vloeistof.
3. Met een 8-kanaals pipet, afzien 20 ul van MA1 in elk putje van de plaat. Voor elke nieuwe reagens, gebruik dan een vers oplosmiddel bassin. Bedek de plaat met een herbruikbare verbinding, puls-centrifuge en vortex gedurende 1 min bij 1600 rpm op een microplaat schudinrichting.
4. 2.4) Incubeer bij kamertemperatuur gedurende ten minste 30 minuten.
5. Doseer 4 pl 0,1 N NaOH aan elk putje van de plaat. Bedek de plaat met de herbruikbare zegel, pols-centrifuge, en vortex gedurende 1 minuut bij 1600 rpm.
6. Incubeer bij kamertemperatuur gedurende 10 minuten.
7. Doseer 34 ul van MA2 in elk putje van de plaat.
8. Doseer 38 ul van MSM in elk putje van de plaat. Bedek de plaat met deherbruikbare zegel, puls-centrifuge, en vortex gedurende 1 minuut bij 1600 rpm.
9. Plaats in de oven gedurende 20-24 uur.

Day Two

3. Fragmentatie

1. Verwijder FMS buizen uit de "Post-1" -20 ° C box (een tube is voldoende voor elke set van 96 monsters). Ontdooien op de bank of in een kamer-temperatuur waterbad. Na het inbrengen van de MIDI-plaat inzetstuk in een tafelblad microproefcel incubatiesysteem, zet het vuur blok en ingesteld op 37 ° C.
2. Zodra buizen worden ontdooid, verwijderen monster plaat uit de oven en pulse-centrifuge. Pipetteer 25 ul van FMS in elk putje van de plaat DNA. Plaats het deksel, pols-centrifuge, en vortex op 1.600 rpm gedurende 1 minuut.
3. Incubeer plaat in warmteblok gedurende 1 uur.

4. Neerslag

1. Verwijder PM1 tube van "Post-3" 4 ° C doos of pak en opwarmen tot kamertemperatuur (een tube is voldoende voor elke set van 96 monsters). Verwijder de plaat van het vuur block en pulse-centrifuge.
2. Pipetteer 50 ul van PM1 in elk putje van de plaat. Plaats het deksel, pols-centrifuge, en vortex op 1.600 rpm gedurende 1 minuut.
3. Incubeer plaat in warmteblok gedurende 5 minuten.
4. Verwijder de plaat uit hitte blok, zet het uit, en de plaat deksel verwijderen. Pipetteer 155 ul 100% isopropanol in elk putje van de plaat. Dek goed af met een nieuw deksel en handmatig draai de plaat meerdere keren te mengen.
5. Plaats plaat 4 ° C gedurende ten minste 30 minuten. Schakel gekoelde centrifuge en ingesteld tot 4 ° C afkoelen.
6. Balans de plaat en centrifugeer bij 4 ° C gedurende 20 min bij 3000 x g.
7. Inspecteer de onderkant van de plaat zonder omkeren deze en bevestigt de monsters worden neergeslagen in een blauwe pellet. Indien geen korrels meer zichtbaar, centrifuge. Krijgen papieren handdoeken.
8. Gooi het deksel en snel te verwijderen van de vloeistof door het omkeren van de plaat en krachtig te tikken op de stationaire bedekt met papieren handdoeken. Zodra de plaat is inverted, let er dan op het terugkeren, terwijl een vloeistof blijft. Tik herhaaldelijk op de plaat tegen de stationaire totdat alle vloeistof wordt verwijderd.
9. Plaats de plaat op een reageerbuis rek, omgekeerd, te drogen. Incubeer bij kamertemperatuur gedurende 1 uur.

5. Resuspensie

1. Verwijder RA1 van "Post-2" -20 ° C doos en dooi in water op kamertemperatuur bad. Zet de oven aan en stel deze in op 48 ° C.
2. Eenmaal ontdooid, afzien 23 ul van RA1 aan elk putje van de monsterplaat. Laat de hele fles van RA1 niet giet het in het bekken; bespaart 30 ml voor later. Als de monsters zullen worden gehybridiseerd op de arrays later die dag, plaatst de RA1 in een 4 ° C koeler. Als de monsters op een later tijdstip zal worden uitgevoerd, het etiket van de fles en opnieuw invriezen de RA1.
3. Warmte-zegel een nieuw deksel op de plaat. Pulse-centrifuge de plaat en plaats het in de oven gedurende 1 uur.
4. Neem de plaat uit de oven en vortex bij 1.800 rpm gedurende 1 minuut.
   De monsters kunnen veilig h bedrageneld in dit stadium voor maximaal een week. Platen kunnen worden opgeslagen, en de monsters kunnen worden gereorganiseerd voor te bereiden op de kraal chip toepassing, indien nodig. Als u doorgaat met de procedure, laat de plaat bij kamertemperatuur en zet het vuur blok. Anders, bewaar de plaat bij -20 ° C.

6. Hybridisatie

WAARSCHUWING: Monsters mogen niet hybridisatie ondergaan tenzij 5,5 uur zijn beschikbaar op de volgende dag voor de kleuring en wassen stappen.

1. Zet het vuur blok en stel deze in op 95 ° C. Zet de oven aan en stel deze in op 48 ° C.
2. Zodra de temperatuur is gestabiliseerd, incubeer de plaat op het vuur blok gedurende 20 minuten.
3. Terwijl de plaat wordt denatureren, verwijdert u de doos van de kraal chips van 4 ° C en zet het op de bank. Pak een flesje XC4 (van kamer-temperatuur kit) en voeg 330 ml 100% ethanol. Schud het goed en incubeer bij kamertemperatuur gedurende de nacht. Bereid formamide / EDTA mix (95% formamide, 0,2%EDTA (0,5 M), 4,8% H ₂ O in volume) en vries in stappen aparte 15 ml. Overmaat formamide worden opgeslagen.
4. Verwijder het monster plaat uit de hitte blok. Incubeer bij kamertemperatuur gedurende 30 minuten.
5. Terwijl de plaat afkoelen, bereiden de hyb kamer. Een kamer nodig zullen zijn voor elke vier kraal chips verwerkt.
   Plaats een rubberen mat op de bovenkant van de hyb onderplaat, uitlijnen van de dikkere gat met de voorkant van de basis. De barcode symbool geëtst in de bodem moet nog steeds zichtbaar (zie figuur 2).
6. Met behulp van een 1000 ui pipet, afzien 400 ul van PB2 in elk van de acht bevochtigen reservoirs gesneden in de basis. PB2 is te vinden in "Post-3" doos of verpakking. Plaats de hyb kamer deksel op de basis en gesp beide uiteinden door het sluiten van twee gespen op diagonaal tegenover elkaar als eerste.
7. Verwijder de afzonderlijke verpakkingen zilveren kraal chips van de respectievelijke vakken, maar om de expo chips minimaliserenervoor dat lucht en licht, nog niet te openen. Scan zorgvuldig de barcodes van de chips en noteer de volgorde waarin ze op een tracking blad zal worden geladen, samen met de doos id waar ze vandaan kwamen. Een goed begrip van waar elk individueel DNA-staal wordt afgegeven op de korrel chips nodig.
8. Verwijder de afzonderlijke verpakkingen zilveren kraal chips van de respectievelijke vakken, maar om de blootstelling van de chips om lucht en licht te minimaliseren, nog niet te openen. Scan zorgvuldig de barcodes van de chips en noteer de volgorde waarin ze op een tracking blad zal worden geladen, samen met de doos id waar ze vandaan kwamen. Een goed begrip van waar elk individueel DNA-staal wordt afgegeven op de korrel chips nodig.
9. Net voor de 30 min afkoelen is voltooid, opent de zilveren kraal chip packs. Haal de chips uit hun doorzichtige plastic kokers. Zonder het aanraken van de kralen, plaatst elke kraal chip op een hyb kamer inzetstuk, het oriënteren van de chipbarcode met de barcode symbool geëtst in de insert top oppervlak.
10. Pellen en het deksel van het monster plaat verwijderen. Neem 15 pi monster van de monsterplaat en langzaam afzien van de inlaat naar de matrix (zie figuur 3). Buitengewone zorg moet worden genomen om de juiste monster op de juiste kraal chip in de juiste positie, passend bij de hiel chip volgorde eerder. Een multichannel pipet kan worden gebruikt om vloeistof afgeven op de chips, maar voorzorg worden genomen om alleen het aantal monsters dat op de korrel chip veilig kan worden geplaatst, zuig het aantal rijen op een plaat niet altijd overeen met het aantal rijen op een chip.
11. Eens in de steekproef heeft op de bijbehorende matrix geplaatst visueel op de chip voor bellen of regio's niet gecoat in vloeistof. Als deze problemen bestaan, schud de insert. Indien nodig kunnen meer vloeistof worden toegevoegd array. Zorg ervoor dat de juiste DNA-monster toe te voegen.
12. Open de hyb kamer eenD Plaats de inserts over de bevochtiging reservoirs. De barcode van de chip moet over de barcode geëtst in de hyb kamer voetstuk worden geplaatst. Vervang de hyb afdekklepje en sluit alle vier klemmetjes door het sluiten van de haakjes op diagonaal tegenover elkaar als eerste.
13. Incubeer de hyb kamer in de oven gedurende 16-24 uur. Let op dat de kamers niet te kantelen wanneer ze in beweging.
14. Als meer dan een plaat moet worden verwerkt, terug naar stap 6.2. Verwerking van meer dan 24 kraal chips in een dag wordt afgeraden om zowel het minimaliseren van de kans op menselijke fouten bij het hanteren van een grote hoeveelheid van verbruiksgoederen of chips en de hoeveelheid tijd die nodig is om de chips te verwerken in toekomstige stappen te minimaliseren, zoals zorg moet worden ondernomen om de blootstelling aan lucht zoveel mogelijk te beperken. Een fles XC4 is voldoende voor maximaal 24 kraal chips.

Dag Drie

7. Kleuring Voorbereiding

1. Verwijder de hyb kamers uit de oven en incubeer bij kamertemperatuur temperature voor 25 min. Als het verwerken van meer dan twee hyb kamers, waggelen hun dubbele verwijdering elke 10 minuten. Om de chips uitdrogen, maar niet de hyb kamers kan openen.
2. Terwijl de hyb kamers zijn koeling, verwijderen tubes XC1, XC2, TEM, STM en een geldautomaat van de "Post-1" -20 ° C en stel op de bank te ontdooien. Pak een flesje RA1 van de "Post-2" box bij -20 ° C (of 4 ° C als het hergebruik van de reagens van de vorige dag) en dooi in een kamer temperatuur waterbad. Ontdooi een buis van 95% formamide ook. Tot 8 kraal chips verwerkt, twee buizen van elk reagens 10 ml RA1, 15 ml formamide en 150 ml XC3 (in een kamer-temperatuur-bedrijf leverde box) nodig.
3. Voor elke chip verwerkt, wordt een glasplaatje, een plastic doorstroom brace, twee metalen klemmen, en een plastic spacer nodig. Voor de plastic spacer, gebruik dan alleen de duidelijke een, scheiden en gooi de ondoorzichtige spacer. Bovendien zijn er twee kralen chip wassen gerechten eneen kraal chip tray nodig zal zijn, samen met een vloeistof verzamelplaats en een plastic montage bar.
4. Reinig de glazen plaatjes door te besproeien ze met ethanol en vegen ze droog.
5. Zet de hete waterbad dat is verbonden aan de doorstroming kamer rack en stel deze in op 44 ° C. Schud de kamer rek om eventuele luchtbellen te verwijderen.
6. Wanneer de hyb kamer is afgekoeld gedurende 25 min, vul een wassen schotel met PB1 (ongeveer 200 ml). PB1 is te vinden in de "Post-4" kamertemperatuur doos.
7. Open een hyb kamer. Verwijder het deksel afdichting van een kraal chip door het grijpen van de afdichting in een hoek en voorzichtig schillen diagonaal (zie figuur 4). Zodra het zegel wordt verwijderd, onmiddellijk plaats de chip in een kraal chip tray en dompel in PB1 zonder het aanraken van de kralen. Herhaal dit totdat de lade is gevuld met kraal chips, het verzorgen elke chip droog niet te laten.
8. Schud voorzichtig de lade om eventuele luchtbellen te verwijderen en laat de chips onder water gedurende 1 minuut.Vul een tweede wasbeurt schotel met PB1. Schud de lade weer.
9. Breng de lade van de kraal chips in de tweede wasbeurt gerecht. Schud voorzichtig en laat inwerken gedurende 1 minuut, dan weer schudden.
10. In de vloeistof doorstroming verzamelplaats plaatst vier zwarte kunststof doorstroming bretels in de groeven. Vul het station met PB1 tot de vloeistof nagenoeg de hoogte van de acht montagebeugels (ongeveer 150 ml) bereikt.
11. Verwijder een kraal chip uit de lade en plaats deze in de verzamelplaats op een plastic doorstroom brace. De chip barcode moet boven de streepjescode symbool geëtst in de verzamelplaats worden uitgelijnd. Herhaal dit voor de andere drie chips die past binnen de verzamelplaats.
12. Plaats een doorzichtige plastic spacer bovenop een kraal chip. De buitenranden van de spacer moet de beugels omgeven binnen de verzamelplaats. Herhaal dit voor de andere chips ondergedompeld in de PB1.
13. Plaats de plastic montage bar in de verzamelplaats door het aanbrengen van het over de groeven. Plaats voorzichtig een glasplaatje bovenop de plastic spacer door op de achterzijde van de schuif tegen het samenstel bar en langzaam zakken voren in de vloeistof. De groef aan de bovenkant van de dia moet naar beneden wijzen, direct boven de barcode van de chip, met een afstand tussen de hiel chip en de schuif op de streepjescode einde. Herhaal dit voor de andere chips ondergedompeld in de PB1. Voor een volledige doorstroom montage schema, zie figuur 5.
14. Controleer op luchtbellen tussen de chip en glijbaan. Als er bellen verschijnen, voorzichtig omhoog de glijbaan op de streepjescode einde en probeer het opnieuw. Aanhoudende bubbels kan worden schoongemaakt, zodat de glazen met een papieren handdoek laboratorium (Kimwipe).
15. Snap twee metalen klemmen rond de glasplaatje, een tegen de streepjescode uiteinde en een naar achteren. De randen van de klemmen moet het plastic handvat doorstroom brace onder de chip. Herhaal dit voor elke chip ondergedompeld in PB1.
16. Verwijder de voltooide doorstroming samenstellingen en plaats horizontaal op de bench. Zorg ervoor dat u de montage verticaal kantelen, waardoor de vloeistof onder het glaasje te ontsnappen. Indien meer chips wachten in de was bak, kunnen ze worden samengesteld onder dezelfde PB1. Als andere chips wachten in hun oorspronkelijke hyb kamers, verwerp alle vloeistof in de verzamelplaats en afwassen, en terug te keren naar stap 7.6.
17. Zodra alle kralen chips in hun doorstroom samenstellingen, neem een ​​paar chirurgische schaar en knip beide uiteinden van de afstandhouder uit, zo dicht mogelijk bij het glaasje mogelijk.

8. Kleuring en Extension

1. Controleer of de doorstroming kamer rack heeft bereikt 44 ° C in meerdere posities met een temperatuursonde. Als de temperatuur af met meer dan een halve graad, stel de temperatuur van het waterbad.
2. Plaats een kraal chip doorstroom montage op de kamer rek door het schuiven van de assemblage naar beneden en het aansluiten van de beugel aan de bovenkant. De achterzijde van de kraal chip mag aanraken de kamer rek. Het glass dia moet worden naar buiten gericht, met de groef aan de bovenkant om een ​​reagens reservoir vormen. Herhaal dit voor elke kraal chip montage.
3. Met een 200 ul pipet 150 ul RA1to de doorstroming samenstellen door afgeven van de vloeistof in het glazen reservoir. Incubeer gedurende 30 sec. Herhaal 5x.
4. Met een 1.000 III pipet 450 ul XC1to de doorstroming samenstellen door afgeven van de vloeistof in het glazen reservoir. Incubeer gedurende 10 minuten.
5. Voeg 450 ul XC2 de doorstroming samenstellen door afgeven van de vloeistof in het glazen reservoir. Incubeer gedurende 10 minuten.
6. Voeg 200 ul TEM de doorstroming samenstellen door afgeven van de vloeistof in het glazen reservoir. Incubeer gedurende 15 minuten.
7. Voeg 450 ul 95% formamide / EDTA mix de doorstroming samenstellen door afgeven van de vloeistof in het glazen reservoir. Incubeer gedurende 1 minuut. 1x herhalen.
8. Incubeer de doorstroming assemblages voor 5 minuten.
9. Stel het hete waterbad om de temperatuur lIsted op de buizen van STM (of 37 ° C als er geen wordt weergegeven). Zorg ervoor dat elke STM buis heeft de beursgenoteerde dezelfde temperatuur.
10. Voeg 450 ul XC3 de doorstroming samenstellingen. Incubeer gedurende 1 minuut. 1x herhalen.
11. Wanneer het hete waterbad temperatuur de gewenste temperatuur heeft bereikt, voeg 250 μLSTM de doorstroming samenstellen door afgeven van de vloeistof in het glazen reservoir. Incubeer gedurende 10 minuten.
12. Voeg 450 ul XC3 de doorstroming samenstellen door afgeven van de vloeistof in het glazen reservoir. Incubeer gedurende 1 minuut. 1x herhalen.
13. Incubeer de doorstroming assemblages voor 5 minuten.
14. Voeg 250 ul ATM de doorstroming samenstellen door afgeven van de vloeistof in het glazen reservoir. Incubeer gedurende 10 minuten.
15. Voeg 450 ul XC3 de doorstroming samenstellen door afgeven van de vloeistof in het glazen reservoir. Incubeer gedurende 1 minuut. 1x herhalen.
16. Incubeer de doorstroming assemblages voor 5 minuten.
17. Voeg 250 ul STM de doorstromingvergaderingen door het afgeven van de vloeistof in het glas reservoir. Incubeer gedurende 10 minuten.
18. Add4 50 ul XC3 de doorstroming samenstellen door afgeven van de vloeistof in het glazen reservoir. Incubeer gedurende 1 minuut. 1x herhalen.
19. Incubeer de doorstroming assemblages voor 5 minuten.
20. Herhaal de stappen 8,14-8,19 1x.
21. Verwijder de doorstroom assemblages uit de kamer rek en zet het waterbad.

9. Wassen en Afdichting

1. Vul een kleuring kraal chip wassen schotel met PB1 (ongeveer 315 ml). Twee verticaal was gerechten en een verticale kraal chip tray nodig zal zijn, samen met ten minste een vacuüm spruitstuk.
2. Demonteer een doorstroom montage door het invoegen van een dunne metalen staaf tussen de gespen en de brace en dan zwenken. Vernietiging van het glasplaatje en verwijder de kraal chip. Plaats onmiddellijk de kraal chip in de verticale kraal chip tray en onder te dompelen in PB1. Herhaal dit voor elke doorstroming assemblage, en zorg ervoor eac gezichth kraal chip in dezelfde richting en hun blootstelling aan lucht minimaliseren.
3. Schud voorzichtig de kraal chip tray om luchtbellen te verwijderen. Incubeer de verzonken kraal chips in PB1 gedurende 5 minuten. Vul het tweede verticaal was gerecht met de XC4 bereid de vorige dag. Schud de kraal chip tray weer.
4. Beweeg de kraal chip lade om het wassen schotel gevuld met XC4. Schud voorzichtig de lade om luchtbellen te verwijderen. Incubeer gedurende 5 minuten en schud opnieuw.
5. In een vloeiende beweging, trek de hiel chip lade uit de wassen schotel en zet op een reageerbuis rek, zodat de kralen op elke kraal chip gezicht naar boven. Met zelfsluitende pincet, schuift een bead chip uit de lade en plaats op een reageerbuis rek. Herhaal dit voor elke kraal chip.
6. Breng zorgvuldig de reageerbuis rek chips om een ​​vacuumexsiccator. Sluiten en zet de stofzuiger, zorgen voor een goede afdichting. Incubeer gedurende 50-55 minuten. Indien nodig, kan de scanner tijdens incubatie.

10. Het scannen

1. Turn uit het vacuüm en langzaam terug de druk tot atmosferische. Controleer of de kraal chips droog zijn. Indien nodig, veeg de randen en onderkant van de chip met een papieren handdoek om een ​​vloeibaar of vuil te verwijderen.
2. Activeer de scansoftware en bewegen kraal chips te scannen lade. Download decoderen van bestanden van de chip (dmaps) door het activeren van de Decode Bestand Client-software en het invoeren van de gewenste kraal chip barcodes, samen met hun overeenkomstige vakje ID's. Niet-gescande kraal chips kan veilig in een droge, donkere ruimte worden opgeslagen voor maximaal 72 uur.
3. Zodra de chips goed zijn geplaatst in de lade en het decoderen bestanden worden herkend door de software, start het scannen.

Resultaten

Een goed-bewerkte kraal chip moeten helder en duidelijk rood en groen laser-licht intensiteiten weergegeven tijdens het scannen. In figuur 6, de iScan scansoftware toont deze een standaard genomische DNA-monster met succes gehybridiseerd met een aangepaste-panel SNP genotypering array. De gemerkte nucleotiden die tijdens de uitbreiding en kleuring stappen bevestigd fluoresceren onder de lampen van de twee lasers. Aangezien deze nucleotiden selectief de kraal van oligonucleotideketen gehybridiseerd met het gefragmenteerde DNA streng verlengen en de oligonucleotide ketens ontworpen te beëindigen op de plaats van de variant, kan de kleur en intensiteit van het verkregen signaal worden gebruikt om de op de allelen te bepalen SNP-plaats.

Een user-generated staalkaart, die monster-ID's en klinische gegevens overeenkomen om chipID en positie, en een reeks specifieke SNP manifest, rechtstreeks van het bedrijf, zijn beide nodig om de sca importerennner output bestanden in de GenomeStudio analyse software. Voorbeeld monster bladen zijn te vinden op de website van de vennootschap. Zodra het GenomeStudio project gebouwd kan genotypen worden verkregen uit de resulterende intensiteit clusters automatisch gegenereerd door de software. Hoewel meerdere weergave opties bestaan, de standaardweergave, Norm-R (een genormaliseerde intensiteit waarde) vs Norm-Theta (een allele intensiteit ratio), is vaak de makkelijkste complot om drie verschillende clusters onderscheiden. De meeste SNPs moet een, twee of drie clusters vertonen, afhankelijk van de minor allel frequentie.

De drie clusters vertegenwoordigen monsters demonstreren AA, AB of BB allelen (zie figuur 7). Deze clusters kunnen worden toegewezen genotypen hetzij door rechtstreeks importeren van een standaard template clustering positie van het bedrijf, door "Cluster Alle SNPs" uit de werkbalk Analyse van de software te selecteren, of door te klikken en te slepen met de gekleurde cirkels op de intensiteit percelen handmatig edi t noemt. De kleur van het monster op de intensiteit perceel (rood, paars, of blauw) geeft aan de oproep (AA, AB, of BB, respectievelijk), zwarte geeft geen gesprek. Door te bladeren door de in het deelvenster volledige gegevens van de software vermeld SNPs, kan de clustering voor elke SNP worden bekeken of teruggeroepen. Zodra de clusters bevredigende gesprekken worden toegewezen, het volledige deelvenster Gegevens van de software geeft de genotypes voor elk individueel monster bij elke afzonderlijke SNP. De Kolom Kiezer optie boven de tafel kan dataformaten schakelen.

Gegevens kunnen via de werkbalk Analyse of direct van de volledige gegevens tabel worden geëxporteerd voor een diepgaande analyse.

Figuur 1. Overzicht - Infinium Testprotocol.683/50683fig1highres.jpg "target =" _blank "> Klik hier voor grotere afbeelding.

Figuur 2. Compleet Hyb Kamer basis en mat, plus deksel. ^[12] Klik hier voor grotere afbeelding .

Figuur 3 Het laden van een BeadChip -.. Breng het monster op de inlaatpoorten ^[12] Klik hier voor vergroting afbeelding.

Figuur 4 verwijderen BeadChip Coverseal -.. Pak de afdichting op de hoek en voorzichtig afpellen diagonaal ^[12] Klik hier voor grotere afbeelding .

Figuur 5. Compleet BeadChip Flow-through Assembly - De BeadChip is gescheiden van een glasplaatje met een spacer en gebonden met klemmetjes.> Klik hier voor grotere afbeelding.

Figuur 6. Succesvolle BeadChip Scan - A) De BeadChip wordt gescand met zowel een rode en groene laser, de scanning software geeft beide tegelijk. Secties passeren intensiteit QC zal groen markeren op de BeadChip scherm naar links. Secties falende intensiteit QC zal rood markeren op de BeadChip display. B) Zodra het scannen is voltooid, zal de software overlay de rode en groene displays. Een ingezoomde afbeelding wordt getoond. De kleur en intensiteit van elke individuele kraal geeft het allel aanwezig. Klik hier voor grotere afbeelding .

Figuur 7. SNP NORM-R vs NORM-THETA Cluster Profielen - A) Een geldig SNP met drie verschillende clusters die AA, AB en BB genotypen, gekleurd rood, paars en blauw B) A SNP nodig bewerken.. De middelste cluster, die moet worden homozygote AB, is links niet-genoemd. De BB cluster wordt ten onrechte genoemd AB. C) Een slecht presterende SNP. Geen genotypen kan worden verkregen bij deze intensiteit plot, omdat er geen duidelijke clusters bestaan. Klik hier voor grotere afbeelding .

Discussie

Grootschalige genotypering toepassingen zijn gebruikt om beter inzicht in de genetische mechanisme achter vele menselijke ziekten. De ontdekking van een belangrijke variant via een genoom-brede associatie analyse kan een kandidaat regio vlag voor verdere studie. Daarnaast genotype data is een goed hulpmiddel voor de kwaliteitscontrole op sequencing projecten.

Om sample throughput te maximaliseren, kunnen meerdere monster platen worden versterkt en opgeslagen in hun gefragmenteerde, geresuspendeerde staten. Acht plaatjes worden geamplificeerd in een enkele dag combineert de eerste 24 uur van het protocol voor meerdere partijen en bieden genoeg materiaal voor ~ 2-8 dagen chip-processing. Als versterkte platen van tevoren worden opgeslagen, en als er nieuwe monsters worden gehybridiseerd met chips onmiddellijk na het scannen begint op de vorige run, kan de verwerking continu draaien zonder de noodzaak om te pauzeren voor extra monster voorbereiding. Daarom zal al monsters drie dagen om de volledige ondergaantest kunnen gegevens dagelijks gegenereerd. Assuming24 chips worden dagelijks verwerkt, een 5 daagse werkweek zorgt voor meer dan 1000 DNA-monsters te worden uitgevoerd op een 12-sample kraal chip. Als een trede of een reagens is mislukt echter meerdere batches mogelijk gevaar lopen voor de slechte prestaties voordat een correctie kan worden toegepast. Fouten kunnen onopgemerkt totdat de arrays worden gescand of geanalyseerd, daarom, als throughput gemaximaliseerd, honderden monsters in verschillende stadia van het protocol zou al hebben dezelfde gebrekkige behandeling bij ontdekking ontvangen. Als verloren reagentia en de gegevens niet kunnen worden hersteld, moet de gebruiker deze risico's af te wegen tegen de noodzaak van een versnelde workflow.

De GenomeStudio analyse software is de eerste kans om het succes van het genotyperingsproces werkelijk meten. Als de Norm-R vs Norm-Theta intensiteit percelen goed zijn geclusterd, moet de gemiddelde call rate (percentage van de totale SNPs succes getypt) van de monsters te benaderen 99%, hoewel deze waarde varieert slightly afhankelijk van het type array. De gegevens van een monster met een oproep lager tarief dan 85-90% is niet betrouwbaar en moet worden weggegooid. Voor kwaliteitscontrole doeleinden, moeten de resultaten worden vergeleken met een eerder bekende mogelijke genotypen wanneer. Als de gegevens bestaan, opzettelijke monster duplicatie is een nuttig hulpmiddel bij de controle van plaat of matrix plaatsingen. Deze dubbele paren moeten op aparte chips, borden, batches, of projecten worden geplaatst; hun genotypen gecontroleerd op generatie. Terwijl specifieke QC beperkingen variëren naar gelang de voorkeur van de onderzoeker, zijn gemeenschappelijke SNP beperkingen op basis van steekproefsgewijze oproep succes, Hardy-Weinberg evenwicht, of onvolledigheid tussen patiënten en controles, terwijl gemeenschappelijke steekproef beperkingen zijn gebaseerd op de beltarieven, Mendeliaanse inconsistenties of kruisverwijzingen X-chromosoom heterozygositeit klinische sekse gegevens ^[13].

Als zich een probleem voordoet, de Controls Dashboard, gevonden in de analyse suite, kan worden aan de ingediendebedrijf om oorzaak te bepalen. Deze controles kunnen vaak een beperking van de vraag naar de meest waarschijnlijke stap of reagens mislukking. Als een SNP's van belang zijn te vinden via een Infinium genotypering experiment, moeten hun intensiteit plots dubbel gecontroleerd in GenomeStudio voor clustering fouten voordat verder onderzoek wordt uitgevoerd zijn.

Een mislukte Infinium genotypering experiment is waarschijnlijk te wijten aan menselijke fout bij het verwerken of slechte kwaliteit ingang DNA. Monster kwantificering moeten accuraat en nauwkeurig zijn. Voor het beste resultaat, elke reagentia toegevoegd aan een monster of chip moet worden afgegeven bij de door het protocol ingestelde volume. Pipetten moeten behoren te worden geijkt. Reagentia moeten niet worden uitgevoerd na verloop en mag niet worden ingevroren eenmaal ontdooid, behalve de RA1 reagens. Om eventuele vlekken en uitbreiding fouten te minimaliseren, dient de formamide / EDTA mengsel vers bereid elke maand. Alle -20 ° C reagentia moeten worden opgeslagen in uitsluitend handmatige ontdooiing vriezers. Alle labware gebruikt in de staining, uitbreiding, en wassen delen van het protocol moet grondig worden gespoeld met water en een mild reinigingsmiddel onmiddellijk na onbruik. Het bevochtigen reservoirs in de hyb kamer moet worden geschrobd met een reageerbuis borstel en een mild schoonmaakmiddel. De glasplaatjes moet worden gewassen met 10% bleekmiddel, zoals geïnstrueerd door hun gebruikershandleidingen, een keer per week.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Verbruiksartikelen of apparatuur	Fabrikant	Artikelnummer	Minimaal vereist voor 96 monsters
0,8 ml Deep Well Plate	Thermo Scientific	AB-0765	1
Plate Mats	Thermo Scientific	AB-0674	2
Reagent Basin	Fisher Scientific	13-681-502	9
Heat-seal Sheets	Thermo Scientific	AB-0559	1
Flow-through Spacer	Fisher Scientific	NC9563984	6
Pipette tips - 200 μl	Rainin	GP-L200F	192
Pipette tips - 10 μl	Rainin	GP-L10F	16
Pipette tips - 1.000 μl	Rainin	GP-L1000F	16
DNA Suspension Buffer	Teknova	T0220	0,5 ml
0,1 N NaOH	Fisher Scientific	AC12419-0010	0,5 ml
Isopropanol (HPLC grade)	Fisher Scientific	A451	15 ml
Ethanol (200-proof)	Sigma-Aldrich	459836	330 ml
Formamide (100%)	Thomas Scientific	C001K38	15 ml
EDTA (0,5 M)	Amresco	E177	0,2 ml
10 μl 8-kanaals Pipette	Rainin	L8-10XLS	1
200 μl 8-kanaals Pipette	Rainin	L8-200XLS	2
1.000 μl Enkelkanaals Pipette	Rainin	L-1000XLS	1
Microplate Shaker	VWR	13500-890	1
Gekoelde Microplate Centrifuge	VWR	BK369434	1
Hybridisatieoven	Illumina	SE-901-1001	1
Hybex Microsample Incubator	SciGene	1057-30-0	1
Hybex MIDI Heat Block Insert	Illumina	BD-60-601	1
Heat Sealer	Thermo Scientific	AB-0384	1
Hyb Chamber met inzet en mat	Illumina	BD-60-402	2
Chirurgische schaar	Fisher Scientific	13-804-20	1
Flow Through Assembly Parts	Illumina	WG-10-202	8
Wasrek en -schaal	Illumina	BD-60-450	1
Genepaint Chamber Rack	Tecan	760-800	1
Temperatuursonde	Illumina	A1-99-109	1
Kleurrek en -schaal	Illumina	WG-10-207	1
Zelfsluitende pincet	Ted Pella, Inc	5374-NM	1
Vacuum Manifold	Ted Pella, Inc	2240	1
iScan of HiScan	Illumina	-	1