Een In-vitro Voorbereiding van Geïsoleerde enterische neuronen en Glia uit de myenterische Plexus van de Adult Mouse

Summary

We demonstrate a cell culture protocol for the direct study of neuronal and glial components of the enteric nervous system. A neuron/glia mixed culture on coverslips is prepared from the myenteric plexus of adult mouse providing the ability to examine individual neuron and glia function by electrophysiology, immunohistochemical, etc.

Abstract

Het enterische zenuwstelsel is een uitgebreid netwerk van neuronen en glia in de lengte van het maagdarmkanaal die functioneel controleert motiliteit. Een procedure voor het kweken van een gemengde populatie van neuronen en glia van de myenterische plexus beschreven. De primaire kweken kan worden gehandhaafd gedurende meer dan 7 dagen, met verbindingen te ontwikkelen tussen de neuronen en gliacellen. De longitudinale spier strip met de bijgevoegde myenterische plexus wordt uit de onderliggende kringspier van de muis ileum of colon en onderworpen aan enzymatische digestie. In steriele condities worden de geïsoleerde neuronale en glia bevolking conserven in de volgende pellet centrifugeren en uitgeplaat op dekglaasjes. Binnen 24-48 uur, neurietuitgroei optreedt en neuronen kunnen worden geïdentificeerd door pan-neuronale markers. Na twee dagen in cultuur, geïsoleerde neuronen vuren actiepotentialen zoals waargenomen door de patch clamp studies. Bovendien kan enterische glia ook identified door GFAP kleuring. Een netwerk van neuronen en glia in nauwe appositie vormt binnen 5-7 dagen. Enterische neuronen kan individueel zijn en direct bestudeerd met behulp van methoden zoals immunohistochemie, elektrofysiologie, calcium beeldvorming, en single-cell PCR. Bovendien kan deze procedure worden uitgevoerd in genetisch gemodificeerde dieren. Deze methode is eenvoudig uit te voeren en goedkoop. Kortom, dit protocol onthult de componenten van het enterische zenuwstelsel in een gemakkelijk gemanipuleerde wijze zodat wij beter de functionaliteit van de ENS in normale en ziektetoestanden ontdekken.

Introduction

Het enterische zenuwstelsel (ENS) is uitgebreid netwerk van zenuwen en glia die de volledige lengte van de gastro-intestinale (GI) stelsel loopt. De ENS controleert functioneel alle aspecten van de spijsvertering, zoals peristaltiek, vocht absorptie / secretie, gevoel van prikkels, enz. (voor een overzicht zie ^1). Het bevat meer dan 500 miljoen neuronen, meer dan in het ruggenmerg, en bevat elke klasse neurotransmitter in de hersenen. Bovendien is de ENS uniek omdat het reflex kan functioneren zonder input van het centrale zenuwstelsel ^2. Begrip van de ENS cruciaal, niet alleen de normale fysiologische rol te begrijpen, maar anderzijds ....

Protocol

All animal care and experimental procedures were in accordance with and approved by the Institutional Animal Care and Use Committee at Virginia Commonwealth University.

1. Preparation of Sterile Poly-D-Lysine- and Laminin-Coated Glass Coverslips in 24-Well Plates

1. All procedures for step 1 are performed in sterile conditions; under a hood, and with sterile reagents. Glass coverslips and double deionized water (ddH₂O) should be sterilized in advance. Preparation of plates can be done up to two weeks before neuron isolation.
2. Under the hood, use sterile forceps to place autoclaved glass coverslips in 12 wells of....

Results

Immediately following isolation of LMMP-derived cells, neurons and other cell types will not be readily evident. Living, round cells of indistinct phenotype can be seen as well as tissue detritus from incompletely digested tissue fragments and connective tissue. This flotsam is of no concern and will be largely removed with the first media change in two days. Do not attempt to clean the slides before this as the healthy, viable cells will be removed as well.

After one day in culture, neurons w.......

Discussion

Animals Used

This protocol has been optimized for Swiss Webster mice. However, this method is easily adaptable to other small-sized mammals such as rats and to other strains of mice. We have successfully performed preliminary isolations with C57 mice and μ-opioid receptor knock-outs. However, it is also possible that other strains of mice may be problematic due to morphological variations in the GI tract. Furthermore, there are known differences between mouse strains (C57Bl/6 vs. Balb/c) in th.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Reagents
Fisherbrand Coverglass for Growth Cover Glasses (12 mm diameter)	Fisher Scientific	12-545-82
Poly-D-lysine	Sigma	P6407- 5 mg
24-well cell culture plate	CELLTREAT	229124	May use any brand
Laminin	BD Biosciences	354 232
ddH2O			Can prepare in lab
15 ml Sterile Centrifuge Tube	Greiner Bio-one	188261	May use any brand
50 ml Sterile Centrifuge Tube	Greiner Bio-one	227261	May use any brand
NaCl	Fisher BioReagents	BP358-212	MW 58.44
KCl	Fisher BioReagents	BP366-500	MW 74.55
NaH2PO4 .2H2O	Fisher Chemicals	S369-3	MW137.99
MgSO4	Sigma Aldrich	M7506-500G	MW 120.4
NaHCO3	Sigma Aldrich	S6014-5KG	MW 84.01
glucose	Fisher Chemicals	D16-1	MW 180.16
CaCl22H2O	Sigma Aldrich	C5080-500G	MW 147.02
F12 media	Gibco	11330
Fetal Bovine Serum	Quality Biological Inc.	110-001-101HI	May use any brand
Antibiotic/antimycotic 100x liquid	Gibco	15240-062
Neurobasal A media	Gibco	10888
200 mM L-glutamine	Gibco	25030164
Glial Derived Neurotrophic Factor (GDNF)	Neuromics	PR27022
Sharp-Pointed Dissecting Scissors	Fisher Scientific	8940	May use any brand
Dissecting Tissue Forceps	Fisher Scientific	13-812-41	May use any brand
Cotton-Tipped Applicators	Fisher Scientific	23-400-101	May use any brand
250 ml Graduated Glass Beaker	Fisher Scientific	FB-100-250	May use any brand
2 L Glass Erlenmyer flask	Fisher Scientific	FB-500-2000	May use any brand
Plastic rod (child's paint brush)	Crayola	05 3516	May use any brand
Carbogen	Airgas	UN 3156	5% CO2
10 ml Leur-lock Syringe	Becton Dickinson	309604	May use any brand
21 G x 1 1/2 in. Hypodermic Needle	Becton Dickinson	305167	May use any brand
Collagenase type 2	Worthington	LS004174
Bovine Serum Albumin	American Bioanalytical	AB00440
2 ml Microcentrifuge Eppendorf tubes	Fisher Scientific	13-864-252	May use any brand
Nitrex Mesh 500 µM	Elko Filtering Co	100560	May use any brand
Pipette Set	Fisher Scientific	21-377-328	May use any brand
Sharpeining Stone	Fisher Scientific	NC9681212	May use any brand
Equipment
LabGard ES 425 Biological Safety Cabinet (cell culture hood)	Nuaire	NU-425-400	May use any brand
10 L Shaking Waterbath	Edvotek	5027	May use any brand
Microcentrifuge 5417R	Eppendorf	5417R	May use a single larger centrifuge with size adapters
Allegra 6 Series Centrifuge	Beckman Coulter	366816	May use any brand
HuluMixer Sample Mixer	Invitrogen	15920D
AutoFlow Water Jacket CO2 Incubator	Nuiare	NU-4750	May use any brand
Analytical Balance Scale	Mettler Toledo	XS104	May use any brand