We demonstreren een celkweekprotocol voor de directe studie van neuronale en gliale componenten van het enterische zenuwstelsel. Een gemengde neuron/glia-kweek op dekglasjes wordt bereid uit de myenterische plexus van een volwasen muis, waardoor het mogelijk is om de functie van afzonderlijke neuronen en gliacellen te onderzoeken door middel van elektrofysiologie, immunohistochemie, enz.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Het enterische zenuwstelsel is een uitgebreid netwerk van neuronen en glia in de lengte van het maagdarmkanaal die functioneel controleert motiliteit. Een procedure voor het kweken van een gemengde populatie van neuronen en glia van de myenterische plexus beschreven. De primaire kweken kan worden gehandhaafd gedurende meer dan 7 dagen, met verbindingen te ontwikkelen tussen de neuronen en gliacellen. De longitudinale spier strip met de bijgevoegde myenterische plexus wordt uit de onderliggende kringspier van de muis ileum of colon en onderworpen aan enzymatische digestie. In steriele condities worden de geïsoleerde neuronale en glia bevolking conserven in de volgende pellet centrifugeren en uitgeplaat op dekglaasjes. Binnen 24-48 uur, neurietuitgroei optreedt en neuronen kunnen worden geïdentificeerd door pan-neuronale markers. Na twee dagen in cultuur, geïsoleerde neuronen vuren actiepotentialen zoals waargenomen door de patch clamp studies. Bovendien kan enterische glia ook identified door GFAP kleuring. Een netwerk van neuronen en glia in nauwe appositie vormt binnen 5-7 dagen. Enterische neuronen kan individueel zijn en direct bestudeerd met behulp van methoden zoals immunohistochemie, elektrofysiologie, calcium beeldvorming, en single-cell PCR. Bovendien kan deze procedure worden uitgevoerd in genetisch gemodificeerde dieren. Deze methode is eenvoudig uit te voeren en goedkoop. Kortom, dit protocol onthult de componenten van het enterische zenuwstelsel in een gemakkelijk gemanipuleerde wijze zodat wij beter de functionaliteit van de ENS in normale en ziektetoestanden ontdekken.
Inleiding
Het enterische zenuwstelsel (ENS) is uitgebreid netwerk van zenuwen en glia die de volledige lengte van de gastro-intestinale (GI) stelsel loopt. De ENS controleert functioneel alle aspecten van de spijsvertering, zoals peristaltiek, vocht absorptie / secretie, gevoel van prikkels, enz. (voor een overzicht zie 1). Het bevat meer dan 500 miljoen neuronen, meer dan in het ruggenmerg, en bevat elke klasse neurotransmitter in de hersenen. Bovendien is de ENS uniek omdat het reflex kan functioneren zonder input van het centrale zenuwstelsel 2. Begrip van de ENS cruciaal, niet alleen de normale fysiologische rol te begrijpen, maar anderzijds aan een verscheidenheid van neuropathieën die aangeboren kan zijn (de ziekte van Hirschsprung), verworven (Chagas), secundair aan ziekten (diabetische gastroparese), te doorgronden geïnduceerde (Opioid bowel syndrome), of als gevolg van letsel (postoperatieve ileus) 1. Bovendien kan een enterische neuronen zijn reservoir voor virale infectie (varicella zoster) 3. Vanwege de overeenkomsten met de hersenen en de hoge niveaus van serotonine in de darm, medicijnen ter behandeling van centraal zenuwstelsel defecten vaak ongewenste neveneffecten op de ENS 2. Het is ook opmerkelijk dat veel neuropathieën zoals de ziekte van Alzheimer en Parkinson vertonen gelijkaardige cellulaire veranderingen in het enterische neuronen lang voordat de verschijning in centrale neuronen, waardoor de ENS een toegankelijke model voor de pathogenese van deze ziekten 4 bestuderen. Daarom is een grondig begrip van de ENS een noodzaak in het begrijpen van ziekten en het voorkomen / voorspellen farmacologische bijwerkingen.
De neuronen van de ENS oudsher bestudeerd in de cavia met wholemount voorbereidingen 5-7 of gekweekte neuronen 8. Ondanks het gemak waarmee neuronen worden bestudeerd in deze grote dieren, dit model heeft vele beperkingen waaronderontbreken van genetisch gemodificeerde stammen, gebrek aan reagentia species-specifiek, en de hoge kosten verbonden met bestellen en huisvesten deze onderwerpen. De ontwikkeling van een murine enterische zenuwstelsel model heeft het unieke voordeel van de verschillende knock-out-systemen, een breed scala van andere gevestigde methodologieën die kunnen worden gebruikt in combinatie met de celkweek technieken en de mogelijkheid om een validatie van het caviamodel .
De ENS bestaat uit drie plexi dat de lengte van het maagdarmkanaal uitvoeren: de buitenste myenterische plexus (tussen de langs kringspier) die voornamelijk verantwoordelijk zijn voor de peristaltische werking van de darm, en de submucosale en mucosale plexi, ( gevonden onder en in de mucosa, respectievelijk) die grotendeels beheerst fluïdumabsorptie / secretie en detectie van stimuli 1. Deze werkwijze begint met de isolatie van de longitudinale spier / myenterische plexus (LMMP) voorbereiding door pellende buitenste spierlaag van het maagdarmkanaal. Dit drastisch worden naar contaminatie die ontstaan wanneer de mucosale laag is betrokken bij de isolatie. Hierdoor is deze werkwijze geschikt voor de studie van neuronale controle motiliteit plaats secretoire acties van de ENS.
De hier gepresenteerde methode resulteert in een gemengde cultuur van enterische neuronen en gliacellen. Ten minste twee verschillende typen neuronen momenteel gebaseerd op eerdere waarnemingen elektrofysiologische en immunocytochemische 9. De aanwezigheid van glia is zeer voordelig, aangezien zij niet alleen een belangrijk celtype te bestuderen op zich, maar bijdragen tot het overleven van de enterische neuronen en 10 natuurlijke receptor expressie op het celoppervlak neuronale 11 handhaven. Bovendien kunnen tekortkomingen van enterische glia leiden tot abnormale maagdarmmotiliteit ziekte staten, bedacht 12 'neuro-gliopathies'. Daarom is de ENS cultuur hier gepresenteerde resultaten in verschillende celtypen die zijn rijp voor onderzoek.
De voordelen van deze methode zijn gemak van isolatie, goedkoop instrument eisen en kort de techniek beheersen door ervaren laboratoriumpersoneel. Beperkingen van de methodologie zijn lage algemene cel opbrengst van hoge volumes weefsel en de uitsluiting van ENS neuronen van mucosale en submucosale plexi. Deze procedure zal zeer voordelig zijn om wetenschappers gespecialiseerd in elektrofysiologie, immunohistochemie, eencellige PCR en andere methodieken.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
Alle dierenzorg en experimentele procedures waren in overeenstemming met en goedgekeurd door het Institutioneel Comité voor Dierenzorg en -gebruik aan de Virginia Commonwealth University.
1. Voorbereiding van steriele Poly-D-Lysine- en Laminine-gecoate glazen deksels in 24-well platen
- Alle procedures voor stap 1 worden uitgevoerd onder steriele omstandigheden; onder een kap, en met steriele reagentia. Glazen deksels en dubbel gedeïoniseerd water (ddH2O) moeten van tevoren worden gesteriliseerd. De voorbereiding van platen kan tot twee weken voorafgaand aan de neuronisolatie worden gedaan.
- Onder de kap, gebruik steriele pincetten om geautoclaveerde glazen deksels in 12 putjes van een 24-well plaat te plaatsen.
- Bereid poly-D-lysine stock van tevoren. Voeg 50 ml steriele ddH2O toe aan 5 mg poly-D-lysine. Vortex en bewaar in 3 ml aliquoten bij -20 °C. Ontdooi aliquoten voor gebruik.
- Voor een uiteindelijke concentratie van 1 ml poly-D-lysine stock per 25 cm2: pipetteer 80 μl van de poly-D-lysine stock bovenop elk glazen deksel (2 cm2). Laat de oplossing 10 minuten bezinken.
- Verwijder poly-D-lysine met behulp van vacuüm en spoel de deksels 3x met steriele ddH2O.
- Laat de platen minimaal 2 uur onder de kap drogen.
- Platen kunnen worden bewaard bij 4 °C of - 20 °C voordat de lamininecoating wordt uitgevoerd.
- Bereid laminine stock van tevoren. Ontdooi laminine op ijs en bewaar op ijs tijdens gebruik. Verdun tot een concentratie van 50 μg/ml; let op de batchconcentratie; elke batch zal anders zijn. Afhankelijk van de batchconcentratie, zal ongeveer 20 ml ddH2O worden toegevoegd aan elke flacon laminine. Maak aliquoten (5 ml) en bewaar bij -80 °C. Ontdooi aliquoten op ijs voor gebruik.
- Coat deksels met 5 μg/cm2 laminine; pipetteer 200 μl van de laminine stock op elk deksel.
- Incubeer laminineoplossing op de deksels gedurende 1 uur.
- Zuig de resterende laminineoplossing af en spoel deksels eenmaal met ddH2O. Vermijd het schrapen van het oppervlak van de deksels.
- Bewaar platen bij 4 °C gedurende maximaal twee weken.
2. Voorafgaande voorbereiding van neuronisolatieoplossingen
- Bereid Krebs oplossing (in mM: 118 NaCl, 4.6 KCl, 1.3 NaH2PO4, 1.2 MgSO4, 25 NaHCO3, 11 glucose, en 2.5 CaCl2). Plaats 13.79 g NaCl (FM 58.44), 0.686 g KCl (FM 74.55), 0.312 g NaH2PO4 (FM 120),.289 g MgSO4 (FM 120.4), 4.20 g NaHCO3 (FM 84.01), 3.96 g glucose (FM 180.2), en 0.555 g CaCl2 (FM 111) in 2 L ddH20. Koel af tot 4 °C.
- Bereid spoelmedia (F12 media met 10% foetaal bovien serum (FBS) en antibioticum/antimyoticum): Voeg aan een 500 ml fles F12 media 50 ml FBS en 5 ml Antibioticum/Antimyoticum 100x Vloeistof (Gibco) toe.
- Bereid enterische neuron media (Neurobasal A media met B-27, 2 mM L-glutamine, 1% FBS, 10 ng/ml, Glia Afgeleide Neurotrofische Factor (GDNF), en Antibioticum/Antimyoticum 100x Vloeistof). Om GDNF stock te maken, voeg 1 ml ddH2O toe aan 10 μg GDNF en bevries terug in 50 μl aliquoten, bewaar bij -80 °C. Voor een 50 ml flacon van compleet neuron media, combineer 47.5 ml Neurobasal A media, 1 ml B-27 (50x), 500 μl FBS, 500 μl 200 mM L-glutamine (Gibco) 50 μl GDNF stock, en 500 μl Antibioticum/Antimyoticum 100x Vloeistof. Media wordt gemaakt in kleine 50 ml batches om versheid van GDNF te waarborgen en om besmetting van grote hoeveelheden van deze dure cell media mix te voorkomen.
3. Oogsten van longitudinale spier/Myenterische Plexus (LMMP) Preparatie uit Muizen
- Appropriate nationale en institutionele ethiek dient op zijn plaats te zijn voordat dierproeven worden uitgevoerd. Volwassen Zwitserse Webster muizen met een gewicht van meer dan 25 g (meestal ouder dan 8 weken) worden in groepen van 6 gehuisvest vóór experimenten. Tissues van twee muizen worden gebruikt voor de isolatie van ileaal enterische neuronen en gliacellen en drie muizen worden gebruikt voor de isolatie van colonische cellen.
- Bereid het operatiegebied voor. Verzamel kleine chirurgische schaar, hoekige pincetten, wattenstaafjes, drie 200 ml glazen bekers, en een glazen/kunststof staaf (verfkwast). Zorg ervoor dat alle benodigdheden grondig worden gewassen en gespoeld voor gebruik om besmetting te minimaliseren. Deze stap kan de dag voor het experiment worden uitgevoerd.
- Plaats Krebs oplossing op ijs en beluucht met carbogen (95% zuurstof, 5% CO2) gedurende ten minste 30 min om de pH te stabiliseren.
- Schakel verschillende apparaten in en verwarm chemicaliën om op de gewenste temperaturen te stabilise
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
Direct na de isolatie van uit LMMP afgeleide cellen zullen neuronen en andere celtypen niet direct herkenbaar zijn. Er kunnen levende, ronde cellen met een onduidelijk fenotype worden waargenomen, evenals weefseldetritus van onvolledig verteerde weefselfragmenten en bindweefsel. Dit drijvend materiaal vormt geen probleem en zal grotendeels worden verwijderd bij de eerste mediumverversing over twee dagen. Probeer de glaasjes vóór die tijd niet te reinigen, omdat dan ook de gezonde, levensvatbare cellen zullen worden verwi...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
Dieren gebruikt
Dit protocol is geoptimaliseerd voor Swiss Webster-muizen. Deze methode is echter gemakkelijk aanpasbaar aan andere kleine zoogdieren zoals ratten en aan andere muisstammen. We hebben met succes voorlopige isolaties uitgevoerd met C57-muizen en μ-opioïde receptor knock-outs. Het is echter ook mogelijk dat andere muisstammen problematisch kunnen zijn vanwege morfologische variaties in het maag-darmkanaal. Bovendien zijn er bekende verschillen tussen muisstammen (C57Bl/6 versus Balb...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs verklaren dat er geen grote belangenconflicten bestaan.
Dankbetuigingen
Grant van het National Institute of Health DA024009, DK046367 & T32DA007027.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| Reagents | |||
| Fisherbrand Coverglass voor groei dekglazen (12 mm diameter) | Fisher Scientific | 12-545-82 | |
| Poly-D-lysine | Sigma | P6407- 5 mg | |
| 24-well celcultuurplaat | CELLTREAT | 229124 | Mag elk merk gebruiken |
| Laminine | BD Biosciences | 354 232 | |
| ddH2O | Kan in lab voorbereiden | ||
| 15 ml steriele centrifugeerbuis | Greiner Bio-one | 188261 | Mag elk merk gebruiken |
| 50 ml steriele centrifugeerbuis | Greiner Bio-one | 227261 | Mag elk merk gebruiken |
| NaCl | Fisher BioReagents | BP358-212 | MW 58,44 |
| KCl | Fisher BioReagents | BP366-500 | MW 74,55 |
| NaH2PO4 .2H2O | Fisher Chemicals | S369-3 | MW137,99 |
| MgSO4 | Sigma Aldrich | M7506-500G | MW 120,4 |
| NaHCO3 | Sigma Aldrich | S6014-5KG | MW 84,01 |
| glucose | Fisher Chemicals | D16-1 | MW 180,16 |
| CaCl22H2O | Sigma Aldrich | C5080-500G | MW 147,02 |
| F12 media | Gibco | 11330 | |
| Fetaal bovien serum | Quality Biological Inc. | 110-001-101HI | Mag elk merk gebruiken |
| Antibioticum/antimyoticum 100x vloeistof | Gibco | 15240-062 | |
| Neurobasal A media | Gibco | 10888 | |
| 200 mM L-glutamine | Gibco | 25030164 | |
| Glial Derived Neurotrophic Factor (GDNF) | Neuromics | PR27022 | |
| Scherpe gepunte dissectiescheren | Fisher Scientific | 8940 | Mag elk merk gebruiken |
| Dissectieweefselselpjes | Fisher Scientific | 13-812-41 | Mag elk merk gebruiken |
| Wattenstaafjes | Fisher Scientific | 23-400-101 | Mag elk merk gebruiken |
| 250 ml gegradueerde glazen beker | Fisher Scientific | FB-100-250 | Mag elk merk gebruiken |
| 2 L glazen Erlenmyerkolf | Fisher Scientific | FB-500-2000 | Mag elk merk gebruiken |
| Plastiek staaf (kinderverfkwast) | Crayola | 05 3516 | Mag elk merk gebruiken |
| Carbogen | Airgas | UN 3156 | 5% CO2 |
| 10 ml Leur-lock spuit | Becton Dickinson | 309604 | Mag elk merk gebruiken |
| 21 G x 1 1/2 inch hypodermische naald | Becton Dickinson | 305167 | Mag elk merk gebruiken |
| Collagenase type 2 | Worthington | LS004174 | |
| Bovine serum albumine | American Bioanalytical | AB00440 | |
| 2 ml Microcentrifuge Eppendorfbuisjes | Fisher Scientific | 13-864-252 | Mag elk merk gebruiken |
| Nitrex Mesh 500 µM | Elko Filtering Co | 100560 | Mag elk merk gebruiken |
| Pipetset | Fisher Scientific | 21-377-328 | Mag elk merk gebruiken |
| Slijpsteen | Fisher Scientific | NC9681212 | Mag elk merk gebruiken |
| Equipment | |||
| LabGard ES 425 Biologische Veiligheidskast (celcultuur hood) | Nuaire | NU-425-400 | Mag elk merk gebruiken |
| 10 L schuddende waterbad | Edvotek | 5027 | Mag elk merk gebruiken |
| Microcentrifuge 5417R | Eppendorf | 5417R | Mag een enkele grotere centrifuge gebruiken met maatadapters |
| Allegra 6 Series Centrifuge | Beckman Coulter | 366816 | Mag elk merk gebruiken |
| HuluMixer Sample Mixer | Invitrogen | 15920D | |
| AutoFlow Water Jacket CO2 Incubator | Nuiare | NU-4750 | Mag elk merk gebruiken |
| Analytische weegschaal | Mettler Toledo | XS104 | Mag elk merk gebruiken |
Referenties
- Furness, J. B. The enteric nervous system and neurogastroenterology. Nat. Rev. Gastroenterol. Hepatol. 9 (5), 286-294 (2012).
- Gershon, M. D. The enteric nervous system: A second brain. Hosp. Pract. (Minneap). 34 (7), 31-32 (1999).
- Gershon, A. A., Chen, J., Gershon, M. D. A model of lytic, latent, and reactivating varicella-zoster virus infections in isolated enteric neurons. J. Infect. Dis. 197, 61-65 (2008).
- Wakabayashi, K., Mori, F., Tanji, K., Orimo, S., Takahashi, H. Involvement of the peripheral nervous system in synucleinopathies, tauopathies and other neurodegenerative proteinopathies of the brain. Acta. Neuropathol. 120 (1), 1-12 (2010).
- Hirst, G. D., Holman, M. E., Spence, I. Two types of neurones in the myenteric plexus of duodenum in the guinea-pig. J. Physiol. 236 (2), 303-326 (1974).
- Clerc, N., Furness, J. B., Bornstein, J. C., Kunze, W. A. Correlation of electrophysiological and morphological characteristics of myenteric neurons of the duodenum in the guinea-pig. Neuroscience. 82 (3), 899-914 (1998).
- Rugiero, F., et al. Analysis of whole-cell currents by patch clamp of guinea-pig myenteric neurones in intact ganglia. J. Physiol. 538 (Pt. 2), 447-463 (2002).
- Jessen, K. R., Saffrey, M. J., Baluk, P., Hanani, M., Burnstock, G. The enteric nervous system in tissue culture. III. studies on neuronal survival and the retention of biochemical and morphological differentiation. Brain Res. 262 (1), 49-62 (1983).
- Smith, T. H., Grider, J. R., Dewey, W. L., Akbarali, H. I. Morphine decreases enteric neuron excitability via inhibition of sodium channels. PLoS One. 7 (9), e45251(2012).
- Abdo, H., et al. Enteric glial cells protect neurons from oxidative stress in part via reduced glutathione. FASEB J. 24 (4), 1082-1094 (2010).
- Aube, A. C., et al. Changes in enteric neurone phenotype and intestinal functions in a transgenic mouse model of enteric glia disruption. Gut. 55 (5), 630-637 (2006).
- Bassotti, G., et al. Enteric glial cells and their role in gastrointestinal motor abnormalities: Introducing the neuro-gliopathies. World J. Gastroenterol. 13 (30), 4035-4041 (2007).
- Neal, K. B., Parry, L. J., Bornstein, J. C. Strain-specific genetics, anatomy and function of enteric neural serotonergic pathways in inbred mice. J. Physiol. 587 (Pt. 3), 567-586 (2009).
- Phillips, R. J., Walter, G. C., Powley, T. L. Age-related changes in vagal afferents innervating the gastrointestinal tract. Auton. Neurosci. 153 (1-2), 90-98 (2010).
- Furness, J. B. Types of neurons in the enteric nervous system. J. Auton. Nerv. Syst. 81 (1-3), 87-96 (2000).
- Gulbransen, B. D., Sharkey, K. A. Novel functional roles for enteric glia in the gastrointestinal tract. Nat. Rev. Gastroenterol. Hepatol. 9 (11), 625-632 (2012).
- Pomeranz, H. D., Rothman, T. P., Chalazonitis, A., Tennyson, V. M., Gershon, M. D. Neural crest-derived cells isolated from the gut by immunoselection develop neuronal and glial phenotypes when cultured on laminin. Dev. Biol. 156 (2), 341-361 (1993).
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
