Methodenartikel

Micronschaal Resolutie Optische Tomografie van Gehele Mouse Brains met confocale Light Sheet Microscopie

20.7K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/50696

⸱

8 oktober 2013

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1European Laboratory for Non-linear Spectroscopy (LENS), 2Integrated Research Centre, University Campus Bio-medico of Rome, 3DAEMI, University of Cassino, 4National Institute of Optics (CNR-INO), 5Allen Institute for Brain Science, 6Department of Physics, University of Florence, 7ICON Foundation, Sesto Fiorentino, Italy

In dit artikel

Samenvatting

In dit artikel beschrijven we de volledige experimentele procedure te reconstrueren, met een hoge resolutie, de fijne hersenen anatomie van fluorescent gelabelde muis hersenen. De beschreven protocol bevat monstervoorbereiding en clearing, specimen montage voor imaging, data post-processing en multi-schaal visualisatie.

Samenvatting

Inzicht in de architectuur van de hersenen van zoogdieren bij eencellige resolutie is een van de kernpunten van de neurowetenschappen. Echter, in kaart brengen van neuronale soma en projecties in het hele brein is nog steeds een uitdaging voor de beeldvorming en data management-technologieën. Inderdaad, moeten macroscopisch volumes worden gereconstrueerd met een hoge resolutie en contrast in een redelijke tijd, het produceren van datasets in het TeraByte bereik. We hebben onlangs aangetoond dat een optische methode (confocale microscopie licht blad, CLSM) in staat was geweest micronschaal reconstructie van hele hersenen van muizen gelabeld met versterkt groen fluorescerend eiwit (EGFP). De combinatie van licht plaat verlichting en confocale detectie, CLSM maakt een diepe beeldvorming in macroscopische ontruimd exemplaren met een hoog contrast en snelheid. Hier de volledige experimentele pijplijn beschrijven we uitgebreide en leesbare beelden van de hele hersenen van muizen gelabeld met fluorescerende eiwitten te verkrijgen. De verrekening en de montage-pROCEDURES worden beschreven met de stappen om een ​​optische tomografie voeren op het gehele volume verwerven vele parallelle aangrenzende stapels. We toonden het gebruik van open-source-software op maat hulpmiddelen waarmee stiksels van de meerdere stacks en multi-resolutie data navigatie. Tenslotte hebben we geïllustreerd enkele voorbeelden van hersenenkaarten: het cerebellum van een L7-GFP transgene muizen, waarbij alle Purkinje cellen selectief worden gemerkt en de hele hersenen van een thy1-GFP-M muis, gekenmerkt door een willekeurige dun neuronale labeling.

Inleiding

In vergelijking met ons begrip van de moleculaire en cellulaire mechanismen van de hersenfunctie, onze kennis van fijne neuroanatomie ziet er nog steeds in de kinderschoenen 1. In feite hebben we nog steeds geen uitgebreide kaarten van de positie van neuronale somata of van lange afstand projecties door de hersenen. Eigenlijk zijn veel technologische inspanningen met betrekking tot de hersenen van muizen te reconstrueren met microscopische resolutie. Optische methoden op basis van seriële opdeling van hars ingebedde monsters, zoals Knife-Edge scanning microscopie (KESM) 2, Micro-Optische-Sectie Tomografie (MOST) 3 en fluorescentie-MOST (fMOST) 4, kunnen sub-micron driedimensionale resolutie voor beeldvorming van hele hersenen van muizen. De totale tijd die de bereiding en beeldvorming van een monster in de orde van enkele weken, de praktische toepassing van dergelijke werkwijzen beperkt. Een andere techniek die gebaseerd is op de seriële snijden (maar zonder hars inbedding), Serial Two-Foton tomografie (STP) 5, maakt hoge driedimensionale resolutie beeldvorming. Echter, deze techniek is aangetoond in hele muis hersenen slechts met een zeer schaars bemonstering, het verzamelen van 1 punt per 50 pm 5, en onze kennis STP nog niet produceerde een full-bemonstering reconstructie van een muizen brein.

Een geavanceerde optische methode om hele exemplaren reconstrueren in drie dimensies op hoge snelheid is licht vel microscopie 6. In dit optische stelsel voor monster wordt verlicht door een dunne plaat van licht en de fluorescentie-emissie wordt verzameld langs een as loodrecht op het belichtingsvlak. Alleen op deze manier in-focus fluoroforen zijn enthousiast en het is mogelijk om optische sectie in brede veld configuratie bereiken, hoge framerates garanderen. Wanneer gekoppeld aan het opruimen protocollen gebaseerd op de vervanging van water met een brekingsindex bijpassende vloeistof 7, heeft licht vel microscopie toegepast opmacroscopische exemplaren in hele muis hersenen 8. Echter, specimen-geïnduceerde lichtverstrooiing, die zelfs gewist exemplaren beïnvloedt, degradeert het licht blad leidt tot de excitatie van out-of-focus fluoroforen die een totale vervaging van de verkregen beelden toevoegt.

Als u alleen in-focus fotonen selectief verzamelen, hebben we onlangs gekoppeld licht plaat verlichting een confocale detectieschema 9. In confocale licht vel microscopie (CLSM), out-of-focus en verstrooide fotonen worden verworpen door een lineaire ruimtelijke filter (split) voorafgaand aan detectie (Figuur 1). Om confocale operatie lichtwaaier architectuur te bereiken, wordt de verlichtingssterkte door een aftastlijn en een statische afbeelding van de excitatie aftastlijn ter plaatse van de spleet een de-scansysteem in de detectie pad creëert. Een derde scansysteem reconstrueert een tweedimensionaal beeld op de camerasensor. CLSM biedt een 100% contrast verbetering in beschikbare muishersenen ten opzichte van conventionele lichtbronnen vel microscopie, met behoud van een 10 Hz beeldfrequentie. Met CLSM is het mogelijk om volledige muizenhersenen reconstrueren resolutie van 2 urn XY en 9 urn Z, en met voldoende contrast enkele fluorescent gelabelde neuronen onderscheiden.

In dit artikel beschrijven we de experimentele pijpleiding naar een muis hersenen reconstrueren met CLSM. Aldehyde vaste muis hersenen zijn gedehydrateerd in een gegradeerde reeks peroxydevrij tetrahydrofuraan en vervolgens goedgekeurd in peroxydevrij dibenzylether (figuur 2), volgens het protocol ontwikkeld door Becker et al.. 10 De ontruimde monster wordt vervolgens zorgvuldig gemonteerd op een getipte bord en gepositioneerd in de beeldvorming kamer van een custom-made confocale licht vel microscoop. Het monster kan direct worden gemonteerd door storten het op een punt van de plaat (figuur 3a), als alternatief kan worden gelijmd op een schijf van ontruimde agarosegel (Figuur3b) worden geplaatst in de holte van een bekerglas van gewist agarosegel (Figuur 3c). Een optische tomografie van de gehele hersenen wordt vervolgens uitgevoerd, zoals vele parallelle aangrenzende stapels verworven alle hersenvolume (figuur 4) omvatten. Een pre-tomografie van steekproeven, die een ruwe kaart van het monster positie en de vorm produceert, garandeert dat de beeldvorming wordt alleen uitgevoerd in het volume ingenomen door het monster. De tomografie stapels worden vervolgens aan elkaar geplakt met op maat gemaakte software en opgeslagen in een multi-resolutie hiërarchische regeling 11. Muis hersenen kan uiteindelijk worden verkend met prototypische multi-resolutie Google Maps-achtige visualisatie software. Beide software-instrumenten zijn als plugins in de open-source platform Vaa3D 12.

We zien eindelijk representatieve afbeeldingen van de muis hersenen om de mogelijkheden van de beschreven experimentele pijpleiding in het bestuderen van fijne muizen neuroanatom toneny.

Protocol

1. Tissue Voorbereiding en opslag

  1. Fix muizenhersenen via standaard transcardial 13 perfusie met 20 ml 0,01 M fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS) oplossing, gevolgd door 100 ml 4% paraformaldehyde in 0,01 M PBS. Zorgvuldig de pH van beide oplossingen tot 7,6: iets lagere waarden van de pH kan de fluorescentie van EGFP lessen.
  2. Post-fix de uitgesneden hersenen 's nachts in paraformaldehyde 4% bij 4 ° C.
  3. Spoel twee keer (30 minuten elk) in 0,01 M PBS en bewaar in 0,01 M PBS bij 4 ° C.

2. Uitdroging en Clearing

Let op: het protocol voor uitdroging en het opruimen volgt de ene beschreven door Becker et al. 10.

  1. Peroxiden van uitdroging oplosmiddel (tetrahydrofuran, THF), die XFP fluorescentie, filter THF sterk blussen met basisch geactiveerd aluminiumoxide (Brockman activiteitsgraad I, ongeveer 250 g / L THF) met een chromafie kolom. Vermijd het kraken van de kolom, die peroxide verwijdering zou verminderen.
  2. Stabilisator (gebutyleerd hydroxytolueen, 250 mg / L) Naar de eindoplossing, zelfs indien de THF reeds voor filtratie werd gestabiliseerd. Stabilizer is in feite door aluminiumoxide behouden: THF zonder stabilisator kunnen grote hoeveelheden peroxiden ontwikkelen en kan explosief en gevaarlijk zijn.
  3. Dehydrateer de gehele hersenen van muizen in een gegradeerde reeks van THF in zuiver water: 50%, 70%, 80%, 90%, 96%, 100%, 1 uur elk, vervolgens 100% overnacht. Plaats de flacon met het monster op een draaiend wiel. Blootstelling aan licht te voorkomen, wikkel de flacons met een aluminium folie.
  4. Filter de clearing oplosmiddel (dibenzylether, DBE) met aluminiumoxide (geactiveerd basisch, activiteit rang Brockman I, ongeveer 250 g / l DBE) met een filter trechter.
  5. Schakel het monster in 100% DBE. Wijzig de oplossing na 3 en 6 uur.

3. Specimen Montage

  1. Wanneer de hersenen lijkt transparant op het oog (typitisch 1 uur na de tweede DBE wissel), monteren op de getipte beeldplaat door een van de volgende methoden:
    1. Directe montage - dompelen voorzichtig het monster op een van de tips (Figuur 3a).
    2. Agarose schijf - Duik een schijf gemaakt van 6% agarosegel op de tips. Zachtjes fix het monster op de agarose disc met acryl lijm (figuur 3b). Wacht ongeveer 1 min bij uitharden.
    3. Agarose beker - Duik een beker gemaakt van 3% agarosegel op de tips. Plaats voorzichtig het monster op de bodem van de beker (figuur 3c).

Noot 1: Inbouw in agarose bekerglas de voorkeur als het belangrijk beeldvorming het monster in zijn geheel, maar de agarosegel rond het monster leidt tot extra lichtverstrooiing die nadelig beeldkwaliteit kunnen zijn. Indien een klein deel van het monster van beeldvorming kan worden uitgesloten, is het beter om de spec monterenimen op agarose schijf of direct op het puntje. De eerste methode is het meest geschikt om de hersenen horizontaal (met uitzondering van het afbeelden van een ventrale of dorsale gedeelte van de hersenen), de laatste te houden aan de hersenen verticaal te houden (met uitzondering van het afbeelden van een deel van reukbollen of van het ruggenmerg).

Noot 2: de agarosegel moet worden opgesteld in water, vervolgens gedehydrateerd met THF (50% en 100% 4 uur elk) en ontruimd in DBE 100% gedurende 4 uur of totdat het lijkt duidelijk transparant.

  1. Na de montage van het model na een van de vorige methoden, de positie van de beeldvormende plaat in het monster kamer met een pincet. Vul de kamer met de clearing oplossing.

4. Tomografie Voorbereiding

  1. Verwijder de spleet om zoveel mogelijk fluorescentie te verzamelen.
  2. Verlichten het monster met een lage laservermogen aan fotobleken voorkomen.
  3. Verplaats het monster in de drie richtingen met behulp van de software-gedreven micropositionering system. Identificeer voor elke richting de minimum en maximum coördinaten waarbij het ​​monster wordt verlicht en binnen het gezichtsveld van de camera (figuur 4a).
  4. Plaats de bovenstaande coördinaten als parameters voor de 'Pre-tomografie' subroutine. Geef ook de afstand tussen aangrenzende stapels worden gebruikt in de tomografie, en de pre-tomografie bemonsteringsstap in z-richting.
  5. Start de pre-tomografie, waarmee de beelden in elke stapel met de z bemonstering gespecificeerd in (4.4) verzameld.

Opmerking: De verzamelde beelden worden gebruikt door een software om een ruwe kaart van specimen vorm en positie (4b figuur), die het mogelijk maakt te beperken tomografie overname alleen voor de werkelijk door het monster bezet volume, waardoor de beeldvorming tijd en dus fotobleking bereiden.

5. Tomografie Acquisitie

  1. Verplaats het monster buiten het licht blad met de micropositionering systeem.
  2. Increase laservermogen en stopt de beweging van de scansystemen, zodat alleen een vaste lijn in het midden van het gezichtsveld te verlichten.
  3. Monteer de spleet en lijn het gebruik van autofluorescentie signaal van de clearing oplossing. U moet duidelijk de spleet lijn in het midden van het gezichtsveld.
  4. Re-activeren het scansysteem, verminderen laservermogen en verplaats het monster in het licht blad met de micropositionering systeem. Merk op dat het laservermogen gebruikt met de spleet groter dan degene zonder zal het, aangezien de ruimtelijke filter blokkeert een niet te verwaarlozen gedeelte van het licht.
  5. Stel de amplitude en offset van de scanning en de-scanning systemen met de besturingssoftware, voordat de beelden kijken duidelijk en helder.
  6. Voer de tomografie-acquisitie software, na het instellen van de juiste z stap voor het experiment. Het volume zal worden afgebeeld in vele parallelle, deels overlappende stapels (Figuur 5a), en de beelden wordt opgeslagen ineen hiërarchische mappenstructuur.

6. Stiksels en Visualisatie

  1. Vul het verkregen volume met synthetische zwarte beelden (dwz beelden van hetzelfde type en de afmetingen van de verzamelde enen, maar met nul intensiteit) met behulp van een geautomatiseerde software (Figuur 4c). Deze stap is verplicht zodat het stiksel software om te gaan met een volledige kubieke volume.
  2. Launch Vaa3D software (gratis te downloaden van http://www.vaa3d.org/ ) met de plugins TeraStitcher en TeraManager geïnstalleerd.
  3. Laad de TeraStitcher plugin. Selecteer de map met de afgebeelde volume, geven de relatieve oriëntaties van de assen (ten opzichte van een referentie-rechtshandig assenstelsel) en de voxel grootte.
  4. Lanceren het eerste deel van het stiksel. De software zal de relatieve verplaatsing tussen koppels van stapels te berekenen, en een algehele optimale placem vindenent voor alle stapels samen (figuur 5b).
  5. Selecteer om de gestikt volume opslaan in single-resolutie of in multi-resolutie-formaat. Dit laatste maakt het mogelijk voor multi-resolutie visualisatie met de TeraManager plugin. In beide gevallen, als het imago van de hogere resolutie is groter dan een paar gigabytes, de multi-stack save modaliteit te selecteren en geeft u de omvang van de individuele substacks ook. Dit efficiënte toegang tot de opgeslagen gegevens mogelijk.
  6. Start het tweede deel van het stiksel. De software zal fuseren de uitgelijnde stacks, en sla ze als single-of multi-stack mode (Figuren 5c en 5d). Aan het eind sluit de TeraStitcher plugin.
  7. Laad de TeraManager plugin. Selecteer de map met de multi-gestapelde volume multi-resolutie, en geef voxelgrootte en assen oriëntaties. Het volume wordt op de minimale resolutie worden geladen.
  8. Zoom naar een hogere resolutie, selecteer een mijlpaal met de rechter muisknop modality van Vaa3D, daarna in te zoomen met de muis scroll. U kunt ook direct kiezen de ROI om in te zoomen met een klik met de rechtermuisknop, of geef de coördinaten van het volume van belang.
  9. Om terug te zoomen naar een lagere resolutie, gewoon gebruik maken van de muis scroll.

Resultaten

De beschreven protocol kan worden gereconstrueerd met micron-schaal resolutie hetzij volledige muizenhersenen of uitgesneden delen, zonder de noodzaak van fysieke snijden. Als representatief resultaat, in figuur 6 de gehele cerebellum een L7-GFP muis (postnatale dag 10) wordt getoond. In dit dier al Purkinjeneuronen zijn gelabeld met EGFP. Als we inzoomen, kan de typische lamellaire structuur van de cerebellaire schors worden gezien (figuur 7). Verder inzoomen maakt duidelijk onderscheid elke Purkinje cel soma (figuur 8). De beschreven protocol kan derhalve worden gebruikt om neuronale ruimtelijke organisatie screenen verschillende neurologische studies.

Als tweede representatief resultaat, presenteren we beelden van de unsectioned hersenen van een volwassen thy1-GFP-M muis. In deze transgene dieren EGFP wordt uitgedrukt in een willekeurige dun neuronale deelverzameling. De rechterhelft van de hersenen getoond in figuur 9. Zoals weinzoomen steeds verder (Figuren 10 en 11), neuronale processen worden onderscheiden. Dit resultaat toont aan dat de beschreven protocol maakt micronschaal resolutie beeldvorming in hele volwassen muis hersenen, het openen van de mogelijkheid van het bestuderen van de hersenen als geheel anatomie op cellulair resolutie in muismodellen van neurodegeneratieve ziekte.

figure-results-1
Figuur 1. Optische schema van confocale licht vel microscopie (CLSM). (A) Bovenaanzicht van het apparaat, met de excitatie pad. Laser emissie van een 488 nm diode-gepompte solid state (DPSS) laser, na uitbreiding en collimatie door een eerste telescoop, gaat een akoestisch-optische afstembare filter (AOTF) die lichtintensiteit regelt. Dan, een tweede telescoop breidt verder de balk. Een galvo spiegel verticaal (langs de y) scant het zijn uur, die wordt gefocusseerd door een lens in het monster kamer. (b) Zijaanzicht van de inrichting, die de detectie route. Licht van de doelstelling detectie verzameld wordt verticaal descanned door een galvo spiegel en gefocusseerd door een lens, een vast beeld van het bewegende excitatie lijn produceren. Ter plaatse van het vaste beeld lineair ruimtelijk filter (spleet) is geplaatst. Na de spleet, een galvo spiegel geplaatst in een 4f lenzenstelsel reconstrueert een 2-dimensionale afbeelding op de chip van een elektron vermenigvuldiging ladingsgekoppelde inrichting (CCD-EM). Een fluorescentie bandpassfilter verwijder alle excitatie strooilicht voor detectie. Vertegenwoordiger stralen van excitatie, detectie en-bandpass gefilterd detectie licht worden weergegeven door de blauwe, lichtblauwe en groene stralen, respectievelijk. De brandpuntsafstanden van alle objectieven daadwerkelijk bij de microscoop worden aangegeven. Klik hier om een grotere afbeelding te bekijken .

jove_content "fo: keep-together.within-page =" altijd "> figure-results-2
Figuur 2. Model clearing. Formaldehyde vaste muizenhersenen, die zijn opgeslagen in PBS 0,1 M bij 4 ° C (a), gedehydrateerd in een gegradeerde reeks van tetrahydrofuran (THF, b) en vervolgens 100% dibenzylether gewist (DBE , c). De dehydratatiestap veroorzaakt ook wat weefsel krimp.

figure-results-3
Figuur 3. Model bevestiging voor CLSM beeldvorming. Het heldere hersenen kunnen direct worden gestort op de getipt montageplaat (a), gelijmd op een open agarose disc (b), of opgenomen in een open agarose bekerglas (c).

figure-results-4
Figuur 4. Tomografie acquisitie. Het pre-tomografie routine monsters een parallellepipedum met de hersenen (a) het aantal en de lengte van parallelle aangrenzende stapels nodig beeld alle specimen define (b). Na tomografie worden zwarte afbeeldingen gegenereerd om de virtuele verkregen volume voltooien een parallellepipedum (c).

figure-results-5
Figuur 5. Volume stiksels. De verzamelde image stacks gedeeltelijk overlappen tussen elkaar (a), waardoor de precieze afstemming op de TeraStitcher plugin (b). De plugin voegt vervolgens de uitgelijnde stapels in een enkele gestapelde (c) of multi-stacked (d) multi-resolutie weergave.

figure-results-6
Figuur 6. Hele cerebellum van P10 L7-GFP muis, waarbij alle Purkinje neuronen gelabeld met EGFP. Schalingsbalk 1 mm.

figure-results-7
Figuur 7. Inzoomen van een gedeelte van het cerebellum is getoond in figuur 6, met de kenmerkende lamellaire structuur van de cerebellaire cortex. Schalingsbalk 500 urn.

figure-results-8
Figuur 8. Verder inzoomen van een gedeelte van de in figuur 6 cerebellum. Purkinje cellen soma duidelijk worden onderscheidened.. Schaal bar, 200 micrometer.

figure-results-9
Figuur 9. Rechterhelft van de hersenen van een volwassen thy1-GFP-M muis, gekenmerkt door een dun niet-specifieke neuronale EGFP etikettering. Schalingsbalk 1 mm.

figure-results-10
Figuur 10. Inzoomen van een gedeelte van de halve hersenen figuur 9, die een deel van de hippocampus en cortex. Schalingsbalk 200 urn.

figure-results-11
Figuur 11. Verder inzoomen van een gedeelte van de halve hersenen figuur 9. Aantal neurieten in de cortex duidelijk onderscheiden kunnen worden. Schaalbalk, 50 urn.

Discussie

CLSM in combinatie met chemische clearing vormen een krachtig hulpmiddel om de neuro-anatomie van de gehele hersenen van muizen gelabeld met fluorescerende probes, ofwel eiwitten of synthetische kleurstoffen bestuderen. Sinds het uitgestraalde licht buiten het brandvlak wordt geblokkeerd door een fysieke ruimtelijke filter, high-contrast beeldvorming is mogelijk ook in dikke exemplaren, met behoud van de hoge framerates typische licht vel architectuur.

Het belangrijkste probleem om te gaan met het gebruik van de beschreven werkwijzen is het maximaliseren van het contrast. In feite is het beschikbare signaal zowel verminderd door chemische en optische elementen. Vanuit het chemisch oogpunt, kan de clearing procedures op basis van organische oplosmiddelen emissie blussen van fluorescerende eiwitten en andere fluorescerende kleurstoffen 7. Filtratie van het oplosmiddel om peroxiden te verwijderen, zoals beschreven door Becker et al.. 10, kan het handhaven van een goed niveau van fluorescentie ook oplosmiddelen gewist weefsels. Publicerened op waterbasis wismethodes 14 niet fluorescentie efficiëntie verminderen, maar resulteren in slechtere transparantie als het gaat om hele muizen hersenen, althans met lineaire optische technieken.

Aan de andere kant, op het moment zijn er geen commerciële doelstellingen met lange werkafstand gecorrigeerd voor de hoge brekingsindex (n ≈ 1,56) clearing-oplossingen gebruikt. Zo is de brekingsindex mismatch tussen het medium waarin het monster wordt ondergedompeld en de inrichting een van de doelstelling leidt tot sterke sferische aberraties. Naast het reduceren van de resolutie van de microscoop, zoals afwijkingen hebben een druppel beeldintensiteit en contrast, aangezien het licht verspreid over een groter gebied. Mogelijke oplossingen voor dit probleem zijn het gebruik van adaptieve optiek 15 en / of statische asferische correctoren.

Elke verbetering van het contrast en met de intensiteit gemakkelijk beïnvloedt ook belichtingssnelheid, omdat een kortere integration tijd per beeld kan worden gekozen. Momenteel CLSM kan veroorloven een beeldvormende snelheid van ongeveer 10 6 pm 3 / sec, met een blootstelling camera tijd van 100 msec 9. Bij deze snelheid duurt het 1-3 dagen op de foto om een ​​hele hersenen van muizen, afhankelijk van de steekproefomvang. Hoewel er geen significante verslechtering van de beeldkwaliteit wordt waargenomen gedurende zulke lange opnamesessie, vooral vanwege de intrinsieke lage photobleaching van licht plaat verlichting 6, de lange tijd die nodig is om een afbeelding met de hersenen van muizen kunnen in de praktijk beperken de toepasbaarheid van CLSM. Een 10-voudige toename in systeemrendement, in combinatie met het gebruik van een high-speed camera voor detectie, beeldvorming zou reduceren tot enkele uren, waarbij een routine van het beschreven protocol.

Ondanks alle bovengenoemde beperkingen, CLSM beeldvorming gekoppeld aan chemische clearing van weefsels vergunningen om hele muis hersenen reconstrueren met micronschaal resolutie in minder dan eenweek. Andere optische methoden voor het hele brein beeldvorming veroorloven hogere resolutie dan CLSM, maar tegen de prijs van langere voorbereiding en / of beeldvorming 2-4, of van een schaars z sampling 5.

De in dit artikel beschreven werkwijzen kunnen worden gebruikt in combinatie met verschillende strategieën voor fluorescentielabelling: transgene dieren tot expressie fluorescerende eiwitten in bepaalde neuronale subsets, virale transfectie intraparenchymateuze kleurstof injectie, etc. In de praktijk zijn alle vlekken strategieën voorgaande dieroffers verenigbaar met CLSM . In feite, is post-mortem fluorescentielabelling van gehele muis hersenen niet aangetoond tot nu toe, hoe dan ook, indien deze soort vlekken mogelijk zou zijn in de nabije toekomst, het aantal monsters dat kan worden gereconstrueerd met CLSM zal een stuk groter geworden, inclusief een mogelijk menselijk hersenweefsel.

Concluderend confocale microscopie lichtwaaier in combinatie met tissue clearing en multi-resolutie data management kan kunnen onderzoekers te reconstrueren en te analyseren macroscopische exemplaren met een resolutie in de micron schaal, met de technologische inspanningen die goed zijn van de hand van de meeste laboratoria. Mogelijke toepassingen van CLSM zijn natuurlijk niet beperkt tot de neurowetenschap, maar omspant alle onderzoeksgebieden waarin licht vel microscopie is al gebruikt, zoals embryogenese 16,17 en anatomie van kleine dieren 18.

Openbaarmakingen

De auteurs verklaren dat zij geen concurrerende financiële belangen.

Dankbetuigingen

Het onderzoek dat leidt tot deze resultaten heeft financiering van de Europese Unie Zevende Kaderprogramma (FP7/2007-2013) ontvangen op grond van subsidieovereenkomsten n. 228.334 en 241.526. Dit onderzoek is ook ondersteund door Human Frontier Science Program onderzoeksbeurs (RGP0027/2009), en door het Italiaanse Ministerie van Onderwijs, Universiteiten en Onderzoek in het kader van de Flagship Project Nanomax en door Italiaanse ministerie van Volksgezondheid in het kader van de "Stamcellen Call for proposals". Dit onderzoek is uitgevoerd in het kader van de onderzoeksactiviteiten van ICON stichting ondersteund door "Ente Cassa di Risparmio di Firenze" uitgevoerd.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Phosphate Buffered Saline TabletsSigma-AldrichP4417_100TAB
ParaformaldehydeAgar ScientificR1018
Peroxide-free TetrahydrofuranSigma-Aldrich186562
Aluminum oxide activated, basic, Brockmann ISigma-Aldrich199443
Dibenzyl etherSigma-Aldrich108014
Butylated hydroxytolueneSigma-AldrichW218405
Agarose Type III-A, High EEOSigma-AldrichA9793
Acrylic glueBostikD2498
Vaa3D softwareopen sourcegratis te downloaden van http://www.vaa3d.org/

Referenties

  1. Lichtman, J. W., Denk, W. The big and the small: challenges of imaging the brain's circuits. Science. 334, 618-623 (2011).
  2. Mayerich, D., Abbott, L., McCormick, B. Knife-edge scanning microscopy for imaging and reconstruction of three-dimensional anatomical structures of the mouse brain. J. Microsc. 231, 134-143 (2008).
  3. Li, A., et al. Micro-optical sectioning tomography to obtain a high-resolution atlas of the mouse brain. Science. 330, 1404-1408 (2010).
  4. Gong, H., et al. Continuously tracing brain-wide long-distance axonal projections in mice at a one-micron voxel resolution. Neuroimage. 74, 87-98 (2013).
  5. Ragan, T., et al. Serial two-photon tomography for automated ex vivo mouse brain imaging. Nat. Methods. 9, 255-258 (2012).
  6. Keller, P. J., Dodt, H. U. Light sheet microscopy of living or cleared specimens. Curr. Opin. Neurobiol. 22, 138-143 (2012).
  7. Erturk, A., et al. Three-dimensional imaging of solvent-cleared organs using 3DISCO. Nat. Protoc. 7, 1983-1995 (2012).
  8. Dodt, H. U., et al. Ultramicroscopy: three-dimensional visualization of neuronal networks in the whole mouse brain. Nat. Methods. 4, 331-336 (2007).
  9. Silvestri, L., Bria, A., Sacconi, L., Iannello, G., Pavone, F. S. Confocal light sheet microscopy: micron-scale neuroanatomy of the entire mouse brain. Opt. Express. 20, 20582-20598 (2012).
  10. Becker, K., Jahrling, N., Saghafi, S., Weiler, R., Dodt, H. U. Chemical clearing and dehydration of GFP expressing mouse brains. PLoS One. 7, e33916(2012).
  11. Bria, A., Iannello, G. TeraStitcher - A Tool for Fast Automatic 3D-Stitching of Teravoxel-Sized Microscopy Images. BMC Bioinformatics. 13, 316(2012).
  12. Peng, H., Ruan, Z., Long, F., Simpson, J. H., Myers, E. W. V3D enables real-time 3D visualization and quantitative analysis of large-scale biological image data sets. Nat. Biotechnol. 28, 348-353 (2010).
  13. Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole animal perfusion fixation for rodents. J. Vis. Exp. (65), e3564(2012).
  14. Hama, H., et al. Scale: a chemical approach for fluorescence imaging and reconstruction of transparent mouse brain. Nat. Neurosci. 14, 1481-1488 (2011).
  15. Booth, M. J., Neil, M. A. A., Wilson, T. Aberration correction for confocal imaging in refractive-index-mismatched media. J. Microsc. 192, 90-98 (1998).
  16. Huisken, J., Swoger, J., Del Bene, F., Wittbrodt, J., Stelzer, E. H. Optical sectioning deep inside live embryos by selective plane illumination microscopy. Science. 305, 1007-1009 (2004).
  17. Keller, P. J., Schmidt, A. D., Wittbrodt, J., Stelzer, E. H. Reconstruction of zebrafish early embryonic development by scanned light sheet microscopy. Science. 322, 1065-1069 (2008).
  18. Jahrling, N., Becker, K., Schonbauer, C., Schnorrer, F., Dodt, H. U. Three-dimensional reconstruction and segmentation of intact Drosophila by ultramicroscopy. Front Syst. Neurosci. 4, 1(2010).

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Beeldvorming van de muizenhersenenweefselklaringbeeldstitchingmulti resolutie visualisatiefluorescent eiwitlabelingbenzyl etherklaringdehydratieprotocolsoftwarenavigatie

Gerelateerde artikelen