Een techniek voor het transplanteren "Extreme Voorste Domain" tissues tussen Xenopus laevis embryo ontwikkeld. Weefsel kan worden verplaatst van de ene genexpressie achtergrond in de andere, waardoor de studie van de lokale vereisten voor craniofaciale ontwikkeling en voor het signaleren van interacties tussen het gezicht regio.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Facial Transplantaties in
* These authors contributed equally
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Craniofaciale aangeboren afwijkingen voorkomen bij 1 op de 700 levendgeborenen, maar etiologie is zelden bekend vanwege de beperkte kennis van craniofaciale ontwikkeling. Om te bepalen waar signaalwegen en weefsels handelen tijdens patroonvorming van de zich ontwikkelende gezicht, heeft een 'gezicht transplantatie-techniek is ontwikkeld in embryo's van de kikker Xenopus laevis. Een gebied van vermoedelijke tissues (de "Extreme Anterior Domain" (EAD)) wordt verwijderd uit een donor embryo in tailbud stadium en getransplanteerd naar een gastheer embryo van dezelfde fase, waarvan de equivalente gebied is verwijderd. Dit kan worden gebruikt om een chimeer gezicht waarbij de gastheer of donor weefsel heeft een verlies of winst van functie in een gen en / of omvat een geslacht label genereren. Na genezing is het resultaat van ontwikkeling gevolgd, en geeft aan rollen van de signalerende weg binnen de donor of de omliggende weefsels van de gastheer. Xenopus is een waardevol model voor gezicht ontwikkeling, zoals het gezicht regio is groot en gemakkelijk eenccessible voor micromanipulatie. Veel embryo's kunnen worden getest, gedurende een korte periode sinds de ontwikkeling snel optreedt. Bevindingen in de kikker zijn aan de menselijke ontwikkeling relevant, aangezien craniofaciale processen lijken geconserveerd tussen Xenopus en zoogdieren.
Inleiding
Naar onderliggende mechanismen van craniofaciale aangeboren afwijkingen 1-2, belangrijke weefsels en hun signalering bijdragen tijdens craniofaciale ontwikkeling te begrijpen moeten worden geïdentificeerd. In de kikker Xenopus laevis, een deel van het gezicht, zoals de mond en neus vorm van de "Extreme Anterior Domain" (EAD), waarbij ectoderm en endoderm direct naast elkaar 3-4. De EAD fungeert ook als een signalering centrum omliggende weefsels, waaronder de craniale neurale lijst, die de kaken en andere gezichtgebied 5 vormt beïnvloeden. Om genen die bijdragen aan EAD functie te identificeren, werd een 'gezicht transpla....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
1. Voorbereiden van reagentia
- 10x MBS: Bereid 1 liter 10x gewijzigd Barth's Saline (MBS)-oplossing 17. Zie Tabel 1, reagentia, ingrediënten, en instructies. Gebruik gedestilleerd water voor alle oplossingen. Meng in een beker, met behulp van een roerstaafje, tot volledige ontbinding. Alle oplossingen moet worden bij kamertemperatuur.
- 1x MBS: Verdun 100 ml 10x MBS opgelost in 900 ml gedestilleerd water tot 1 liter 1x MBS maken. Voeg 0,7 ml 1 M CaCl2-oplossing.
- 0,1 x MBS: Verdun 1x MBS 1 L van 0,5 x MBS-oplossing en 2 L van 0,1 x MBS te bereiden. Tot 1 L van 0,1 x MBS oplossing, voeg 1 ml van 10 ....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
Getransplanteerde weefsel moeten volledig worden ingebracht in de gastheer kop na transplantatie zoals getoond in figuur 3A, en een glazen brug adequaat op het gezicht van de embryo's geplaatst, zie figuur 2BC. De getransplanteerde donorweefsel moet correct worden gedimensioneerd voor de host opening, voor de transplantatie succesvol te zijn. De EAD weefsel moet niet uitsteken van de kop, op enige wijze, zoals getoond in figuren 3B en 3C. Bovendien .......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
Kritische stappen en beperkingen: De EAD gezicht transplantatie procedure is tijd en arbeidsintensief. Het vereist oefening, een vaste hand, en behendigheid te perfectioneren. Het gezicht transplantatie protocol is gebaseerd op het vermogen van de onderzoeker om efficiënt te verwijderen en de transplantatie weefsel. Als men te lang duurt om de transplantatie te voegen in het gezicht van de gastheer, zal de gastheer gezicht beginnen te contracteren en te genezen. Tang kan worden gebruikt om delicaat breiden het ge.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs hebben niets te onthullen.
Dankbetuigingen
Wij danken Radek Sindelka voor zijn hulp, en Cas Bresilla voor het assisteren met kikker veeteelt en embryo voorbereiding. Dit werk werd gefinancierd door de NIH via de subsidie R01DE021109 om HLS Laura Jacox werd gefinancierd door de Herschel Smith Graduate Fellowship aan de Harvard University en een F30 individuele beurs subsidie F30DE022989-01 via de NIDCR.
....Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| Pasteur pipette | VWR | 14672-400 | Lime Glass |
| Size 5 3/4 in | Cotton Plugged | ||
| Graduated Transfer Pipette | VWR | 16001-180 | Disposable |
| #5/45 forceps | Fine Science Tools by Dupont medical | 11251-35 | Angled 45° |
| Standard Pattern Forceps | Fine Science Tools | 11000-20 | Straight; serrated tip; stainless steel |
| Capillary Tubing (for needles) | FHC | 30-30-1 | Borosil 1.0 mm OD x 0.5 mm ID/Fiber |
| Cover slip | VWR | 48393 252 | 24 x 60 mm micro cover glass; |
| Ficoll 400 | Sigma-Aldrich | F9378 | |
| Needle Puller | Sutter Instrument Co | Needle Puller: discontinued Filament: FB300B | The most similar, currently available needle puller is the P-97. For filaments, use Sutter 3.00 mm square box filaments, 3.0 mm wide. |
| Model P-80 | Flaming / Brown micropipette puller | ||
| Stereomicroscope | Zeiss | ||
| Stereomicroscope Lighting by Fostec | Fostec | Use a light box with 2 fiberoptic arms. | |
| Nickel Plated Pin Holder | Fine Science Tools | 26018-17 | Jaw Opening Diameter: 0-1 mm |
| Moria Nickel Plated Pin Holder | Fine Science Tools | 26016-12 | Jaw opening Diameter: 0-1 mm |
| Tungsten Needles | Fine Science Tools | 10130-05 | 0.125 mm Rod diameter |
| Van Aken Plastalina | Blick | #33268-2981 | |
| Modeling Clay- white, red, or yellow | |||
| mMessage mMashine SP6 or T7 Kit | Ambion | AM1340 |
Referenties
- Gorlin, R. J., Cohen, M., Levin, L. Syndromes of the head and neck. , Oxford University Press. UK. (1990).
- Trainor, P. Craniofacial birth defects: The role of neural crest cells in the etiology and pathogenesis of Treacher Collins syndrome and the potenti....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
