Methodenartikel

Detecteren Somatische genetische veranderingen in tumorspecimens door Exon Capture en Massively Parallel Sequencing

19.2K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/50710

⸱

18 oktober 2013

 ,  ,  ,  , 
1Department of Pathology, Memorial Sloan-Kettering Cancer Center, 2Human Oncology and Pathogenesis Program, Memorial Sloan-Kettering Cancer Center

In dit artikel

Samenvatting

We beschrijven de bereiding van barcode DNA-bibliotheken en daaropvolgende hybridisatie gebaseerde exon vastleggen voor de detectie van de belangrijkste kanker-geassocieerde mutaties in klinische monsters tumor door massaal parallelle "next generation" sequencing. Gerichte exon sequentie biedt de voordelen van hoge doorvoer, lage kosten en diepe sequentie dekking, hetgeen aldus hoge gevoeligheid voor het detecteren van lage frequentie mutaties.

Samenvatting

Inspanningen om belangrijke oncogene mutaties op te sporen en te onderzoeken zijn waardevol voor de juiste behandeling voor kankerpatiënten vergemakkelijken bewezen. De oprichting van high-throughput, heeft massaal parallelle 'next-generation' sequencing de ontdekking van veel van dergelijke mutaties geholpen. De klinische en translationele nut van deze techniek verbeteren, moeten platforms high-throughput, kosteneffectieve en compatibel met formaline-gefixeerde paraffine-ingebedde (FFPE) weefselmonsters dat kleine hoeveelheden van aangetaste of beschadigde DNA kan verkregen worden. Hier beschrijven we de bereiding van barcodes en gemultiplexte DNA-bibliotheken gevolgd door hybridisatie gebaseerde vastlegging van gerichte exons voor de detectie van kanker-geassocieerde mutaties in vers bevroren of FFPE tumoren door massaal parallelle sequencing. Deze methode maakt de identificatie van sequentie mutaties, aantal kopieën wijzigingen, en selecteer structurele herschikkingen waarbij alle gerichte genen. Gerichte exon sequencing biedt tHij profiteert van high throughput, lage kosten, en diep volgorde dekking, waardoor het verlenen van hoge gevoeligheid voor het detecteren van lage frequentie mutaties.

Inleiding

De identificatie van "bestuurder" tumor genetische gebeurtenissen in de belangrijkste oncogenen en tumor suppressor genen speelt een essentiële rol in de diagnose en behandeling van vele vormen van kanker 1. Grootschalige onderzoeksinspanningen gebruik te maken van massively parallel "next-generation" sequencing hebben de identificatie van veel van dergelijke kanker-geassocieerde genen in de afgelopen jaren 2 ingeschakeld. Echter, deze sequentie platformen vereisen typisch grote hoeveelheden DNA geïsoleerd uit vers bevroren weefsel en die een belangrijke beperking bij het karakteriseren en analyseren van DNA-mutaties van geconserveerde weefsels, zoals formaline gefixeerde in paraffine ingebedde (FFPE) tumormonsters. Verbeterde inspanningen om "bruikbare" genomische informatie efficiënt en betrouwbaar karakteriseren van FFPE tumorsteekproeven zal de retrospectieve analyse van eerder overbanked exemplaren mogelijk te maken en verder geïndividualiseerde aanpak bij kanker het management aan te moedigen.

Traditioneel, moleculaire diagnostic laboratoria hebben vertrouwd op tijdrovende, low-throughput methodologieën zoals Sanger sequencing en real-time PCR voor DNA-mutatie profilering. Meer recent zijn hogere doorvoer werkwijzen die gebruik multiplex PCR of massaspectrometrische genotypering ontwikkeld om terugkerende somatische mutaties in belangrijke kankergenen 3-5 onderzoeken. Deze benaderingen zijn echter beperkt doordat alleen vooraf toegewezen "hotspot" mutaties worden getest, waardoor ze ongeschikt voor het detecteren van inactiverende mutaties in tumorsuppressorgenen. Massaal parallelle sequencing biedt verschillende voordelen boven deze strategieën waaronder het vermogen om hele exons ondervragen voor zowel de gemeenschappelijke en zeldzame mutaties, de mogelijkheid om extra soorten genomic veranderingen zoals kopieaantal winsten en verliezen worden vastgesteld en grotere gevoeligheid in heterogene monsters 6, 7 . Whole genome sequencing vertegenwoordigt de meest uitgebreide aanpak voor mutatie ontdekking, al is het relatiefly duur en loopt grote computationele eisen voor data-analyse en opslag.

Voor klinische toepassingen, waarbij slechts een klein deel van het genoom van klinisch belang zijn, hebben twee specifieke innovaties sequencing technologie transformerende geweest. Eerste, door middel van hybridisatie gebaseerde exon vastleggen, kan men isoleren DNA overeenkomt met de belangrijkste kanker-geassocieerde genen voor gerichte mutatie profilering 8. Ten tweede, door ligatie van moleculaire barcodes (dwz DNA-sequenties 6-8 nucleotiden lang), kan men honderden monsters per sequencing run bundelen en volledig te profiteren van de steeds toenemende capaciteit van massively parallel sequencing instrumenten 10. In combinatie zijn deze technieken ervoor tumoren worden geprofileerd voor lagere kosten en hogere doorvoer, met kleinere berekeningsvereisten 11. Verder, door een herverdeling opeenvolging dekking uitsluitend genen meest kritisch voor de specifieke toepassing, kan men Achieve grotere sequencing diepte voor een hogere gevoeligheid voor lage allelfrequentie evenementen.

Hier beschrijven we onze IMPACT test (Integrated Mutation Profileren van Actionable Cancer Doelen), die exon capture gebruikt op barcode sequentiebibliotheek zwembaden door hybridisatie met aangepaste oligonucleotiden alle eiwit-coderende exons vastleggen en selecteer introns van 279 belangrijkste kanker-geassocieerde genen (tabel 1 ). Deze strategie maakt de identificatie van mutaties, indels, kopij-aantal variaties, en selecteer structurele herschikkingen waarbij deze 279 genen. Onze methode is compatibel met DNA geïsoleerd uit zowel vriesverse en FFPE weefsel evenals naaldopzuigingen en andere cytologie exemplaren.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

1. DNA en Bereiding van het reagens

Opmerking: Dit protocol beschrijft de gelijktijdige verwerking en analyse van de 24 monsters (bijvoorbeeld 12 tumor / normaal paren), maar kan worden aangepast voor kleinere en grotere series. DNA-monsters kunnen ontlenen FFPE of vers ingevroren weefsel, cytologische monsters, of bloed. Meestal zal zowel tumor en normaal weefsel van dezelfde patiënt elkaar geprofileerd om somatische mutaties te onderscheiden van polymorfismen geërfd. Het protocol begint direct na DNA-extractie.

  1. Aliquot 50-250 ng (250 ng aanbevolen) geëxtraheerde DNA per monster, verdund in 1 x Tris-EDTA (pH 8,0) buffer tot een eindvolume van 50 pl, in afzonderlijke Covaris ronde bodem buizen.
  2. Shear het DNA op de Covaris E220 instrument op de volgende afschuiving instellingen: 360 seconden bij 10 inschakelduur, 175 PIP, en 200 cycli per burst.
  3. Ontdooi AMPure XP Beads (tabel 2) tot kamertemperatuur. Dooi alle buffers en enzymen op ijs voorafgaand aan het juiste stap.

2. Bibliotheek Voorbereiding - End Repair Module

  1. Bereid het einde reparatie master mix in een steriele microcentrifugebuis met de volgende hoeveelheden per monster: 10 ui 10X NEBNext End Repair Reaction Buffer (tabel 2), 5 pl NEBNext End Repair Enzyme Mix (tabel 2), 35 ul nuclease-vrij steriel H 2 O.
  2. Aliquot 50 pi van elke geknipt DNA in afzonderlijke putjes van een 96-wells plaat. Voeg 50 ul van de voorbereide einde reparatie master mix aan elke reactie. Incubeer in een thermocycler gedurende 30 min bij 20 ° C.

3. Bericht End Repair Clean-up

  1. Voeg 2x volume (200 pl) van AMPure XP Beads (tabel 2) aan elk monster en voorzichtig pipet het volledige volume omhoog en omlaag 10x met behulp van een multichannel pipet. Incubeer bij kamertemperatuur gedurende 15 minuten.
  2. Plaats op de magnetische standaard (tabel 2 ) bij kamertemperatuur gedurende 15 min, totdat het monster verschijnt duidelijk.
  3. Verwijder voorzichtig en helder supernatans verzorgen gooi geen parels verstoren. Sommige vloeistof in putten blijven.
  4. Met buizen op de voet voorzichtig voeg 200 ul van vers bereide 80% ethanol aan elk monster plaat en incubeer bij kamertemperatuur gedurende 30 sec. Voorzichtig, verwijder de ethanol met een pipet.
  5. Herhaal stap 5, voor een totaal van 2 ethanol wasbeurten. Zorg ervoor dat alle ethanol is verwijderd. Verwijder uit de magnetische standaard en laat drogen bij kamertemperatuur gedurende 5 minuten.
  6. Resuspendeer gedroogd kralen met 44,5 ul steriele H 2 O. Zachtjes, pipet gehele volume omhoog en omlaag 10x grondig mengen. Zorg kralen niet meer aan de zijkant van de put bevestigd.
  7. Incubeer geresuspendeerde korrels bij kamertemperatuur gedurende 2 minuten. Plaats op magnetische standaard voor 5 min, totdat het monster verschijnt duidelijk.
  8. Zacht overdracht 42 ul van heldere bovenstaande met het monster naar een nieuwe put.
    De procedure kan veilig worden gestopt bij deze step en monsters bewaard bij -20 ° C gedurende maximaal 7 dagen. Opnieuw op te starten, te ontdooien bevroren monsters op ijs voordat u verder gaat.

4. Bibliotheek Voorbereiding - dA-tailing Module

  1. Bereid de dA-tailing master mix in een steriele microcentrifugebuis met de volgende hoeveelheden per monster: 5 pl 10x NEBNext dA-tailing Reaction Buffer (Tabel 2), 3 pl (3'-5 'exo-) Klenow Fragment (tabel 2 ).
  2. Voeg 8 ul van de voorbereide dA-tailing master mix aan elk putje met 42 pi-end gerepareerd DNA. Incubeer in een thermocycler gedurende 30 minuten bij 37 ° C.
  3. Voer een post dA-tailing clean-up: Herhaal de stappen 3,1-3,8 behulp 2x volume (100 pl) van kralen, maar resuspendeer in steriele H 2 O tot een uiteindelijk volume van 33.75 pi.
    De procedure veilig in deze stap en monsters bewaard bij -20 ° C gedurende maximaal 7 dagen worden gestopt. Opnieuw op te starten, te ontdooien bevroren monsters op ijs voordat u verder gaat.

5. Bibliotheek Voorbereiding - adaptorligatie Module

  1. Bereid de Ligatie master mix in een steriele microcentrifugebuis met de volgende hoeveelheden per monster: 10 pi 5x NEBNext Quick Ligatie Reaction Buffer (New England Biolabs, tabel 2), 5 pl Quick T4 DNA Ligase (Tabel 2).
  2. Voeg 15 ul van de eileiders master mix aan elk putje met de dA-tailed DNA.
  3. Voeg 1,25 ul van de geschikte 25 uM NEXTflex barcode adapter (tabel 2) aan elk putje. Elk monster moet een aparte barcode adapter ontvangen. Incubeer in een thermocycler gedurende 15 min bij 20 ° C.
  4. Voer een bericht adapter ligatie clean-up: Herhaal stappen 3.1-3.8 met 1x volume (50 pl) van parels, maar resuspendeer in steriel H2O tot een eindvolume van 50 pi.
  5. Herhaal de stappen 3,1-3,8 voor een tweede 1x volume (50 pl) clean-up, maar resuspendeer in steriele H 2 O tot eeneindvolume van 23 pi.
    De procedure veilig in deze stap en monsters bewaard bij -20 ° C gedurende maximaal 7 dagen worden gestopt. Opnieuw op te starten, te ontdooien bevroren monsters op ijs voordat u verder gaat.

6. Bibliotheek Amplification

  1. Bereid de KAPA HiFi master mix in een steriele microcentrifugebuis met de volgende hoeveelheden per monster: 25 ul 2x KAPA HiFi HS RM (Tabel 2), 1 pi van elk 100 uM Primer 1 en Primer 2 (Tabel 3).
  2. Voeg 27 ul van de master mix aan elk van de ligatieproduct putje met. Stel pipet 50 pi en voorzichtig pipet het volledige volume omhoog en omlaag 10x.
  3. Plaats in de thermocycler voor de volgende PCR-cycli: initiële denaturatie van 45 seconden bij 98 ° C, 10 cycli van 15 sec bij 98 ° C, 30 seconden bij 60 ° C, 30 seconden bij 72 ° C en laatste verlenging van 1 min bij 72 ° C.
  4. Voer een post versterking clean-up: Herhaal de stappen 3,1-3,8 gebruik1x volume (50 pl) van AMPure XP kralen en resuspendeer in steriel water tot een eindvolume van 30 pi.
  5. Kwantificeer de concentratie van elke bibliotheek met qubit BroadRange Assay (Life Technologies, tabel 2) volgens de instructies van de fabrikant.

7. Roche Nimblegen SeqCap EZ Bibliotheek hybridisatie, wassen, en Amplification

  1. Dooi universeel en index oligonucleotide blokkers (tabel 3), SeqCap EZ Bibliotheek en Nimblegen capture componenten (COT DNA, 2x hybridisatie buffer, en hybridisatie component A, tabel 2) op ijs. Alle oligonucleotide blokkers worden in werkvoorraden van 1 mM. Onze SeqCap EZ Library is een op maat ontworpen zwembad van vangprobes die alle proteïne-coderende exons van 279 kanker-geassocieerde genen, hoewel andere maat en catalogus ontwerpen kunnen worden gebruikt.
  2. Bereid een 1 mM pool van index oligonucleotide blokkers overeenstemming met de specifieke barcode advertentieAptor die worden gebruikt in de bibliotheek voorbereiding. Combineer 1 pi van elke blocker, en vortex.
  3. In een nieuwe steriele 1,5 ml microcentrifugebuis, voeg 5 ul 1mg/ml COT DNA, 2 ui 1 mM universele blocker en 2 ui van de 1 mM plas index oligonucleotide blokkers.
  4. Pool 24 barcode bibliotheken in een enkele reactie. Voeg een totaal van 1-3 ug van gepoolde, barcodes sequentiebibliotheek (boven bereide) om de vangst mengsel. Voor 24 monsters, wordt 100 ng per monster aanbevolen. Bij pooling tumoren en gematched normale monsters, we aanbevolen toevoegen van meer tumor bibliotheek (bijv. 100 ng per tumor en 50 ng per normaal) zodat ze gesequenced om diepere dekking.
  5. Sluit dop van de buis en maak 15-20 gaten in de bovenkant van de dop met een 18-20 G naald of kleiner. Speed ​​Vac de versterkte samplebibliotheek / COT DNA / oligo's in een DNA vacuümconcentrator op hoog vuur (60 ° C).
  6. Eenmaal volledig opgedroogd neer, rehydrateren met 7,5 ul van 2x hybridisatie buffer en 3 pi van hybridisatie component A. De buis moet nu het volgende bevatten: 5 ug COT DNA, variabele ug versterkt sample-bibliotheek, 1000 pmol van Universal en Index Oligos, 7,5 ul 2x hybridisatie buffer, 3 ul hybridisatie component A in een totaal volume van 10,5 pl.
  7. Bedek de gaten in de dop met een klein stukje van het laboratorium tape. Vortex het monster gedurende 10 seconden en centrifugeer op maximale snelheid gedurende 10 sec.
  8. Incubeer het monster bij 95 ° C gedurende 10 minuten om het DNA te denatureren, gevolgd door centrifugatie bij maximale snelheid gedurende 10 seconden bij kamertemperatuur.
  9. In een nieuwe 0,2 ml PCR strip buis bereiden 2,25 pi aliquot SeqCap EZ Bibliotheek invangingsprobes en 2,25 pi steriel nuclease-vrij H2O en voeg de inhoud van stap 7.7. Voorzichtig pipet het gehele volume omhoog en omlaag 10x.
  10. Incubeer in een thermische cycler bij 47 ° C gedurende 48-96 uur. Set en deksel temperatuur van de PCR-apparaat te handhaven tot 57 ° C.
  11. Follage stappen in hoofdstuk 6 van de NimbleGen SeqCap EX Bibliotheek SR Handleiding v3.0 (tabel 2) voor het wassen en het herstel van de gevangen DNA.
  12. Volgt stappen in hoofdstuk 7 van de Roche NimbleGen protocol voor versterking van de gevangen DNA met de volgende wijzigingen:
    • Gebruik 2x KAPA HiFi Polymerase (tabel 2) in plaats van Phusion High-Fidelity PCR Master Mix
    • Gebruik 100 uM Primer 1 en Primer 2 in tabel 3.
    • Voer de volgende PCR-omstandigheden: initiële denaturatie bij 98 ° C gedurende 30 seconden, 11 cycli van 98 ° C gedurende 10 seconden, 60 ° C gedurende 30 seconden, 72 ° C gedurende 30 sec en uiteindelijke verlenging bij 72 ° C gedurende 5 min . Op 4 ° C.
  13. Kwantificeer de concentratie van het geamplificeerde DNA ingenomen met qubit High Sensitivity Test (Tabel 2) volgens de instructies van de fabrikant.
  14. Analyseer de gevangen DNA kwaliteit met behulp van Agilent Bioanalyzer DNA GS chip (tabel 2) volgens de instructies van de fabrikant.
    • De PCR-opbrengst moet ten minste 100 ng (range 100-1000 ng) zijn.
    • De gemiddelde fragmentlengte moet tussen 150-400 baseparen.

8. Illumina Hi-Seq Sequencing

  1. Verdun de versterkte gevangen DNA om 14:00, en plaats het monster op een enkele rijstrook van een Illumina HiSeq 2000 stroom cel. Sequence gepaarde-end 75 basenparen leest volgens de instructies van de fabrikant. In onze ervaring, een rijstrook is voldoende om 500-700X unieke sequentie dekking per monster te produceren over 279 genen voor een pool van 24 monsters.
  2. Illumina software (Real Time Analysis) zal hoge-resolutie afbeeldingen te converteren naar cluster intensiteiten om oproepen en kwaliteit scores baseren. Gebruik Casava om gegevens demultiplex volgens barcode identiteit en het genereren van individuele FASTQ bestanden voor elk monster.

9. Gegevens Anallyse

  1. Trim adapter sequenties van het 3 'uiteinde van de sequentie leest FASTQ bestanden met Cutadapt ( http://code.google.com/p/cutadapt/ ). De minimale overlap lengte (-O) is 3 met een foutenmarge (-e) van 1%. De minimale basis lengte voor behoud van gepaarde leest na het trimmen is 25.
  2. Stemmen volgorde leest de referentie menselijk genoom hg19 met de Burrows-Wheeler Aligner gereedschap (BWA) 12. Voer stappen post-verwerking, met inbegrip van dubbele markering, lokale multiple sequence herschikking, en de basis kwaliteitsscore herijking met behulp van de Genome Analysis Toolkit (GATK) volgens hun standaard best practices ( http://www.broadinstitute.org/gatk/guide/topic? name = best-practices ) 13. Wanneer profileren meerdere monsters van dezelfde patiënt (bijv. afgestemd tumor en normaal), moeten de lokale multiple sequence herschikking prestaties zijnMed gezamenlijk. De output van deze na-verwerkingsstappen is een apart BAM bestand voor elk monster, die alle sequentie, kwaliteit en uitlijning bevat en kan direct worden geladen in de Integrative Genomics Viewer (belastingen) voor visualisatie van leest en sequentievarianten 14.
  3. Bereken volgorde prestatiecijfers behulp Picard gereedschap ( http://picard.sourceforge.net/ ). Informatieve metrics omvatten uitlijning tarief, fragment grootteverdeling, GC-gehalte geassocieerd dekking bias, on-target capture specificiteit, PCR dupliceren tarief, bibliotheek complexiteit, en betekenen beoogde dekking. Representatieve waarden worden getoond in Figuur 1. Allel frequenties gemeenschappelijke polymorfisme plaatsen berekend met DepthOfCoverage van GATK worden gebruikt om verontreiniging te controleren van niet-verbonden DNA en waarborgen die aan monsters uit dezelfde patiënten.
    De volgende rekenkundige analyses afhankelijk van de aanwezigheid van matchedtumor en normale monsters voor de detectie van somatische veranderingen. Unmatched tumoren kunnen ook worden geanalyseerd met een afzonderlijk normale controlemonster, maar de meeste somatische mutaties kunnen niet gemakkelijk worden onderscheiden van erfelijke sequentie varianten.
  4. Bel somatische single nucleotide varianten (SNVs) voor elke tumor-normaal paar met behulp van een somatische mutatie beller, zoals muTect 15 SomaticSniper 16 of Strelka 17. Wij gebruiken muTect met gemodificeerde filtercriteria, waardoor varianten met lage (niet-nul) allel tellingen in de normaal monster zolang het allel frequentie tenminste 5x groter in de tumor. Varianten herhaaldelijk genoemd in een panel van normale DNA's worden verwijderd als waarschijnlijk systematische artefacten van sequencing of uitlijning. Elke SNV passeren filters wordt vervolgens zorgvuldig beoordeeld met behulp van IGV.
  5. Bel somatische indels voor elke tumor-normaal paar met behulp van algoritmen, zoals SomaticIndelDetector 13, Dindel 18 of SOAPindel 19 . Wij gebruiken SomaticIndelDetector met de volgende criteria: ten minste 10% allel frequentie tenminste 3 ondersteunen leest, of tenminste 2% allel frequentie tenminste 10 ondersteunen leest. Wij staan ​​voor indels lage (niet-nul) allel tellingen in de normaal monster zolang het allel frequentie tenminste 5x groter in de tumor. Indels genoemd in een panel van normale DNA verwijderd, zoals hierboven. Elke Indel passeren filters wordt vervolgens zorgvuldig beoordeeld met behulp van IGV.
  6. Extrapoleren aantal kopieën de status van de sequentie dekking at target exons. Voor elk individueel monster, het uitvoeren van een löss normalisering van de gemiddelde sequentie dekking voor alle doelgroepen exons, regressie dan GC percentage. Pas de dekking niet genormaliseerde waarden door het aftrekken van de löss pasvorm en het toevoegen van het monster-brede mediaan dekking. Bereken de verhouding in genormaliseerde volgorde dekking voor alle beoogde exonen voor tumor-normale paren. Aangezien een matched normaal monster en / of ruis te verminderen, andere geslacht gematchte diploïdenormale controles ontbreekt kiemlijn kopieaantal varianten kunnen worden gebruikt. Bepaal somatische aantal kopieën winsten en verliezen op basis van stijgingen of dalingen van de dekkingsgraad.
  7. Bel somatische herschikkingen waarbij kankergenen waarbij ten minste een genomische breekpunt in of dichtbij een gerichte interval van het genoom valt. Stelde algoritmes omvatten GASV 20, Breakdancer 21, CREST 22, en Dranger 23. Intrachromosomale inversies, deleties en duplicaties tandem worden onderscheiden op basis van de relatieve positie en oriëntatie van ondersteunende leest strijdige paren. Alle kandidaat-herschikkingen moeten handmatig worden beoordeeld met behulp van IGV. Wij raden experimentele validatie van PCR en Sanger sequencing over de vermeende omlegging breekpunten.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

Een zwembad van 24 barcodes sequentie bibliotheken (12 tumor-normaal paren) werd vastgelegd met behulp van sondes die overeenkomen met alle eiwit-coderende exons van 279 kankergenen en de sequentie als 2 x 75 bp leest op een enkele rijstrook van een HiSeq 2000 flow cel. Tumor en normale banken werden samengevoegd in een 2:1 verhouding. Voorbeeld prestatiegegevens voor een pool van bevroren tumor DNA monsters zijn getoond in figuur 1, onder andere aanpassing snelheid, fragment grootteverdeling, on-target...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

Onze IMPACT test produceert een hoge uitlijning, hoge on-target rate, high beoogde dekking en een hoge gevoeligheid voor het opsporen van mutaties, indels, en kopieer aantal veranderingen. We hebben het vermogen van onze IMPACT test aangetoond sequentie DNA van zowel vriesverse en gearchiveerd FFPE monsters van lage DNA-ingang. Door het uitvoeren van gerichte exon sequencing van de belangrijkste kanker-geassocieerde genen, kan men zeer diep volgorde dekking te bereiken voor de exons van deze meest kritieke genen waardoo...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

Dr Berger heeft adviseurskosten en onderzoeksfinanciering ontvangen van Stichting Medicine, een kankerdiagnostiek bedrijf.

Dankbetuigingen

Wij danken dr. Agnes Viale en de MSKCC Genomics Core Laboratorium voor technische ondersteuning. Dit protocol werd ontwikkeld met steun van de Geoffrey Beene Cancer Research Center en de Stichting Farmer Family.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
NEBNext End Repair ModuleNew England BiolabsE6050L 
NEBNext dA-Tailing ModuleNew England BiolabsE6053L 
NEBNext Quick Ligation ModuleNew England BiolabsE6056L 
Agencourt AMPure XPBeckman Coulter Genomics 
NEXTflex PCR-Free Barcodes – 24Bioo Scientific514103 
HiFi Library Amplification KitKAPA BiosystemsKK2612 
COT Human DNA, Fluorometric GradeRoche Diagnostics05 480 647 001 
NimbleGen SeqCap EZ Hybridization and Wash kitRoche NimbleGen05 634 261 001 
SeqCap EZ Library BaitsRoche NimbleGen 
QIAquick PCR Purification KitQiagen28104 
Qubit dsDNA Broad Range (BR) Assay KitLife TechnologiesQ32850 
Qubit dsDNA High Sensitivity (HS) Assay KitLife TechnologiesQ32851 
Agilent DNA HS KitAgilent Technologies5067-4626, 4627 
Agilent 2100 BioanalyzerAgilent Technologies 
Covaris E220Covaris 
Magnetic Stand-96AmbionAM10027 
Illumina Hi-Seq 2000Illumina 

Referenties

  1. Stratton, M. R., Campbell, P. J., Futreal, P. A. The cancer genome. Nature. 458 (7239), 719-724 (2009).
  2. Meyerson, M., Gabriel, S., Getz, G. Advances in understanding cancer genomes through second-generation sequencing. Nat. Rev. Genet. 11 (10), 685-696 (2010).
  3. Thomas, R. K., Baker, A. C., Debiasi, R. M., et al. High-throughput oncogene mutation profiling in human cancer. Nat. Genet. 39 (3), 347-351 (2007).
  4. Macconaill, L. E., Campbell, C. D., Kehoe, S. M., et al. Profiling critical cancer gene mutations in clinical tumor samples. PLoS One. 4 (11), e7887(2009).
  5. Dias-Santagata, D., Akhavanfard, S., David, S. S., et al. Rapid targeted mutational analysis of human tumours: a clinical platform to guide personalized cancer medicine. EMBO Mol. Med. 2 (5), 146-158 (2010).
  6. Macconaill, L. E., Van Hummelen, P., Meyerson, M., Hahn, W. C. Clinical implementation of comprehensive strategies to characterize cancer genomes: opportunities and challenges. Cancer Discov. 1 (4), 297-311 (2011).
  7. Taylor, B. S., Ladanyi, M. Clinical cancer genomics: how soon is now. J. Pathol. 223 (2), 318-326 (2011).
  8. Gnirke, A., Melnikov, A., Maguire, J., et al. Solution hybrid selection with ultra-long oligonucleotides for massively parallel targeted sequencing. Nat. Biotechnol. 27 (2), 182-189 (2009).
  9. Mamanova, L., Coffey, A. J., Scott, C. E., et al. Target-enrichment strategies for next-generation sequencing. Nat. Methods. 7 (2), 111-118 (2010).
  10. Craig, D. W., Pearson, J. V., Szelinger, S., et al. Identification of genetic variants using bar-coded multiplexed sequencing. Nat. Methods. 5 (10), 887-893 (2008).
  11. Wagle, N., Berger, M. F., Davis, M. J., et al. High-throughput detection of actionable genomic alterations in clinical tumor samples by targeted, massively parallel sequencing. Cancer Discov. 2 (1), 82-93 (2012).
  12. Li, H., Durbin, R. Fast and accurate short read alignment with Burrows-Wheeler transform. Bioinformatics. 25 (14), 1754-1760 (2009).
  13. Depristo, M. A., Banks, E., Poplin, R., et al. A framework for variation discovery and genotyping using next-generation DNA sequencing data. Nat. Genet. 43 (5), 491-498 (2011).
  14. Robinson, J. T., Thorvaldsdottir, H., Winckler, W., et al. Integrative genomics viewer. Nat. Biotechnol. 29 (1), 24-26 (2011).
  15. Cibulskis, K., Lawrence, M. S., Carter, S. L., et al. Sensitive detection of somatic point mutations in impure and heterogeneous cancer samples. Nat. Biotechnol. 31 (3), 213-219 (2013).
  16. Larson, D. E., Harris, C. C., Chen, K., et al. SomaticSniper: identification of somatic point mutations in whole genome sequencing data. Bioinformatics. 28 (3), 311-317 (2012).
  17. Saunders, C. T., Wong, W. S., Swamy, S., Becq, J., Murray, L. J., Cheetham, R. K. Strelka: Accurate somatic small-variant calling from sequenced tumor-normal sample pairs. Bioinformatics. 28 (14), 1811-1817 (2012).
  18. Albers, C. A., Lunter, G., Macarthur, D. G., Mcvean, G., Ouwehand, W. H., Din del Durbin, R. Accurate indel calls from short-read data. Genome Res. 21 (6), 961-973 (2011).
  19. Li, S., Li, R., Li, H., et al. Efficient identification of indels from short paired reads. Genome Res. 23 (1), 195-200 (2013).
  20. Sindi, S., Helman, E., Bashir, A., Raphael, B. J. A geometric approach for classification and comparison of structural variants. Bioinformatics. 25 (12), 222-230 (2009).
  21. Chen, K., Wallis, J. W., Mclellan, M. D., et al. BreakDancer: an algorithm for high-resolution mapping of genomic structural variation. Nat. Methods. 6 (9), 677-681 (2009).
  22. Wang, J., Mullighan, C. G., Easton, J., et al. CREST maps somatic structural variation in cancer genomes with base-pair resolution. Nat. Methods. 8 (8), 652-654 (2011).
  23. Drier, Y., Lawrence, M. S., Carter, S. L., et al. Somatic rearrangements across cancer reveal classes of samples with distinct patterns of DNA breakage and rearrangement-induced hypermutability. Genome Res. 23 (2), 228-235 (2012).
  24. Wang, Z., Gerstein, M., Snyder, M. RNA-Seq: a revolutionary tool for transcriptomics. Nat. Rev. Genet. 10 (1), 57-63 (2009).
  25. Roychowdhury, S., Iyer, M. K., Robinson, D. R., et al. Personalized oncology through integrative high-throughput sequencing: a pilot study. Sci. Transl. Med. 3 (111), 111ra121 (2011).
  26. Kerick, M., Isau, M., Timmermann, B., et al. Targeted high throughput sequencing in clinical cancer settings: formaldehyde fixed-paraffin embedded (FFPE) tumor tissues, input amount and tumor heterogeneity. BMC Med. Genomics. 4, 68(2011).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Somatische mutatiesDNA bibliotheken met barcodeshybridisatiecapturekopie aantalvariatiesstructurele herschikkingenFFPE weefselmonsterskankergenomicanext generation sequencing

Gerelateerde artikelen