Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

Functionele Ondervraging van Adult hypothalamus Neurogenese met Focal Radiologische Remming

11.7K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/50716

⸱

14 november 2013

 ,  ,  ,  ,  , 
1Division of Biology, California Institute of Technology, 2Solomon H. Snyder Department of Neuroscience, Neurology, and Ophthalamology, Johns Hopkins University School of Medicine, 3Department of Radiation Oncology & Molecular Radiation Sciences, Johns Hopkins University School of Medicine, 4Department of Radiation Oncology, University Of Washington Medical Center, 5Institute for Cell Engineering and High-Throughput Biology Center, Johns Hopkins University School of Medicine

In dit artikel

Samenvatting

De functie van zoogdieren neuronen-volwassene geboren blijft een actief gebied van onderzoek. Ioniserende straling remt de geboorte van nieuwe neuronen. Met computer-tomografie geleide focale bestraling (CFIR), kunnen driedimensionale anatomische targeting van specifieke neurale populaties nu worden gebruikt om de functionele rol van volwassen neurogenese beoordelen.

Samenvatting

De functionele karakterisering van volwassen geboren neuronen blijft een belangrijke uitdaging. Benaderingen van volwassen neurogenese te remmen via invasieve virale levering of transgene dieren hebben potentiële verwart dat de interpretatie van de resultaten moeilijk te maken uit deze studies. Nieuwe radiologische gereedschappen zijn in opkomst, echter, die het mogelijk maken een om niet-invasief onderzoek naar de functie van geselecteerde groepen van volwassen geboren neuronen door middel van nauwkeurige en precieze anatomische targeting in kleine dieren. Focal ioniserende straling remt de geboorte en differentiatie van nieuwe neuronen en kan targeting van specifieke neurale gebieden. Met het oog op de mogelijke functionele rol die volwassen hypothalamus neurogenese speelt in de regulatie van fysiologische processen belichten, ontwikkelden we een niet-invasieve focale bestraling techniek om de geboorte van volwassen geboren neuronen in de hypothalamus mediaan eminentie selectief remmen. We beschrijven een werkwijze voor C omputer-tomografie geleidef okale ir straling (CFIR) levering aan precieze en accurate anatomische targeting in kleine dieren mogelijk te maken. CFIR maakt gebruik van drie-dimensionale volumetrische beeldgeleiding voor lokalisatie en de gerichtheid van de stralingsdosis, minimaliseert de blootstelling aan straling te nontargeted hersengebieden, en zorgt voor conforme dosisverdeling met scherpe bundel grenzen. Dit protocol maakt het mogelijk om vragen met betrekking tot de functie van volwassen geboren neuronen vragen, maar opent ook gebieden op vragen op het gebied van radiobiologie, tumor biologie en immunologie. Deze radiologische instrumenten zal de vertaling van de ontdekkingen op de bank te vergemakkelijken aan het bed.

Inleiding

Recente ontdekkingen hebben aangetoond dat de volwassen hersenen van zoogdieren een opmerkelijke mate van plasticiteit kan ondergaan. -Volwassen geboren neuronen worden gegenereerd door volwassenheid in gespecialiseerde niches van de hersenen van zoogdieren 1. Wat is de functie van deze volwassen geboren neuronen? En meer nog, ze een rol in de fysiologie en gedrag spelen? Studies over dit onderwerp zijn van oudsher gericht op de subventricular zone van de laterale ventrikels en de subgranulaire zone van de hippocampus, maar recente studies hebben neurogenese gekenmerkt in andere hersengebieden zoals de zoogdieren hypothalamus 2. Neurogenese is gemeld bij de postnatale en volwassen hypothalamus 2-10, en de functie van deze pasgeboren neuronen van de hypothalamus blijft een actief gebied van onderzoek.

De functionele karakterisering van volwassen geboren neuronen blijft een belangrijke uitdaging voor het veld neurowetenschappen in het algemeen. Selectieve remming van specific neurale voorlopercellen bevolking blijft beperkt door het gebrek aan beschikbare moleculaire merkers die uniek zijn voor enkele neurale voorlopercellen bevolking 11 zijn. Zo selectieve verwijdering van volwassen geboren neuronen van deze neurale voorlopercellen via genetische targeting blijft moeilijk. Ook virale levering aan-volwassen geboren neuronen richten lijdt aan potentiële verstorende variabelen zoals de invoering van verwondingen en ontstekingen in het milieu 12.

Nieuwe radiologische gereedschappen zijn in opkomst, echter, die het mogelijk maken een tot deze verwart omzeilen en onderzoeken deze vragen door middel van nauwkeurige en precieze anatomische targeting in kleine dieren. Ioniserende straling remt de geboorte en differentiatie van nieuwe neuronen en maakt een niet-invasieve methode om neurale populaties richten 13-15. Onlangs beschreven we een germinal regio van de zoogdieren hypothalamus mediaan eminentie (ME) die wij genoemd de hypothalamus proliferatieve zone (HPZ) 2 . We vonden dat wanneer jonge vrouwelijke muizen volwassen kregen een vetrijk dieet (HFD), niveaus van neurogenese in HFD-gevoede muizen waren aanzienlijk hoger dan hun normale voer (NC) gevoed controles op dit ME regio 2. Om te testen of volwassen neurogenese in de hypothalamus ME reguleert de stofwisseling en gewicht, hebben we getracht dit proces te verstoren. De mediane eminentie een klein eenzijdige structuur aan de basis van de derde ventrikel waaruit regulerende hormonen vrijkomen. Om wildgroei en de daaropvolgende neurogenese remmen zonder dat de andere fysiologische functies van dit hersengebied, ontwikkelden we een niet-invasieve focale bestraling techniek om de geboorte van de nieuw geboren volwassen neuronen in de hypothalamus mediaan eminentie 2 selectief remmen.

Een aantal groepen in dienst straling om neurogenese te onderdrukken in canonieke regio's 14-28. Echter, vorige radiologische benaderingen algemeen gerichte grote gebieden, of often onbedoeld ook gerichte verschillende hersengebieden waar neurogenese gerapporteerd, waardoor het moeilijk om ondubbelzinnig koppelen elke gedragstekorten waargenomen defecten in specifieke neurale populaties. De mogelijkheid om meer gerichte bestraling wordt geleverd door radiologische platforms die c omputer-tomografie begeleide imaging combineren met f ocal bundel ir straling (CFIR) levering aan precieze anatomische targeting 29-36 mogelijk te maken. Stralingsbundels zo klein als 0,5 mm in diameter zijn specifieke neurale populaties 35 richten. Deze methode laat ons toe om de hypothalamus ME richten en te arresteren proliferatie en blokkeren neurogenese in kleine dieren. Na radiologische behandeling van deze voorlopercellen bevolking, kan fysiologische en gedragsmatige testen worden uitgevoerd om de potentiële functie van volwassen geboren cellen te verlichten. Focal targeting is vooral belangrijk voor onze toepassing, omdat dehypofyse ligt dicht bij de hypothalamus mediaan eminentie, bestraling van de hypofyse kan hormonale functie beïnvloeden en vervolgens de resultaten te beschamen.

De biologische basis voor de onderdrukking van neurogenese na bestraling nog steeds onduidelijk. Vorige straling studies hebben zich op grote oppervlakte balken, en hebben geconcludeerd dat de onderdrukking van neurogenese wordt gemedieerd door een ontstekingsreactie 14, 37. Als zodanig is het onduidelijk of zeer focale bestraling neurogenese kan onderdrukken, aangezien geen aanzienlijke ontstekingsreactie opwekken. Echter, recente studies door onze groep van de klassieke neurogene gebied in de hippocampus hebben aangetoond dat zeer focale bestraling met een dosis van 10 Gy neurogenese kan onderdrukken gedurende tenminste 4 weken na bestraling 35.

Om de functie van volwassen geboren neuronen van de hypothalamus in de mediaan eminentie ondervragen, maken we gebruik van een precisie straling device kan leveren CT beeldvorming in combinatie met een kleine diameter stralingsstralen om neurogenese te remmen ME. Met een röntgenbuis gekoppeld aan een portaal dat draait over een bereik van 360 °, leveren wij arc-beam micro bestraling licht met behulp van een robot gestuurde Model fase waardoor rotatie van een dierlijke patiënt tijdens bestraling (figuur 1) . Een hoge resolutie röntgendetector wordt gebruikt om beelden te verkrijgen wanneer de balk in de horizontale stand 33. Voor dit onderzoek werden CT beelden gereconstrueerd met een isotrope voxel grootte van 0,20 mm. On-board CT kon de identificatie van een doel, terwijl het dier de behandeling plaats. De doelstelling werd gelokaliseerd met behulp van de CT navigatie dosis-planning software, die was met onze commercieel beschikbare radiologische platform. Na het lokaliseren van onze ROI door CT-beeldvorming, werd het dier naar de juiste behandeling positie bewogen door de robotachtige specimen stadium dat vier graden heeftrees van vrijheid (X, Y, Z, θ). Door een combinatie van portaal en robot fase hoeken kunnen stralen worden geleverd vanuit bijna elke richting ten opzichte van het dier en stereotactische boogvormige behandelingen mogelijk 29. Voor deze en alle andere beeldvormende onderzoeken, werden de muizen geplaatst in een immobilisatie-apparaat dat de levering van verdoving isofluraan gas toestaat terwijl het beperken van beweging. De immobilisatie bed is CT-compatibel, en maakt verbinding met de robot monster etappe 34.

We verwachten dat CFIR conceptuele vooruitgang zal bieden in een aantal onderzoeksgebieden. Hoewel we gebruik van radiologische targeting van de hypothalamus mediaan eminentie als bewijs van het principe van deze techniek, kan CFIR worden gebruikt om een ​​deel van het lichaam van een klein model organisme in principe richten. In de neurologie, bijvoorbeeld ogen we deze techniek kan worden gebruikt om de functie van actief proliferatieve voorlopercellen populaties die zijn voorgesteld exis evaluerent in andere circelvormige, zoals het gebied postrema 38, 39, subfornicaal orgaan 40 en de hypofyse 41. Langdurige controverses over de functionele rol van de volwassen neurogenese en het identificeren van een causale rol in het gedrag kan nu ook beter worden aangepakt. In zangvogel, kan deze techniek de rol van volwassen neurogenese behoud van de robuuste en seizoensgedrag van de vogels 42 die wordt belemmerd door het vermogen om selectief te remmen neurogenese in specifieke hersengebieden pakken. Inzicht in deze robuuste behavioral model zou nieuw inzicht te werpen op de rol van de volwassen neurogenese in het reguleren van andere seksueel dimorf gedrag. Ook bij het metabool gebied CFIR kan worden gebruikt om aspecten van de rol van de proliferatie van levercellen en zijn rol in het metabolisme en energiebalans verkennen. De mogelijkheid voor conceptuele vooraf verschillende onderzoeksdisciplines wordt verbeterd door de introductie van deze techniek.

In dit artikel laten we zien de mogelijkheden van CFIR voor nauwkeurige anatomische targeting van een focale bestraling balk. Hoewel we in eerste instantie ontwikkeld dit kleine dier straling onderzoeksplatform (SARRP) voor onze studies, andere soortgelijke apparaten zijn nu commercieel beschikbaar die vergelijkbaar-CT-geleide focale bestraling 43, 44 kunnen bereiken. Vandaar generaliseren we dit CFIR protocol met stappen die nodig zijn voor alle research platforms in plaats van die specifiek voor SARRP. De voordelen van CFIR dan eerdere benaderingen radiologische neurogenese remmen zijn dat deze techniek maakt driedimensionale volumetrische beeldbegeleiding voor lokalisatie en richten van de dosis, conforme dosis minimaliseert blootstelling aan nontargeted hersengebieden en hoge precisie balansgeometrie maakt conforme dosisverdeling met scherpe bundel grenzen. We geven een overzicht van CT-geleide beeldvorming gebruiken om de dosis te richten op een bepaalde anatomische regio, en op die manier hoe de straling te visualiserendosisverdeling direct in weefsel met behulp van immunohistochemische kleuring voor γ-H2AX, een merker van DNA dubbelstrengs breuken 35, 45-48. Het gebruik van deze benadering voor selectieve bestraling van neurogene niches belangrijke implicaties kunnen hebben in het openbaren van de functionele rol van nieuwe volwassen geboren neuronen op fysiologie en ziekte.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

Animal Gebruik

Verkrijgen goedkeuring van institutionele Animal Care en gebruik Comite voor standaard zorg en gebruik protocollen. Het huidige protocol is ontwikkeld voor focale stralingsstudies op 5,5-10 weken oude volwassen C57BL6 / J muizen zoals eerder beschreven (figuur 2) 2. Echter, andere leeftijden en kleine diersoorten (ratten, hamsters, grondeekhoorns, etc.) kunnen ook worden gebruikt, op voorwaarde dat doeltreffende anesthesie protocollen en een radiografische verwijzing atlas voor de identificatie van de regio van belang (ROI) zijn beschikbaar.

1. Kalibratie van CT-geleide Radiologische Platform

Voer-film gebaseerd kalibraties voor stralingsdosis op de radiologische platform bij voorbaat voor elke collimator grootte en het type van X-ray tube filter gebruikt. Om een boog straal van bestraling richten op de gewenste doellocatie, gebruik dan de stralingsdosis-planningssoftware 49 beschike meeste commerciële straling platforms gewenste levertijd berekenen op basis van de stralingsdosis, de diepte van het gebied van belang (ROI) gebaseerd op CT-scans van de muis, en de rotatiesnelheid van de robotica platform, details hierover zijn weggelaten van dit protocol als zij verschillen tussen straling platforms. Ten behoeve van het visualiseren ventrobasal hypothalamus 2 (figuur 3) met CT, werken de röntgenbuis met een 0,4-mm brandpunt en stralingsenergie van 100 kVp met 1 mm Al filtratie. Voor focale bestraling van de HPZ, bedienen de röntgenbuis bij 225 kVp, 13 mA, en een 1 mm brandpunt met een filteroppervlak van 0,15 mm Cu, tot 10 Gy straling leveren tegen een weefsel diepte van 0,6 cm in een behandelperiode tijd van 4,6 minuten. Targeting verschillende ROI vereist berekenen verschillende parameters.

  1. Bij het ​​bestuderen van de effecten van vetrijke dieet op neurogenese in de mediane eminentie zoals eerder beschreven 2, vinden vier weken oude vrouwelijke C57BL6 / J muizen uit Jackson Mouse laboratoria, en het huis vier muizen per kooi. Schakel eten van normaal voer een vetrijk dieet na vijf weken oud. Laat muizen te wennen aan nieuwe huisvesting en voedsel. Voer CFIR behandeling bij 5,5 weken oud. Transport onderwerpt aan de operatie kamer dat de radiologische platform bevat. Minimaliseer stress tijdens de overdracht. Bereid isofluraan gas anesthesie kamer. Voeg vervolgens een enkele muis in de kamer. Tegelijkertijd bereiden verwarming pad (lage stand) voor de nabehandeling.
  2. Zodra muis is onder en niet meer reageren op mond-pad compressie, breng het onder de radiologische platform en plaats op de immobilisatie bed van de robot podium. Plaats mond onderwerp in de neuskegel anesthesie cup, en tanden in de bijt blok (figuur 1D). Leg muis plat op de immobilisatie bed en controleer of het blijft ongevoeligheid handhaven. Zo ja, band naar beneden muis om het bed met gaas tape. Terwijl taping de muis om het bed, Zorg ervoor dat het hoofd wordt genivelleerd tot een horizontaal vlak. Dit kan worden bepaald door aan de oren en kijken of zij worden genivelleerd. Zodra de muis in de juiste positie, sluit de leiding beschermplaat.
  3. Het verwerven van de computer-tomografie scan met software aan boord van radiologische platform de experimentator (dit verschilt tussen de platformen), die een driedimensionale anatomische structurele scan van de muis onderwerp zal bieden. Controleer of de muis hoofd waterpas van het horizontale vlak. Zo niet, herhaal dan de stappen 1,2-1,3 tot hoofd van het onderwerp wordt genivelleerd.
  4. Identificeer ROI CT-beeld door. Bereken afstand van ROI naar het oppervlak van de schedel met een 45 ° hoek met het horizontale vlak zoals getoond in figuur 3E.
  5. Met behulp van software aan boord, neem een X-ray van de muis onderwerp van bovenaf zoals weergegeven in figuur 4A. Verwijder vervolgens de muis van de radiologische platform, op verwarming pad en controleren totdat actief.
  6. Uit de coronale CT-beelden, berekent de gemiddelde ROI anatomische diepte van ten minste drie muizen om de uitvoering dosering te bepalen. Als voorbeeld uit een eerdere studie 2 waar 10 Gy bestraling werd toegediend aan de ventrobasal hypothalamus, de diepte van de ROI van de schedel (vanuit een hoek van 45 °) is 0,66 cm (zie figuur 3E). Wetende dat, gebruikten de onderzoekers de dosis planning software (DPS) op hun radiologische platform geïnstalleerd om het juiste toerental en duur van de behandeling te berekenen om de gewenste dosering te verkrijgen om de ROI.
  7. Na het bepalen behandelingsduur en rotatiesnelheid van de robot podium met de dosis-planningssoftware meten dosisverdeling van de berekende parameters Gafchromic stralingsgevoelige films ingebed in een trace kunststof mock-muismodel. Om dit te doen, insluiten drie Gafchromic stralinggevoelig films tussen vier verticaal gestapelde-water equivalent plastic blokken 29 alszie figuur 4B.
  8. Plaats mock muismodel met Gafchromic films op robotachtige podium, en lopen de focale bestraling bundel met de nieuw berekende parameters. Bijvoorbeeld, de ventrobasal hypothalamus, inputdoel de parameters van 0,15 mm Cu filter, 225 kVp, 13 mA, 1-mm stralingsbundel instelling 45 ° prismahoek, 1,3 ° / sec rotatie en 4,6 min met een ROI bereiken radiologische dosis van 10 Gy.
  9. Na bestraling, controleer films voor patroon en de intensiteit van de straling dosering. Voor een 360 ° hoek rotatie met de opgesomd om ventrobasal hypothalamus, een donkere ring in de film boven de isocentrum, een kleine heldere plek aan de isocentrum film, en een lichtere ring in de film onder de isocentrum overeenkomt met de kegel-doelparameters beam administratie van de bestraling zal worden waargenomen (Figuur 4B).
  10. Superimpose isocentrum Gafchromic film over de X-stralen van de muis onderwerpen waaruit de parameters cal warenkend. De bestraalde centraal op isocentrum moet samenvallen met de gewenste ROI regio zoals getoond in figuur 4C.

Alternatieve methode: Als moeite met het richten hersenen ROI wordt verholpen, gebruikt jodium contrast intrathecaal geïnjecteerd om visualisatie van ventrikels verbeteren onder CT-beelden. Omwille van de beknoptheid, wordt deze procedure weggelaten uit dit protocol, maar eerder beschreven 35, 50. Jodium contrast zal zorgen voor extra ventriculaire monumenten (figuur 5A).

2. Het bepalen van nauwkeurigheid van Bestraling Beam

Verdere bevestiging CFIR nauwkeurigheid bundel door directe visualisatie van de stralingsbundel in weefsel 2, 35, 51. Om dit te doen, uit te voeren immunohistochemie te sporen γH2AX 51, een histon-eiwit en een vroege marker van dubbele DNA-breuken. Muis onderwerpen moeten transcardially worden doorbloed en binnen een uur na bestraling vast. Na bestraaldatie, DNA herstel snel optreedt, en de niveaus van ΥH2Ax significante daling van 35.

  1. Herhaal stappen 1,1-1,3.
  2. Nadat het doel is geïdentificeerd op CT, is de muis onderwerp onder robotachtige controle verplaatst naar deze doelgroep af te stemmen met de straling levering balk. Input berekende parameters (toerental en duur van de behandeling om de gewenste dosering te bereiken) van stap 1.6 in dosis-planning software en beginnen met de behandeling. De behandeling wordt geleverd met de gantry gewezen op 45 ° van de verticaal, terwijl de muis draait om een ​​verticaal georiënteerde as.
  3. Na bestraling, voeren transcardial perfusie op de muis onderwerpen. Voer perfusie binnen een uur 52. Na perfusie, onderdompeling fix hersenen in 4% PFA / PBS en schud overnacht bij 4 ° C.
  4. De volgende ochtend, was 5 min in PBS 3x te paraformaldehyde fixeermiddel te verwijderen. Vervolgens dompelen in 30% sucrose in 1x PBS op een rocker bij 4 ° C.
  5. Schud bij 4 ° C (ushandmatig 12-16 uur), totdat de hersenen zinkt naar bodem van de buis. Dit dient als een cryoprotection stap. Eenmaal hersenen zinken, verwijder hersenen met een geperforeerde lepel om overtollig 30% sucrose/1x PBS overdracht te voorkomen. Snel insluiten in invriesmedium op droog ijs. Swirl bevriezing medium met pipet en lijn hersenen in plastic mal.
  6. Eenmaal volledig bevroren, transfer hersenen blokken -20 ° C vriezer voor opslag.
  7. Op de dag dat immunohistochemie zal worden uitgevoerd, sectie coronaalwaarts bij 40 micrometer dikte, en zweven in een 24-wells plaat met PBS met een dun penseel. Onderdelen moeten in de juiste seriële zodat immuunkleuring bestraling dekking van doelgebied vast worden gehouden.
  8. Voorverwarmen 0,01 M natriumcitraat-oplossing tot 80 ° C in een waterbad ter voorbereiding van antigenen stap. Tegelijkertijd, terwijl de natriumcitraat aan het opwarmen is, presteren 5 min wasbeurten 3x in 0,01 M PBS.
  9. Zodra natriumcitraat oplossing bij 80 ° C, dompel hersensecties in de natriumcitraat bufferoplossing. Voeg in een waterbad bij 80 ° C gedurende 1 uur.
  10. Verwijder de sectie en laat natriumcitraatoplossing op kamertemperatuur komen, dan voeren drie 5 minuten wassen in 0,01 M PBS.
  11. Blokkeren hersenen secties voor 1 uur in PBS-Triton met 5% normaal geit serum.
  12. Incubeer hersensecties overnacht in PBS-Triton bevattende 5% normaal geit serum 1:700 concentratie van muis-anti-fosfo-H2AX primaire antilichaam bij 4 ° C.
  13. De volgende dag, voeren 15 min wast 3x in 0,01 M PBS-Triton.
  14. Incubeer hersensecties PBS-Triton bevattende 5% normaal geit serum met geit anti-muis secundair antilichaam geconjugeerd met 488 nm fluorphore bij 1:500 concentratie 2 uur.
  15. Voer de 15 min wast 3x in 0,01 M PBS-Triton.
  16. Voer 4 ',6-diamidino-2-fenylindool (DAPI) vlek (1:5000 in PBS) gedurende 10 min tot kern visualiseren. Vervolgens wassen hersenen secties 5 minuten met PBS.
  17. Monteer aan elektrostatisch charged objectglaasjes door drijvende sectie in PBS. Veeg het overtollige PBS en laat dia's te drogen. Dekglaasje dia met fixeermiddel en laat de dia te drogen in het donker bij kamertemperatuur gedurende de nacht.
  18. Neem foto's van seriële coronale secties met fluorescentiemicroscoop. ΥH2Ax immunostaining (groen) geeft de plaats van bestraling. DAPI (blauw) is een nucleaire vlek (Figuur 5B).

3. Voorbereiding van de muis Onderwerpen voor Focal Bestraling

Onderzoek ΥH2Ax immunostaining resultaten. Eenmaal tevreden met de kalibratie en het richten van de bestraling balk, doorgaan met het experiment. Op dit punt, de totale tijd die nodig is om een ​​muis te behandelen (bij opstart dierlijke voltooiing van straallevering) ongeveer 10-15 min bij 10 Gy behandeling met een 1-mm beam.

  1. Bestel vier weken oude C57BL6 / J vrouwelijke muizen van Jackson Muis laboratoria. Huis vier muizen per kooi en zet voedsel uit normale choween vetrijk dieet vijf weken oud. Oor punch muizen om hen unieke merktekens geven. Monitor gezondheid van muizen dagelijks. Opmerking: metallic markers kunnen niet worden gebruikt zullen ze resulteren in lijn artefacten op de CT.
  2. Weeg muizen de dag voor straling of blanco behandeling. Split muizen in twee cohorten voor straling of blanco behandeling en ervoor te zorgen dat er geen significant verschil in gewicht tussen cohorten. Op de dag van de behandeling, wanneer de muizen zes weken oud, weeg alle muizen en noteer het gewicht. Voorzichtig vervoeren beide cohorten naar de radiologische platform. Zorg om stress te minimaliseren.
  3. Bereid isofluraan gas anesthesie kamer. Verdoven twee muizen, een in de voorafbepaalde bestraling groep en een in de sham controlegroep. Bereid verwarming pad in de lage stand voor postoperatieve behandeling.
  4. Volg de stappen 1,2-1,4 voor de muis aan bestraling te ontvangen. Voor de sham muis, houd de muis in de anesthesie kamer terwijl de behandeling aan de hand is. Maken sure dat anesthesie kamer ligt vlakbij de CFIR platform, zodat eventuele effecten op omgevingsstraling worden gehouden inch Na de doelstelling wordt aangegeven op CT, beweeg de muis onderwerp onder robotachtige controle om dit doel te brengen met de straling levering balk. Input berekende parameters (toerental en duur van de behandeling) in de dosis-planningssoftware.
  5. Zodra bestralingsbehandeling is voltooid, keren zowel sham en bestraalde muizen verwarming pad en controleren totdat ze wakker worden.
  6. Terug zowel sham en bestraalde muizen aan dierlijke faciliteit. Monitor elke dag. Weeg de muizen elke halve week. Bestraling van gerichte hypothalamus proliferatieve zone bevestigen, toedienen intraperitoneale injecties van BrdU (50 mg / kg) drie dagen na de behandeling en onderzoeken neurogenese tussen groepen door colabeling van immunohistochemie voor BrdU en een neuronale marker een maand na de eerste BrdU blootstelling (Figuur 6) 2.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

Het beoordelen van CT-geleide targeting en nauwkeurigheid

De mechanische kalibratie van het systeem is essentieel voor dat bundels vanuit verschillende invalshoeken alle kruisen in een punt. Kalibratie werd uitgevoerd met een semi-automatische imaging gebaseerde methode, waarbij end-to-end nauwkeurigheid uitlijning werd gemeten als 0,2 mm 29. Deze nauwkeurigheid is zeer kritisch als het volume van de hypothalamus mediaan eminentie structuur is klein 2. Om deze kalibratie t...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

CT-geleide focale bestraling (CFIR) is een nieuwe en compleet systeem benadering kan leveren straling velden om doelen in kleine dieren onder robotachtige controle met behulp van CT-begeleiding 32. Het vermogen van CFIR om zeer gerichte bundels te leveren aan kleine diermodellen biedt nieuwe mogelijkheden voor onderzoek naar het laboratorium onderzoek en klinische vertaling te overbruggen. Dit document beschrijft de CFIR aanpak voor exacte bestraling levering specifiek te richten een hypothalamus neurale voor...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

JW heeft een financiering en overleg onderzoek overeenkomsten met Xstrahl, Inc

Dankbetuigingen

Wij danken C. Montojo, J. Reyes, en M. Armour voor technisch advies en bijstand. Dit werk werd ondersteund door de US National Institutes of Health subsidie ​​F31 NS063550 (naar DAL), een Basil O'Connor Starter Scholar Award en subsidies van de Klingenstein Fonds en NARSAD (SB). SB is een WM Keck Distinguished Young Scholar in Medical Research.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
SARRP research platformXstrahlRS225Ahttp://www.xstrahl.com/xstrahlrs225.htm
SARRP bestralingsbunkerXstrahlOptioneel, maar blootstelling aan straling moet worden beperkt met alternatieve loodbescherming
GAF chromic filmIPSGAFchromic ETB2
Muis phantomGammex457Koopt 0,5 cm x 30 cm x 30 cm vaste waterblokken van Gammex en snijdt ze op de gewenste maat.
Muis anti-fosfo-histone H2AX Ser139 antilichaamMillipore, Inc.05-636clone JBW301
Dieet met hoog vetgehalte voor knaagdierenResearch DietsD12492i60% van de calorieën als vet, voedsel moet worden bestraald
IsofluraangeBaxter Healthcare Corporation10019-360-40
0,01 M NatriumcitraatFisher Scientific1,471 g natriumcitraat opgelost in 500 ml gedeïoniseerd water
Superfrost Plus dia'sFisher Scientific12-550-15
DAPIFisher Scientificnucleaire contrakleuring
MonteringsmediumFisher ScientificVectashield of Gelvatol heeft de voorkeur

Referenties

  1. Ming, G. L., Song, H. Adult neurogenesis in the mammalian brain: significant answers and significant questions. Neuron. 70, 687-702 (2011).
  2. Lee, D. A., et al. Tanycytes of the hypothalamic median eminence form a diet-responsive neurogenic niche. Nat. Neurosci. 15, 700-702 (2012).
  3. Lee, D. A., Blackshaw, S. Functional implications of hypothalamic neurogenesis in the adult mammalian brain. Int. J. Dev. Neurosci. 30, 615-621 (2012).
  4. Pencea, V., Bingaman, K. D., Wiegand, S. J., Luskin, M. B. Infusion of brain-derived neurotrophic factor into the lateral ventricle of the adult rat leads to new neurons in the parenchyma of the striatum, septum, thalamus, and. 21, 6706-6717 (2001).
  5. Kokoeva, M. V., Yin, H., Flier, J. S. Neurogenesis in the hypothalamus of adult mice: potential role in energy balance. Science. 310, 679-6783 (2005).
  6. Pierce, A. A., Xu, A. W. De novo neurogenesis in adult hypothalamus as a compensatory mechanism to regulate energy balance. J. Neurosci. 30, 723-7230 (2010).
  7. Ahmed, E. I., et al. Pubertal hormones modulate the addition of new cells to sexually dimorphic brain regions. Nat. Neurosci. 11, 995-997 (2008).
  8. Xu, Y., et al. Neurogenesis in the ependymal layer of the adult rat 3rd ventricle. Exp. Neurol. 192, 251-264 (2005).
  9. Kokoeva, M. V., Yin, H., Flier, J. S. Evidence for constitutive neural cell proliferation in the adult murine hypothalamus. J. Comp. Neurol. 505, 209-220 (2007).
  10. Perez-Martin, M., et al. IGF-I stimulates neurogenesis in the hypothalamus of adult rats. Eur. J. Neurosci. 31, 1533-1548 (2010).
  11. Shimogori, T., et al. A genomic atlas of mouse hypothalamic development. Nat. Neurosci. 13, 767-775 (2010).
  12. Ming, G. L., Song, H. Adult neurogenesis in the mammalian central nervous system. Annu. Rev. Neurosci. 28, 223-250 (2005).
  13. Limoli, C. L., et al. Radiation response of neural precursor cells: linking cellular sensitivity to cell cycle checkpoints, apoptosis and oxidative stress. Radiat. Res. 161, 17-27 (2004).
  14. Monje, M. L., Mizumatsu, S., Fike, J. R., Palmer, T. D. Irradiation induces neural precursor-cell dysfunction. Nat. Med. 8, 955-962 (2002).
  15. Wojtowicz, J. M. Irradiation as an experimental tool in studies of adult neurogenesis. Hippocampus. 16, 261-266 (2006).
  16. Mizumatsu, S., et al. Extreme sensitivity of adult neurogenesis to low doses of X-irradiation. Cancer Res. 63, 4021-4027 (2003).
  17. Snyder, J. S., Hong, N. S., McDonald, R. J., Wojtowicz, J. M. A role for adult neurogenesis in spatial long-term memory. Neuroscience. 130, 843-8452 (2005).
  18. Santarelli, L., et al. Requirement of hippocampal neurogenesis for the behavioral effects of antidepressants. Science. 301, 805-809 (2003).
  19. Saxe, M. D., et al. Ablation of hippocampal neurogenesis impairs contextual fear conditioning and synaptic plasticity in the dentate gyrus. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 103, 17501-17506 (2006).
  20. Duan, W., et al. Sertraline slows disease progression and increases neurogenesis in N171-82Q mouse model of Huntington's disease. Neurobiol. Dis. 30, 312-322 (2008).
  21. Rola, R., et al. Radiation-induced impairment of hippocampal neurogenesis is associated with cognitive deficits in young mice. Exp. Neurol. 188, 316-330 (2004).
  22. Hellstrom, N. A., Bjork-Eriksson, T., Blomgren, K., Kuhn, H. G. Differential recovery of neural stem cells in the subventricular zone and dentate gyrus after ionizing radiation. Stem Cells. 27, 634-641 (2009).
  23. McGinn, M. J., Sun, D., Colello, R. J. Utilizing X-irradiation to selectively eliminate neural stem/progenitor cells from neurogenic regions of the mammalian brain. J. Neurosci. Methods. 170, 9-15 (2008).
  24. Panagiotakos, G., et al. Long-term impact of radiation on the stem cell and oligodendrocyte precursors in the brain. PLoS One. 2, e588(2007).
  25. Shinohara, C., Gobbel, G. T., Lamborn, K. R., Tada, E., Fike, J. R. Apoptosis in the subependyma of young adult rats after single and fractionated doses of X-rays. Cancer Res. 57, 2694-2702 (1997).
  26. Tada, E., Parent, J. M., Lowenstein, D. H., Fike, J. R. X-irradiation causes a prolonged reduction in cell proliferation in the dentate gyrus of adult rats. Neuroscience. 99, 33-41 (2000).
  27. Tada, E., Yang, C., Gobbel, G. T., Lamborn, K. R., Fike, J. R. Long-term impairment of subependymal repopulation following damage by ionizing irradiation. Exp. Neurol. 160, 66-77 (1999).
  28. Hopewell, J. W., Cavanagh, J. B. Effects of X irradiation on the mitotic activity of the subependymal plate of rats. Br. J. Radiol. 45, 461-465 (1972).
  29. Matinfar, M., Ford, E., Iordachita, I., Wong, J., Kazanzides, P. Image-guided small animal radiation research platform: calibration of treatment beam alignment. Phys. Med. Biol. 54, 891-905 (2009).
  30. Matinfar, M., et al. Small animal radiation research platform: imaging, mechanics, control and calibration. Med. Image Comput. Comput. Assist. Interv. 10, 926-934 (2007).
  31. Matinfar, M., Iordachita, I., Ford, E., Wong, J., Kazanzides, P. Precision radiotherapy for small animal research. Med. Image Comput. Comput. Assist. Interv. 11, 619-626 (2008).
  32. Matinfar, M., Iordachita, I., Wong, J., Kazanzides, P. Robotic Delivery of Complex Radiation Volumes for Small Animal Research. IEEE Int. Conf. Robot. Autom. 2010, 2056-2061 (2010).
  33. Wong, J., et al. small animal radiation research platform with x-ray tomographic guidance capabilities. Int. J. Radiat. Oncol. Biol. Phys. 71, 1591-1599 (2008).
  34. Armour, M., Ford, E., Iordachita, I., Wong, J. CT guidance is needed to achieve reproducible positioning of the mouse head for repeat precision cranial irradiation. Radiat. Res. 173, 119-123 (2010).
  35. Ford, E. C., et al. Localized CT-guided irradiation inhibits neurogenesis in specific regions of the adult mouse brain. Radiat. Res. 175, 774-783 (2011).
  36. Redmond, K. J., et al. A radiotherapy technique to limit dose to neural progenitor cell niches without compromising tumor coverage. J. Neurooncol. 104, 579-587 (2011).
  37. Fike, J. R., Rola, R., Limoli, C. L. Radiation response of neural precursor cells. Neurosurg. Clin. N. Am. 18, 115-127 (2007).
  38. Bauer, S., Hay, M., Amilhon, B., Jean, A., Moyse, E. In vivo neurogenesis in the dorsal vagal complex of the adult rat brainstem. Neuroscience. 130, 75-90 (2005).
  39. Hourai, A., Miyata, S. Neurogenesis in the circumventricular organs of adult mouse brains. J. Neurosci. Res. 91, 757-770 (2013).
  40. Bennett, L., Yang, M., Enikolopov, G., Iacovitti, L. Circumventricular organs: a novel site of neural stem cells in the adult brain. Mol. Cell. Neurosci. 41, 337-347 (2009).
  41. Gleiberman, A. S., et al. Genetic approaches identify adult pituitary stem cells. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 6332-6337 (2008).
  42. Goldman, S. A., Nottebohm, F. Neuronal production, migration, and differentiation in a vocal control nucleus of the adult female canary brain. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 80, 2390-2394 (1983).
  43. Chow, J. C., Leung, M. K., Lindsay, P. E., Jaffray, D. A. Dosimetric variation due to the photon beam energy in the small-animal irradiation: a Monte Carlo study. Med. Phys. 37, 5322-5329 (2010).
  44. Maeda, A., et al. In vivo optical imaging of tumor and microvascular response to ionizing radiation. PLoS One. 7, e42133(2012).
  45. Vasireddy, R. S., et al. Evaluation of the spatial distribution of gammaH2AX following ionizing radiation. J. Vis. Exp. (42), e2203(2010).
  46. Short, S. C., et al. DNA repair after irradiation in glioma cells and normal human astrocytes. Neuro. Oncol. 9, 404-411 (2007).
  47. Gavrilov, B., et al. Slow elimination of phosphorylated histone gamma-H2AX from DNA of terminally differentiated mouse heart cells in situ. Biochem. Biophys. Res. Commun. 347, 1048-1052 (2006).
  48. Nowak, E., et al. Radiation-induced H2AX phosphorylation and neural precursor apoptosis in the developing brain of mice. Radiat. Res. 165, 155-164 (2006).
  49. Jacques, R., Taylor, R., Wong, J., McNutt, T. Towards real-time radiation therapy: GPU accelerated superposition/convolution. Comput. Methods Programs Biomed. 98, 285-292 (2010).
  50. Chaichana, K. L., Levy, A. P., Miller-Lotan, R., Shakur, S., Tamargo, R. J. Haptoglobin 2-2 genotype determines chronic vasospasm after experimental subarachnoid hemorrhage. Stroke. 38, 3266-3271 (2007).
  51. Mah, L. J., et al. Quantification of gammaH2AX foci in response to ionising radiation. J. Vis. Exp. (38), e1957(2010).
  52. Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole animal perfusion fixation for rodents. J. Vis. Exp. (65), e3564(2012).
  53. Banath, J. P., Macphail, S. H., Olive, P. L. Radiation sensitivity, H2AX phosphorylation, and kinetics of repair of DNA strand breaks in irradiated cervical cancer cell lines. Cancer Res. 64, 7144-7149 (2004).
  54. Tryggestad, E., Armour, M., Iordachita, I., Verhaegen, F., Wong, J. W. A comprehensive system for dosimetric commissioning and Monte Carlo validation for the small animal radiation research platform. Phys. Med. Biol. 54, 5341-5357 (2009).
  55. Lein, E. S., et al. Genome-wide atlas of gene expression in the adult mouse brain. Nature. 445, 168-176 (2007).
  56. Tuli, R., et al. Development of a novel preclinical pancreatic cancer research model: bioluminescence image-guided focal irradiation and tumor monitoring of orthotopic xenografts. Transl. Oncol. 5, 77-84 (2012).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Trefwoorden

Gefocuste bestralingcomputertomografische begeleidingnauwkeurigheid van stralingsbundelsventrale basale hypothalamusGAF chromische filmsdubbelstrengse DNA breukenvetrijk dieetinhibitie van neurogenesestereotactische boogbehandeling
Functionele Ondervraging van Adult hypothalamus Neurogenese met Focal Radiologische Remming
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleid

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.