Opsporen, visualiseren en kwantificeren van de Generatie van reactive oxygen species in een Amoeba Model Systeem

Summary

We aangepast een reeks protocollen voor de meting van reactive oxygen species (ROS) die in verschillende amoebe en zoogdieren cellulaire modellen kan worden toegepast voor de kwalitatieve en kwantitatieve studies.

Abstract

Reactive oxygen species (ROS) bestaan ​​uit een reeks van reactief en kortstondige, zuurstofhoudende moleculen, die dynamisch worden interconverted of hetzij katalytisch of spontaan geëlimineerd. Door de korte levensduur van de meeste ROS en de diversiteit van hun bronnen en subcellulaire lokalisaties, kan een volledig beeld worden alleen verkregen door zorgvuldige metingen met behulp van een combinatie van protocollen. Hier presenteren we een set van drie verschillende protocollen gebruiken OxyBurst Groen (OBG)-gecoate kralen, of dihydroethidium (DHE) en Amplex Ultrared (AUR), kwalitatief en kwantitatief te monitoren verschillende ROS in professionele fagocyten zoals Dictyostelium. We geoptimaliseerd de kralen coating procedures en gebruikte OBG-gecoate kralen en live microscopie om dynamisch visualiseren intraphagosomal ROS generatie op de enkele cel niveau. Wij identificeerden lipopolysaccharide (LPS) van E. coli als een krachtige stimulator voor ROS generatie in Dictyostelium. Daarnaast hebben we developed real-time, het midden-throughput testen in DHE en AUR om kwantitatief te meten intracellulaire superoxide en extracellulaire H ₂ O _2-productie, respectievelijk.

Introduction

Reactieve zuurstof species (ROS) zijn betrokken bij vele verschillende biologische processen zoals afweer, signalering, weefselontwikkeling en reactie op letsel en hypertensie en kanker. De goed bestudeerde phagosomal NADPH oxidase machines is gewijd aan snelle ROS generatie, bekend als de oxidatieve burst, om bacteriën ingenomen in phagosomes neutrofielen ^'1 doden. Bovendien werd lekkage van elektronen als een bijproduct van de mitochondriale ademhalingsketen eerder gedacht alleen verantwoordelijk voor een ongereguleerde bron van ROS zijn. Maar onlangs werd geïdentificeerd als een belangrijk mechanisme bijdragen aan intraphagosomal doden van bacteriën in muizen macrofagen ^2. In de afgelopen jaren, heeft de sociale amoebe, Dictyosteliumcellen, uitgegroeid tot een krachtige en populaire model naar cel intrinsieke mechanismen van de aangeboren immuunrespons bestuderen. Inderdaad, Dictyostelium en menselijke fagocyten delen een verrassend hoog niveau van instandhouding in molecular machines die verantwoordelijk zijn voor bacteriën sensing, afblazen en het doden van ^3,4. De homologen van de eiwitten en enzymen betrekking tot ROS productie of detoxificatie, zoals NADPH oxidase, katalase, superoxide dismutase, kan worden gevonden in menselijke en Dictyostelium. Zoals de best bestudeerde amoebe, Dictyostelium presenteert een aantal unieke voordelen ten opzichte van zoogdieren modelsysteem. Ze groeien bij kamertemperatuur zonder de noodzaak van _CO2 met een verdubbelingstijd van 8-10 uur. Ze kunnen gemakkelijk worden bewaard als hechtende of opschorting culturen. Bovendien, dankzij hun volledig gesequenced en geannoteerd haploïde genoom, en gemakkelijk genetische manipulatie, Dictyosteliumcellen is uitgegroeid tot een zeer aantrekkelijke experimenteel model organisme.

In vorige studies, verschillende gechloreerde en gefluoreerde derivaten van fluoresceïne (gezamenlijk bekend als OxyBurst Green, OBG) die fluorescentie uitzenden na oxidatie door ROS, zijn gebruikt als ROS reporter. Cel-doordringende esterified derivaten worden gebruikt om cytoplasmatische ROS te meten, terwijl cel-impermeant dextran-of-eiwit-gekoppelde derivaten worden gebruikt om extracellulaire ROS te meten. Met name OBG BSA-beklede parels reeds gebruikt phagosomal ROS productie detecteren in zoogdiercellen ^5. Echter, de microplaat-lezer aanpak geven slechts een gemiddelde ROS generatie curve uit een populatie van cellen. Met het huidige protocol, met behulp Dictyosteliumcellen, een professioneel fagocyt, en geoptimaliseerd experimentele omstandigheden, stabiel en efficiënt fagocytose krijgen we zonder het vervoegen enige opsonine op de parels. DHE is gebruikt in verschillende modelsystemen, zoals zoogdieren neutrofielen en macrofagen, de productie van ROS ^6-9 detecteren. Inmiddels zijn er enkele controverse over de specificiteit en gevoeligheid van de methode ^8,10. Een verbeterde versie van Amplex Red, de fluorescentie-intensiteit van AUR minder gevoelig voor pH, waardoor het geschikt is om te meten maaktROS in nonneutral of zwak zure milieus. AUR is onlangs toegepast op verschillende zoogdiersystemen ^11,12, maar het gebruik ervan in nonmammalian modellen, die vaak nodig zwak zure groeimedia, nog niet gerapporteerd. Daarnaast is er geen gepubliceerde protocol om kwantitatief en dynamisch meten ROS productie en lokalisatie in de sociale amoebe Dictyostelium.

Het doel van de gepresenteerde set protocollen is om een ​​gemakkelijke en veelzijdige oplossing te controleren verschillende ROS en hun lokalisatie, en verder geven inzicht in ROS-gerelateerde cellulaire mechanismen. Voor de OBG test gebruikte we live microscopie om het hele proces van phagosomal ROS generatie na opname van OBG-gecoate kralen door Dictyosteliumcellen cellen bewaken, en voorzien van een nieuwe benadering van het mechanisme van intraphagosomal doden van bacteriën te bestuderen. We hebben midden-throughput DHE en AUR assays geoptimaliseerd Dictyostelium, intracellulaire Superox metenide en extracellulaire H ₂ O ₂ productie, respectievelijk door LPS als een krachtige stimulator ROS. Merk op dat LPS onlangs werd aangetoond dat de bactericide activiteit van Dictyosteliumcellen richting gefagocyteerd bacteriën ¹³ te verhogen. Daarnaast is de behandeling met DEDTC en catalase uitdrukkelijk bevestigd dat deze twee methoden specifiek meten verschillende soorten en subcellulaire lokalisatie van ROS in Dictyostelium. Tenslotte kan de OBG assay worden aangepast aan elke hechtende fagocytische cellen, door verdere opsoniserende de bolletjes met liganden voor receptoren van dierlijke fagocytische cellen. In principe kan de DHE en AUR assays ook worden afgesteld voor metingen in alle aanhangend of nonadherent cel onder geschikte experimentele omstandigheden.

Protocol

1. Visualisatie en kwalitatieve meting van ROS productie in fagosomen

De OBG-gecoate kralen moeten worden voorbereid op voorhand. De kralen coating procedures en agar overlay techniek worden aangepast uit gepubliceerde referenties ^5,14.

1. Voeg 1 ml suspensie van 3,0 urn gecarboxyleerde silicapareltjes (ongeveer 1,8 x 10 ⁹ kralen) in een 1,5 ml buis, was de kralen 3x met 1 ml PBS met snelle rotatie en vortexen.
2. Resuspendeer de kralen in 1 ml PBS dat 25 mg / ml cyaanamide (de gecarboxyleerde siliciumoxideparels activeren covalent binden prelabeled BSA), incubeer op een wiel voor 15 minuten.
3. Was 3x met 1 ml koppelingsbuffer (0,1 M natriumboraat, pH 8,0) bij snelle rotatie (centrifugeer op volle snelheid in een tafelblad centrifuge mini voor 5 seconden of alternatief centrifugeer bij 2000 xg gedurende 1 min in een tafelblad centrifuge) en vortexen om overtollig cyaanamide verwijderen.
4. Meng de gewassen kralen met 500 pi van coupling buffer met 1 mg OxyBurst Groen (OBG) H2HFF (dihydro-2 ', 4,5,6,7,7'-hexafluorofluorescein)-BSA, vul de buis met stikstofgas uit een standaard gas-kan voordat aftopping, en incubeer op een wiel 14 uur (gedurende de nacht) bij kamertemperatuur in het donker.
5. Was de beads 2x met 1 ml quenching buffer (250 mM glycine in PBS) ongereageerd OBG verwijderen en tweemaal met koppelingsbuffer de quenching buffer verwijderen door snelle draai en vortexen.
6. Voeg 1 ml koppeling buffer die 50 ug van Alexa Fluor 594 succinimidylester te conjugeren aan BSA. De buis wordt met stikstof vóór afdekken en incubeer op een wiel gedurende 1,5 uur bij kamertemperatuur in het donker.
7. Was de kralen 3x met 1 ml blussen buffer door een snelle spin en vortexen om de reactie te stoppen, dan was de kralen 3x met 1 ml PBS door snelle draai en vortexen.
8. Tenslotte resuspendeer de kralen in 1 ml PBS met 2 ui 10% w / v azide voor langdurige opslag. Meet de concentration kralen in de suspensie met een hemocytometer (gewoonlijk ongeveer 1-2 x 10 ⁹ kralen / ml), vul de buis met stikstof vóór afdekken en bewaar bij 4 ° C in het donker.
9. De coating efficiëntie van de OBG fluoresceïne kan worden getest door het controleren van de emissiespectrum met excitatie bij 500 nm. Als geoxideerd met H ₂ O ₂ in aanwezigheid van mierikswortelperoxidase (HRP), de fluorescentie-intensiteit van geoxideerde parels op emissie piek (538 nm) is 11-12x hoger dan nonoxidized beklede kralen.
10. Harvest exponentieel groeiende Dictyosteliumcellen cellen van een 10 cm petrischaal, plaat verschillende dichtheden van cellen op 3 cm schalen met een optisch doorzichtige plastic of glazen bodem, en groeien ze 's nachts. Kies de gerechten die zijn ongeveer 80% samenvloeiing voor het experiment. Een gedetailleerd protocol voor het kweken Dictyostelium cellen is gepubliceerd ^15.
11. Vervang het kweekmedium met LoFlo medium (LF medium), incubeer gedurende2 uur voor het experiment om de extracellulaire en intraendosomal autofluorescentie van het HL5C kweekmedium verlagen.
12. Tegelijkertijd smelt 10 ml 1,5% Bacto agar in LF medium, giet de agar op een vlak oppervlak (bijvoorbeeld een glasplaat van 10 cm x 10 cm) om een agar-laag ongeveer 1 mm dik te vormen, wacht 10-15 min. stollen. Snijd de agar laag in 2 cm x 2 cm pleinen en plaats in LF medium voor later gebruik.
13. Ondertussen bereiden de draaiende schijf of brede veld microscoop, stel de temperatuur van de klimaatkamer bij 22 ° C en de instellingen voor dit experiment aan te passen. (Zie aanvullende opmerkingen in de discussie).
14. Na 2 uur incubatie, zuigen de LF medium van 3 cm schaal, maar de cel monolaag moet nog worden bedekt met een dunne film drager. Verdun de beklede parels 1,5 x 10 ⁷ kralen / ml en voeg 10 ul op de cellaag.
15. Neem een ​​vierkante agar plaat, afvoer overtollige vloeistof, maar houden nat. Voorzichtig zet the agar vierkant bovenop de cellaag. Verplaats de agar plein als het ligt op de cellen. De agar overlay wordt gebruikt om contact tussen korrels en cellen verhogen, waardoor opname verbeteren, en ook enigszins comprimeert de cellen, waardoor ze beter in het brandvlak van het objectief.
16. Plaats het deksel op de schotel, plaats het op de microscoop podium, en automatisch foto's te nemen in de rode, groene en fase kanalen om de 1 min gedurende 2 uur of langer.
17. Selecteer en zich richten op cellulaire gebeurtenissen die het hele proces van fagocytose bevatten. Voeg de geoptimaliseerde 3 kanalen en monteren de beelden in een film met behulp van professionele software voor beeldverwerking. Kwantificeren fluorescentie-intensiteiten van elke geselecteerde kralen in de kleuren rood en groen kanalen, en de verhouding van groen / rood zal de dynamische phagosomal ROS productie van de cellen weerspiegelen.

2. Kwantitatieve en Medium-throughput meting van intracellulaire superoxideproductie

1. Verzamelen one 80% samenvloeiing schotel van Dictyosteliumcellen in 10 ml HL5C medium. Centrifugeer Dictyostelium cellen bij 850 g gedurende 5 minuten, zorgvuldig en volledig zuig overtollige medium. Resuspendeer cellen in SS6.4 buffer [0,12 M sorbitol in Sorensen buffer (14.69 mM KH ₂ PO ₄ en 6,27 mM Na ₂ HPO _4), pH 6,4], tellen cellen en verdund tot een uiteindelijke dichtheid van 6 x 10 ⁶ cellen / ml (zie aanvullende opmerkingen in de discussie).
2. Voeg 50 ul van celsuspensie in elk putje van een witte ondoorzichtige plaat met 96 (zie aanvullende opmerkingen in de discussie).
3. Verdunnen DHE voorraad (30 mM in DMSO) 500 maal met SS6.4, pipet 50 pi verdund DHE in elk putje met een meerkanaalspipet indien nodig. De eindconcentratie van DHE 30 uM. De reactie start onmiddellijk.
4. Stimuli of remmers kunnen worden toegevoegd op dit punt, of op andere tijdstippen volgens specifieke behoeften.
5. Gebruik het eindpunt "top lezen & #34, modus van een fluorescentie microplaat lezer met fluorescentie-excitatie / emissie bij 522 nm/605 nm, om de 2 min gedurende 1 uur, gemiddeld 5 sec schudden / min, bij 22 ° C.

3. Kwantitatieve en High Throughput Meting van extracellulaire H ₂ O ₂ Productie

1. Volg dezelfde stappen zoals beschreven in 2.1 en 2.2.
2. Bereid verdund HRP door toevoeging van 5 ul van HRP voorraad (100 E / ml in gedestilleerd water) in 10 ml SS6.4, vortex of keren de buis goed te mengen en te houden op ijs voor later gebruik. De verdunde HRP oplossing is 0,05 U / ml.
3. AUR reactiemengsel bereid door de AUR voorraad (10 mM in DMSO AUR) en verdunde HRP oplossing in SS6.4 buffer om de eindconcentraties van 6,25 uM, en 0,005 U / ml. Als voorbeeld, aan het reactiemengsel bereiden 40 reacties, meng 1600 gl SS6.4 met 400 gl verdunde HRP en 2,5 ul van AUR voorraadoplossing.
4. Voeg 50 ul van AUR mixtuur in elk putje met een meerkanaalspipet indien nodig. Nu start de reactie.
5. Stimuli of remmers kunnen worden toegevoegd op dit punt, of op andere tijdstippen volgens specifieke behoeften.
6. Gebruik het eindpunt "top lezing" modus van een fluorescentie microplaat lezer met fluorescentie-excitatie / emissie bij 530 nm/590 nm, om de 2 min gedurende 1 uur, gemiddeld 5 sec schudden / min, bij 22 ° C.

Results

De generatie van ROS in phagosomes kan kwalitatief en dynamisch worden gevisualiseerd door microscopie (File S1). De rode fluorescentie uitgezonden door Alexa fluor 594 is pH-ongevoelig en blijft constant in de phagosomal milieu, terwijl de oxidatie van OBG verhoogt de fluorescentie in het groene kanaal. De emissiespectra van in vitro geoxideerd en nonoxidized OBG-gecoate korrels worden vergeleken in Figuur 1B, die een significante toename in intensiteit na oxidatie. Om visuali...

Discussion

Vergeleken met de eerder beschreven werkwijzen, OBG test dynamisch visualiseert de werkwijze phagosomal ROS generatie op enkele cel, in plaats van het meten van een gemiddelde ROS signaal van een populatie cellen. Dergelijke populatie-gemiddelde methoden zijn vaak kritische informatie veroorzaakt door nonsynchronous fagocytose verduisteren. Wij hebben met succes DHE en AUR assays aangepast aan Dictyosteliumcellen en geoptimaliseerd de protocollen. Belangrijker nog, we aangegeven de soorten en de subcellulaire l...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
REAGENTS
OxyBURST Green H2HFF BSA	Invitrogen	O-13291
Alexa Fluor 594	Invitrogen	A-20004
Carboxylated silica beads	Kisker Biotech	PSi-3.0COOH
HL5C medium	ForMedium	HLC0102
LoFlo medium	ForMedium	LF1001
Bacto agar	BD	204010
Dihydroethidium	Sigma	37291-25MG
Amplex UltraRed	Invitrogen	A36006
Horseradish peroxidase	Roche	10108090001
Diethyldithiocarbamate (DEDTC)	Sigma	D3506-100G
Catalase	Sigma	C9322-1G
Cyanamide	Sigma	187364-25G
Lipopolysaccharides	Sigma	L2630-25G
EQUIPMENT
ibidi μ-Dish 35 mm, high	ibidi	81156	Bottom made of optically clear plastic
MatTek dish 35 mm	MatTek corporation	P35G-1.5-14-C	Bottom made of a glass coverslip
Scepter Cell Counter	Merck Millipore	PHCC00000
White 96 well plate	Nunc	236108
Centrifuge	SORVALL	Legend RT
Microplate reader	BioTek	Synergy Mx