Exonucleasen spelen een cruciale rol bij het waarborgen van de stabiliteit van het genoom. Verlies van de WRN-exonucleasefunctie resulteert in voortijdige veroudering. Het bestuderen van substraten en andere vereisten van de nuclease in vitro kan helpen bij het verduidelijken van zijn rol in vivo. Hier demonstreren we een snelle en reproduceerbare fluorescentie-gebaseerde assay om zijn nuclease-activiteit te meten.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Een fluorescentie-gebaseerde Exonuclease Assay te karakteriseren DmWRNexo, ortholoog van Human Progeroid WRN Exonuclease, en de toepassing ervan op andere Nucleasen
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
WRN-exonuclease is betrokken bij het oplossen van DNA-schade die optreedt tijdens de DNA-replicatie of na blootstelling aan endogene of exogene genotoxinen. Het speelt waarschijnlijk een rol bij het voorkomen van de accumulatie van recombinogene tussenproducten die anders zouden accumuleren bij tijdelijk stilstaande replicatievorken, in overeenstemming met een hyper-recombinant fenotype van cellen die WRN missen. Bij mensen bestaat het exonuclease domein uit een N-terminaal deel van een veel groter eiwit dat ook helicase-activiteit bezit, samen met extra plaatsen die belangrijk zijn voor DNA- en eiwitinteractie. In tegenstelling tot Drosophila, wordt de exonuclease-activiteit van WRN (DmWRNexo) gecodeerd door een afzonderlijke genetische locus van de veronderstelde helicase, waardoor biochemische (en genetische) dissectie van de rol van de exonuclease-activiteit in mechanismen van genoomstabiliteit mogelijk is. Hier demonstreren we een fluorescente methode om WRN-exonuclease-activiteit te bepalen met behulp van gezuiverde recombinante DmWRNexo en end-gelabelde fluorescente oligonucleotiden. Dit systeem biedt meer reproduceerbaarheid dan radioactieve analyses omdat de substraat-oligonucleotiden maandenlang stabiel blijven, en biedt een veiligere en relatief snelle methode voor gedetailleerde analyse van nuclease-activiteit, waardoor bepaling van nuclease-polariteit, processiviteit en substraatvoorkeuren mogelijk is.
Inleiding
Nucleases spelen een essentiële rol in cellen bij het verwijderen van beschadigd DNA, het oplossen van niet-duplexstructuren zoals Holliday-juncties en het bieden van een correctiecapaciteit tijdens DNA-replicatie, zowel intrinsiek binnen DNA-polymerasen als extrinsiek ten opzichte van hen1. Nucleasen kunnen werken door DNA sequentieel af te breken vanaf vrije uiteinden (exonucleasen) of door interne fosfodiësterbindingen binnen een langere DNA-molecuul te klieven (endonucleasen). Verlies van nuclease-activiteit kan resulteren in zeer specifieke fenotypes van genomische instabiliteit. Terwijl mutatie van het RecQ-helicasefamilielid BLM resulteert in extreem hoge percentages van zusterchromatidenuitwisseling en globaal verhoogde kankerpercentages (beoordeeld door Payne en Hickson2), leidt mutatie van het nauw verwante WRN-eiwit tot vroegtijdige veroudering3; het belangrijkste significante verschil tussen deze twee familieleden is de aanwezigheid van een 3'-5'-exonucleasedomein in WRN4. Bewijs van een cruciale rol van de WRN-exonuclease bij het handhaven van genomische stabiliteit is verzameld uit analyse van genotypen bij WS-patiënten5, samen met puntmutatie- en deletiestudies in menselijke cellen, ondersteund door kristallografische studies van het geïsoleerde exonucleasedomein6. Echter, samenwerking en interactie tussen de exonuclease-activiteit van WRN en zijn centrale helicase-activiteit7 maakt het moeilijk om de functionaliteit van elk afzonderlijk te onderscheiden en hun relatieve bijdragen aan genomische stabiliteit. In planten en lagere metazoaanse dieren is de WRN-exonuclease-activiteit aanwezig op een enkele polypeptide zonder helicase-activiteit8-10 (beoordeeld in Cox en Boubriak11); het is biochemisch aangetoond in Arabidopsis dat deze exonuclease coördineert met de cognate WRN-helicase, effectief de gecombineerde enzymactiviteiten reconstrueert die worden waargenomen in vertebrate WRN9. We hebben WRN-exonuclease bestudeerd in Drosophila omdat de uitstekende genetische tools analyse mogelijk maken van de impact van exonuclease-mutatie (zonder invloed op de veronderstelde cognate helicase) op het hele organismeniveau en tijdens de ontwikkeling10,12. Bovendien hebben we recombinante Drosophila WRN-exonuclease (DmWRNexo) gekloond, geëxpresseerd en gezuiverd, wat volledige biochemische analyse van zijn enzymeigenschappen mogelijk maakt13,14.
Nuclease-analyse in vitro is traditioneel uitgevoerd met behulp van radioactief gelabelde oligonucleotiden, waarbij de afbraak wordt beoordeeld door laddering van producten op acrylamide-gels te zoeken4,8,15. Hoewel gevoelig, zijn dergelijke tests niet kwantitatief reproduceerbaar van dag tot dag vanwege radioactief verval van de gelabelde substraten. Bovendien stellen de behandeling en verwijdering van radioactieve reagentia significante milieu- en gezondheidskwesties; het verkrijgen van radiolabels wordt ook steeds problematischer. Een recente alternatieve methode beoordeelt de hoeveelheid van het uiteindelijke afbraakproduct door massaspectrometrie16. Echter, het is tijdrovend (enkele dagen), vereist gespecialiseerde apparatuur, en de uitlezing is de hoeveelheid eindproduct (enkel nucleotide) zodat het niet geschikt is voor gevoelige metingen van aspecten zoals enzymprocessiviteit of voor het bepalen of sommige nucleotiden, sequenties of modificaties leiden tot nucleasepauze of halt. Om deze problemen te overwinnen, hebben we de traditionele gel-gebaseerde tests aangepast voor gebruik met fluorescerende oligonucleotide-substraten, waardoor stabiel gelabelde substraten worden gegenereerd die reproducibel kunnen worden gebruikt over lange tijdsperioden en dus directe vergelijking van nuclease-activiteiten onder verschillende omstandigheden mogelijk maken.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
1. Preparatie van substraat-oligonucleotiden
- Synthesizeer aangepaste oligonucleotiden.
- Ontwerp een enkelstrengs oligonucleotide met een 5'-geconjugeerd fluoresceïnemolecuul; dit zal de ruggengraat zijn voor elk substraat. (Opmerking: dit is voor een 3'-5' exonuclease; voor een 5'-3' polariteit exonuclease gebruik een 3'-geconjugeerd ruggengraatstreng). Als de polariteit niet bekend is, moeten zowel 3' als 5' worden getest.
- Ontwerp complementaire strengen zodat wanneer ze worden geannealed met het fluorescerend gelabelde oligonucleotide, de gewenste duplex substraat(en) worden gevormd. Merk op dat de complementaire streng niet geconjugeerd is aan een fluorfoor. Bij het bestellen, specificeer PAGE-zuivering (ontzilting is niet voldoende).
- Bewaar oligonucleotide stocks gebufferd in 10 mM bij 1 nmol/μl bij −20 °C en in het donker.
- Meng het ruggengraat gelabelde oligonucleotide met elke complementaire ongelabelde oligonucleotide in een 1:1.2 molaire verhouding van gelabeld:ongelabeld in buffer (10 mM Tris-HCl pH 7.6, 1 mM EDTA pH 8.0, 50 mM NaCl). (Opmerking: een 1:1 verhouding is het meest wenselijk, maar het is belangrijker dat ALLES van de gelabelde streng gebonden is. Ratio's van 1:1 - 1:1.5 kunnen werken.)
- Verwarm een waterbad of heatblock tot 95 °C en plaats het annealing mengsel hierin gedurende 3 min. Zet vervolgens uit en laat het geheel langzaam afkoelen (1 °C/min) tot onder de 30 °C.
- Controleer volledige annealing van het gelabelde oligonucleotide door het resulterende duplex substraat op een native 10% polyacrylamide gel te draaien (10% 19:1 acrylamide:bis-acrylamide in 1x Tris-Borate-EDTA (TBE, 89 mM Tris base, 89 mM boorzuur, 2 mM EDTA) gepolymeriseerd met 0.05% w/v ammoniumpersulfaat (APS) en 0.005% v/v TEMED). Visualiseer via PhosphorImager (zie sectie 5 hieronder).
2. Preparatie van Acrylamide Gels
- Stel het gel-gietsysteem in bijv. Hoefer SE400 gel rig met 16 cm x 18 cm platen en 1.5 mm ruimtes.
- Reinig glasplaten en ruimtes grondig met detergent en water. Draag schone handschoenen om te voorkomen dat de platen opnieuw vervuild worden met olie van de vingers, wat een consistente gelvorming zou belemmeren.
- Spoel de platen met veel gedestilleerd (gedeioniseerd) water om resten van detergent te verwijderen, en droog vervolgens af met pluisvrij papier (bijv. Kimwipes).
- Spuiten tenslotte met 70% ethanol en veeg - glasplaten moeten piepen als ze schoon zijn. Zet ze rechtop opzij om het laatste ethanol te laten verdampen.
- Reinig de rest van de gelvormende apparatuur met gedestilleerd water (gebruik eerst detergent indien nodig) en droog af.
- Monteer de glasplaten en ruimtes in de gelvormende rig, zorg ervoor dat het systeem lekvrij is.
- Bereid de geloplossing voor tot het gewenste polyacrylamide percentage
- Voor nuclease assay, gebruik denaturerende 14% polyacrylamide gels met 8 M ureum in 1x TBE.
- Om 100 ml te maken (genoeg voor 2 gels met veel overtollig voor lekkage) neem 48.05 g ureum in een brede beker en voeg 35 ml 40% 19:1 acrylamideoplossing en 10 ml 10x TBE (890 mM Tris, 890 mM boorzuur, 20 mM EDTA, pH 8.3 met NaOH) toe. LET OP: Draag handschoenen - acrylamide is een krachtig neurotoxine. Los het ureum op met een roerstaaf en magnetisch roerplateau (dit zal enige tijd duren).
- Wanneer opgelost, voeg milliQ-gedeioniseerd water toe tot 100 ml. Filter-steriliseer met een 0.22 μm membraan. Indien niet onmiddellijk te gebruiken, degas kort met zuigapparatuur en bewaar in het donker (blijft enkele dagen goed). Niet koelen omdat het ureum zal precipiteren.
- Polymeriseren en gieten van de gel.
- Neem de ureum-acrylamide en voeg 0.5 ml 10% (w/v) ammoniumpersulfaat (APS, opgelost in gedestilleerd water) en 50 μl TEMED toe. Draai de container langzaam om te mengen zonder lucht in te brengen (wat polymerisatie zal remmen) en giet het in de gelvormer. Doe snel, anders kan de gel gaan stollen voordat het gieten is voltooid.
- Voeg de juiste kam toe om putjes te vormen voor het laden van monsters (gekozen volgens het gel-rig en het aantal monsters dat moet worden geanalyseerd bijv. 15- of 29-tandige kammen zijn geschikt voor gebruik met de Hoefer gel-rig). Controleer dat er geen luchtbellen onder de kamtandjes zijn.
- Laat stollen. Controleer op lekkage. Volledige polymerisatie wordt vertraagd bij de kammen vanwege contact met de atmosfeer. Wanneer de putjes stevig zijn, zal de rest van de gel zijn gestold.
- Verwijder de kammen en spoel het ongepolymeriseerde acrylamide weg met water en een pipette.
- Stel de gel in voor het draaien.
- Plaats de gegoten gel in het gel-loopsysteem en voeg de juiste hoeveelheid 1x TBE-loopbuffer toe aan de onderste kamer en in de gelputjes. De gel is nu klaar om te worden geladen.
3. Preparatie van His-gelabeld Recombinant DmWRNexo Proteïne
- Bacteriële expressie van DmWRNexo proteïne
- Gebruik een inoculatieloep om bacteriën te verzamelen door over het oppervlak te schrapen van glycerolvoorraden
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
Het uitvoeren van een in vitro analyse van de exonuclease-activiteit vereist een aantal voorbereidende stappen naast de feitelijke analyse. Een overzicht van de procedures wordt getoond in Figuur 1.
Vóór het uitvoeren van fluorescentie-gebaseerde exonuclease-assays is het essentieel om de detectie van het fluorescentie-gelabelde oligonucleotide-substraat na scheiding op urea-acrylamidegels te optimaliseren met behulp van een geschikt fluorescentie-beeldvormingssystee...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
De bepaling van de exonuklease-activiteit van gezuiverde eiwitten vereist de analyse van DNA-splitsingsproducten. Sequentiële splitsing van DNA door exonukleasen kan worden gevisualiseerd door scheiding van gelabelde splitsingsproducten op acrylamidegels. Historisch gezien hield dit het end-labeling van het DNA-substraat met een radiolabel in (bijv. 32P of 35S), maar met de nadelen die inherent zijn aan het gebruik van radiolabel (kosten, veiligheidsproblemen en instabiliteit in de loop van...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs hebben niets te onthullen.
Dankbetuigingen
We danken het inter-raadsprogramma New Dynamics of Ageing voor het financieren van dit werk [ES/G037086/1] en Prof Dave Sherratt (Afdeling Biochemie, Universiteit van Oxford) voor toegang tot de Fuji FLA-3000.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| Reagens/Materiaal | |||
| Aangepaste oligonucleotiden | Eurogentec | Het is noodzakelijk om deze met hoge zuiverheid te verkrijgen bijv. met PAGE-zuivering. | |
| 5'FLO | fluoresceïne-5' GAACTATGGCTCTC GAGTGCTAGGACATGTCTGA CTACGTACAAGTCACC - 3' | ||
| bubbel | 5'- GGTGACTTGTACGT AGTCAGACATGTCCTAGCAC TCGAGAGCCATAGTTC-3' | ||
| 40% 19:1 Acrylamide-oplossing | Severn Biotech | 20-2400-05 | VOORSICHT: krachtige neurotoxine, dus handschoenen moeten altijd worden gedragen |
| His-Trap kolommen (1 ml) | GE Healthcare | 17-5247-01 | |
| Alle andere reagentia | elke gerenommeerde leverancier | Molecuulbiologie kwaliteit is noodzakelijk (DNase-vrij); microfugebuisjes moeten eveneens DNase- en RNase-vrij zijn | |
| Apparatuur | |||
| Hoefer SE400 gel apparaat | Hoefer | SE400-15-1.5 | |
| FLA-3000 (fosfor en fluorescentie imager) | Fuji | ||
| Image Reader V2.02 | FujiFilm | ||
| Image Gauge V3.3 | FujiFilm |
Referenties
- Mason, P. A., Cox, L. S. The role of DNA exonucleases in protecting genome stability and their impact on ageing. Age (Dordr. 34, 1317-1340 (2012).
- Payne, M., Hickson, I. D. Genomic instability and cancer: lessons from analysis of Bloom's syndrome). Biochem. Soc. Trans. 37, 553-559 (2009).
- Yu, C. E., Oshima, J., Fu, Y. H., Wijsman, E. M., Hisama, F., Alisch, R., Matthews, S., Nakura, J., Miki, T., Ouais, S., et al. Positional cloning of the Werner's syndrome gene. Science. 272, 258-262 (1996).
- Huang, S., Li, B., Gray, M. D., Oshima, J., Mian, I. S., Campisi, J. The premature ageing syndrome protein, WRN, is a 3'-->5' exonuclease. Nat. Genet. 20, 114-116 (1998).
- Goto, M. Syndrome-causing mutations in Werner syndrome. Biosci. Trends. 2, 147-150 (2008).
- Perry, J. J., Yannone, S. M., Holden, L. G., Hitomi, C., Asaithamby, A., Han, S., Cooper, P. K., Chen, D. J., Tainer, J. A. WRN exonuclease structure and molecular mechanism imply an editing role in DNA end processing. Nat. Struct. Mol. Biol. 13, 414-422 (2006).
- Opresko, P. L., Laine, J. P., Brosh, R. M., Seidman, M. M., Bohr, V. A. Coordinate action of the helicase and 3' to 5' exonuclease of Werner syndrome protein. J. Biol. Chem. 276, 44677-44687 (2001).
- Plchova, H., Hartung, F., Puchta, H. Biochemical characterization of an exonuclease from Arabidopsis thaliana reveals similarities to the DNA exonuclease of the human Werner syndrome protein. J. Biol. Chem. 278, 44128-44138 (2003).
- Hartung, F., Plchova, H., Puchta, H. Molecular characterisation of RecQ homologues in Arabidopsis thaliana. Nucleic Acids Res. 28, 4275-4282 (2000).
- Saunders, R. D., Boubriak, I., Clancy, D. J., Cox, L. S. Identification and characterization of a Drosophila ortholog of WRN exonuclease that is required to maintain genome integrity. Aging Cell. 7, 418-425 (2008).
- Cox, L. S., Boubriak, I. DNA Instability in Premature Aging, in DNA Damage Repair, Repair Mechanisms and Aging. Thomas, A.E., Eds. Nova Science Publishers. , 1-34 (2010).
- Cox, L. S., Clancy, D. J., Boubriak, I., Saunders, R. D. Modeling Werner Syndrome in Drosophila melanogaster: hyper-recombination in flies lacking WRN-like exonuclease. Ann. N.Y. Acad. Sci. 1119, 274-288 (2007).
- Boubriak, I., Mason, P. A., Clancy, D. J., Dockray, J., Saunders, R. D., Cox, L. S. DmWRNexo is a 3'-5' exonuclease: phenotypic and biochemical characterization of mutants of the Drosophila orthologue of human WRN exonuclease. Biogerontology. 10, 267-277 (2009).
- Mason, P. A., Boubriak, I., Robbins, T., Lasala, R., Saunders, R., Cox, L. S. The Drosophila orthologue of progeroid human WRN exonuclease, DmWRNexo, cleaves replication substrates but is inhibited by uracil or abasic sites : Analysis of DmWRNexo activity in vitro. Age (Dordr). , (2012).
- Machwe, A., Xiao, L., Orren, D. K. Length-dependent degradation of single-stranded 3' ends by the Werner syndrome protein (WRN): implications for spatial orientation and coordinated 3' to 5' movement of its ATPase/helicase and exonuclease domains. BMC Mol. Biol. 7, 6 (2006).
- Mangerich, A., Veith, S., Popp, O., Fahrer, J., Martello, R., Bohr, V. A., Burkle, A. Quantitative analysis of WRN exonuclease activity by isotope dilution mass spectrometry. Mech. Ageing Dev. 133, 575-579 (2012).
- Xue, Y., Ratcliff, G. C., Wang, H., Davis-Searles, P. R., Gray, M. D., Erie, D. A., Redinbo, M. R. A minimal exonuclease domain of WRN forms a hexamer on DNA and possesses both 3'- 5' exonuclease and 5'-protruding strand endonuclease activities. Biochemistry. 41, 2901-2912 (2002).
- Machwe, A., Ganunis, R., Bohr, V. A., Orren, D. K. Selective blockage of the 3'-->5' exonuclease activity of WRN protein by certain oxidative modifications and bulky lesions in DNA. Nucleic Acids Res. 28, 2762-2770 (2000).
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
