Programmeren stamcellen voor therapeutische angiogenese gebruik van biologisch afbreekbare polymere nanodeeltjes

Summary

We beschrijven de manier van programmeren stamcellen therapeutische angiogenese factoren overexpressie bioafbreekbare polymere nanodeeltjes. Beschreven processen omvatten polymeersynthese, transfecteren vet-afgeleide stamcellen in vitro, en valideren van de werkzaamheid van geprogrammeerde stamcellen om angiogenese te bevorderen in een muizen achterbeen ischemie model.

Abstract

Gecontroleerde vasculaire groei is cruciaal voor een succesvolle weefselregeneratie en wondgenezing, alsmede voor de behandeling van ischemische ziekten zoals beroerte, hartaanval of perifere arteriële aandoeningen. Directe levering van angiogene groeifactoren heeft het potentieel om groei van nieuwe bloedvaten te stimuleren, maar wordt vaak geassocieerd met beperkingen zoals gebrek aan targeting en korte halfwaardetijd in vivo. Gentherapie biedt een andere kijk door het leveren van genen die coderen voor angiogene factoren, maar vereist vaak met behulp van virus, en wordt beperkt door bezorgdheid over de veiligheid. Hier beschrijven we een recent ontwikkelde strategie voor het bevorderen van vasculaire groei door het programmeren stamcellen angiogene factoren overexpressie in situ gebruik van biologisch afbreekbare polymere nanodeeltjes. Specifiek onze strategie gebruikt stamcellen bestelwagens door te profiteren van hun vermogen om te migreren naar ischemische weefsels in vivo. De geoptimaliseerde polymère vectoren, vet-afgeleidestamcellen werden gewijzigd om een ​​angiogene gen dat vasculaire endotheliale groeifactor (VEGF) overexpressie. We beschreven werkwijzen voor de polymere synthese, vorming van het nanodeeltje transfectie stamcellen in vitro, alsook werkwijzen voor het valideren van de werkzaamheid van VEGF expressie stamcellen voor het bevorderen van angiogenese in muizen achterbeen ischemie model.

Introduction

Het algemene doel van deze techniek is om therapeutische angiogenese met niet-viraal geprogrammeerde stamcellen overexpressie therapeutische factoren op de plaats van ischemie. Stamcellen werden gewijzigd ex vivo eerste gebruik van biologisch afbreekbare nanodeeltjes gesynthetiseerd in het lab, en vervolgens getransplanteerd in een muizenmodel van achterbeen ischemie om hun potentieel te valideren voor het verbeteren van angiogenese en weefsel berging.

Gecontroleerde vasculaire groei een belangrijk onderdeel van succesvolle weefselregeneratie, en voor behandeling van verschillende ziekten zoals ischemische beroerte, ischemie en myocardiaal infarct. Verscheidene strategieën zijn ontwikkeld om vasculaire groei, inclusief groeifactor productietijd en celtherapie te bevorderen. ¹ Ondanks de werkzaamheid waargenomen in de dierlijke ziektemodellen, deze werkwijzen ondervinden nog steeds beperkingen, zoals de noodzaak van suprafysiologische doses groeifactor levering of onvoldoende paracrinevrijgeven cellen alleen. Een mogelijke strategie om de bovenstaande beperkingen te overwinnen is om stamcellen en gentherapie, waarbij stamcellen genetisch geprogrammeerd ex vivo voorafgaand aan transplantatie om gewenste therapeutische factoren overexpressie te combineren. Deze aanpak is aangetoond in diverse modellen, waaronder de ziekte van achterbeen ischemie ^2, hart-en vaatziekten ^3, botgenezing ⁴ en neurale verwonding ^5, enz. De meeste gentherapietechnieken afhankelijk virale vectoren, die worden geassocieerd met veiligheidsproblemen als potentiële immunogeniciteit en insertie mutagenese. Biomaterialen gemedieerde non-virale gentherapie kunnen deze beperkingen te overwinnen, maar vaak last van lage transfectie-efficiëntie. Om het tempo van de ontdekking van nieuwe biomaterialen voor efficiënte niet-virale gentherapie, hebben recente studies combinatorische chemie en high-throughput screening aanpak toegepast. Biologisch afbreekbaar polymeer bibliotheken zoals poly (β-amino esters) (PBAE) ontwikkeld en gescreend, wat leidde tot de ontdekking van leidende polymeren met sterk verbeterde transfectie-efficiëntie in vergelijking met de conventionele vector polymere tegenhangers. ^6-7

Hierin beschrijven we de synthese van PBAE en verificatie van hun vermogen om vet-afgeleide stamcellen (ADSCs) transfecteren in vitro, gevolgd door daaropvolgende transplantatie van genetisch gemodificeerde ADSCs overexpressie vasculaire endotheliale groeifactor (VEGF) in een muizenmodel van ischemie achterbeen . De uitkomsten werden geëvalueerd door het bijhouden lot van de cel met behulp van bioluminescentie beeldvorming, het beoordelen van weefsel reperfusie met behulp van laser Doppler perfusie beeldvorming (LDPI), en het bepalen van angiogenese en weefsel berging door histologie.

Protocol

1. Polymeer Synthese

1. In een zuurkast afgewogen 3523 mg butaandioldiacrylaat (C) en over te dragen aan een glazen scintillatieflesje met een roerstaafje.
2. Verwarm 5-amino-1-pentanol (32) tot 90 ° C om het zout oplosbaar dan in een zuurkast afgewogen 1.533 mg en 32 toevoegen scintillatieflesje met C. Deze methode resulteert in een molverhouding C: 32 = 1:1,2.
3. Plaats onmiddellijk de flacon met beide oplossingen op een roer plaat. Stel roer snelheid van 600 rpm.
4. Breng de scintillatieflesje een oven ingesteld op 90 ° C. Stel roersnelheid 1000 rpm gedurende 4 uur. Als de roerstaaf vast komt te zitten, hoe lager de snelheid. Na 4 uur, lagere snelheid 300 tpm en temperatuur van 90 ° C gedurende nog 12-16 uur.
5. Voeg 5 g C32 tot 10 ml watervrij tetrahydrofuran (THF) in een glazen scintillatieflesje met een roerstaafje. Wikkel in folie en vortex op hoog totdat volledig is opgelost.
6. In een aparte glazen scintillatieflesje containing een roerstaafje, voeg 10 mM Tetraethyleneglycoldiamine (122). Voeg 40 ml THF.
7. Plaats beide flacons (C32 en 122) op een roer plaat gedurende 5 minuten daarna samen te combineren. Bedek in folie en laat op kamertemperatuur roeren bij 400 rpm gedurende 24 uur. Het eindproduct wordt genoemd C32-122.
8. Weeg 5 x 50 ml Falcon buizen voor elk 5 g partij van C32-122. Let op de massa van elke buis in een notebook.
9. Overdracht 30 ml watervrije diethylether elk 50 ml Falcon buis.
10. Breng 10 ml C32-122 aan elk 50 ml Falcon buis.
11. Vortex Falcon buizen krachtig centrifugeer bij 2500 rpm gedurende 2 minuten. Opmerking: De geëxtraheerde polymeer in de basis van de buis.
12. Gooi de bovenste oplossing en herhaal de stappen 1.9 en 1.11 twee keer.
13. Plaats de open buizen met geëxtraheerd C32-122 in de exsiccator en vacuüm 's nachts. Zorg ervoor dat alle buizen worden beschermd tegen licht.
14. Weeg alle buisjes met C32-122 aan de uiteindelijke massa van de te bepalengeëxtraheerd polymeer.
15. Los het geëxtraheerde polymeer in watervrije DMSO bij een concentratie van 100 mg / ml.
16. Bewaar het opgeloste polymeer bij -20 ° C beschermd tegen licht en vocht.

2. Cel zaaien

1. Grondlaag basis van een T-150 weefselkweekfles met 0,1% (gew / vol) gelatine. De gelatine moet de kolf nog gedurende 30-45 minuten. De gelatine coating helpt hechting van ADSCs.
2. Zuig gelatine uit de pre-gecoate T-150 kolf.
3. Voeg 4 x 10 ⁶ ADSCs (≤ doorgang 3) aan de kolf in 20 ml DMEM dat 10% FBS, 1% penicilline / streptomycine en 10 ng / ml bFGF.
4. Plaats de T-150 kolf in de incubator bij 37 ° C, 5% _CO2 gedurende de nacht.
5. Begin transfectie procedure de volgende dag.

3. Nanodeeltjes Voorbereiding en transfectie

1. De volgende procedure is voor de bereiding van nanodeeltjes bevattende 16,1 pg plasmide DNA per1,0 x 10 ⁶ cellen in een polymeer gewichtsverhouding van 30:1 plasmide.
2. Verdun plasmide-DNA (1 mg / ml, pVEGF165, Aldevron, ND, USA) tot een eindconcentratie van 120 ug / ml natrium acetaat (25 mM) in een 15 ml Falcon buis.
3. Verdun C32-122 (100 mg / ml) tot een uiteindelijke concentratie van 3,6 mg / ml natrium acetaat (25 mM) in een tweede 15 ml Falcon buis.
4. Combineer de inhoud van elke Falcon buizen in een 15 ml Falcon buis en vortex onmiddellijk op hoog voor 10 sec.
5. Laat de buis op kamertemperatuur gedurende 10 minuten voor de nanodeeltjes vorming optreden.
6. Gedurende incubatie, vervangen medium in weefselkweek kolf met 7,8 ml volledig aangevuld DMEM per 1,0 x 10 ⁶ cellen getransfecteerd.
7. Breng de nanodeeltjes oplossing voor de weefselkweek kolf en kantel hem naar voren en naar achteren om gelijkmatig verspreid.
8. Plaats de weefselkweek kolf in de incubator bij 37 ° C, 5% _CO2 gedurende 4 uur.
9. Na 2 uur, vervang de nanoparkel bevattende media met DMEM.
10. Na een verdere 2 uur incubatie bij 37 ° C, 5% _CO2, de cellen klaar zijn voor in vivo injectie.

4. Achterbeen ischemie Procedure

1. Alle experimenten werden uitgevoerd in overeenstemming met de richtsnoeren van de Stanford Universiteit Animal Care en gebruik Comite en goedgekeurd APLAC protocollen. Het genereren van het muizenmodel van achterbeen ischemie wordt uitgevoerd zoals eerder beschreven. ⁸ Zie de referentie voor gedetailleerde instructies. Een korte beschrijving vindt u hieronder.
2. Plaats de muis onder verdoving met 1-3% isofluraan dosering bij inademing en zuurstof stroomsnelheid van 1 l / min. Zorgen narcose diepte door teen knijpen, vermindering van de ademhalingsfrequentie, en lethargie.
3. Haal haar uit de buikstreek en beide achterbeen gebieden van de muis met scheerschuim.
4. Maak insnijding in het midden van de mediale dij richting middellijn en vervolgens dwars door bedekkende vet pad naar exvormen de slagader.
5. Ligeren de slagader op twee locaties: distale plaats (dicht bij de knie) en proximale website (net distaal van de lies ligament).
6. Om de ligeringen maken, scheiden de slagader van de ader en draad een 5-0 zijden hechtdraad rond de slagader. Bind de slagader met twee knopen aan de ligatie te maken.
7. Verwijder de slagader tussen de twee punten ligatie.
8. Was het operatiegebied met PBS en vervolgens hechtdraad de incisie gesloten.
9. De anesthesie kan nu worden verwijderd. Houd de muis warm tot opnieuw ontwaken. Voor postoperatieve zorg kan 2-4 mg / kg lidocaïne subcutaan worden geïnjecteerd op de incisie voor hergebruik ontwaken. Verdere pijnbestrijding kunnen onderhuidse levering van 0.05-0.1 mg / kg buprenorfine bij 12 en 24 uur. Bewaak de gezondheidstoestand van de muizen een keer per dag gedurende zeven dagen door het observeren van veranderingen in ademhaling, openlijke pijn of angst, en huidskleur.
10. Bevestig achterbeen ischemie door laser Doppler perfusie beeldvorming.

5. Cel Injecties

1. Wanneer de getransfecteerde cellen en de muizen zijn klaar, wassen getransfecteerde cellen met PBS, trypsinize, centrifuge, en daarna tellen.
2. Resuspendeer cellen bij een dichtheid van 10 x 10 ⁶ cellen per ml in PBS.
3. Celsuspensies worden gescheiden in afzonderlijke Eppendorf buizen met een volume van 110 pl. Dit zorgt ervoor dat elke muis ontvangt evenveel cellen.
4. Plaats elke muis onder verdoving (2,5% isofluraan, 1 L / min zuurstof debiet).
5. Reinig de injectieplaats met alcohol doekjes.
6. Met behulp van een 27 G tuberculinespuit, stellen de cellen op en neer in de spuit te zorgen voor een homogene suspensie is verkregen. Opstellen 100 pi van de celsuspensie volume in de spuit.
7. Injecteer de helft van de celsuspensie in de adductor regio en vervolgens injecteren de andere helft in de kuitspier regio. Bij het injecteren, laat de spuit in de plaats voor minstens 15-30 sec totlekkage van de celsuspensie voorkomen.
8. Juiste bediening van de dieren onderzoek zijn: 1) cellen getransfecteerd met een niet-coderend plasmide (bijvoorbeeld plasmiden zonder biologische activiteit), 2) alleen cellen, en 3) PBS.
9. Wanneer injecties zijn voltooid, verwijdert u de muis van anesthesie en warm te houden totdat de muis opnieuw Awakes.

6. Bioluminescentieweergave

1. Om bioluminescentie imaging (BLI) beginnen, verdoven muizen zoals hierboven beschreven.
2. Reinig de injectieplaats met alcohol doekjes.
3. Gebruik makend insulinespuit, laadvermogen 100 ui 15 mg / ml D-luciferine (het substraat voor vuurvlieg luciferase). Houd substraat buurt van licht.
4. Om intraperitoneale injecties uit te voeren, houdt muizen door de huid van hun rug te trekken hun voorste huid strak. Breng de naald intraperitoneaal in de buikstreek en injecteer 100 ul van substraat.
5. Plaats de muis in de IVIS luciferase imaging kamer onder verdoving.
6. Afbeelding de muizen met een belichtingstijd van 1.0 minuten. Bij de parametrering, beginnen om beelden te verwerven.
7. Wanneer het beeld wordt verkregen, markeren de regio van belang zijn voor de luciferase signaal te meten. In dit geval, markeer de ischemische ledematen in de mobiele injectieplaats.
8. Blijf de luciferase signaal meten elke 3-5 min, totdat het signaal bereikt een piek en begint te dalen. Dit is de waarde gebruikt voor vergelijking tussen muizen en over verschillende tijdstippen.
9. Als het klaar is, verwijder dan de muizen uit de kamer en anesthesie. Blijf muizen warm tot opnieuw ontwaken.

7. Laser Doppler Perfusie

1. Laser Doppler perfusie beeldvorming wordt uitgevoerd zoals eerder beschreven. ⁸ De procedure wordt hier kort beschreven.
2. Voorafgaand aan Doppler de muis moet netjes geschoren zijn op de gebieden bovenliggende beide achterpoten en de buikstreek te artefact voorkomen dat ze door haar.
3. Wanneer bereid afbeelding Doppler, de mouse worden verdoofd zoals boven beschreven.
4. Verwarm de muis tot 36 ° C op een hete plaat, terwijl controle van de lichaamstemperatuur door rectale thermometer.
5. Plaats de muis op een niet-reflecterende zwarte oppervlak en houd verdoofd door neuskegel. De muis dient op zijn rug oppervlak worden geplaatst met zijn ledematen gelijkmatig blootgesteld.
6. Plaats de laser Doppler sensor ongeveer 15 cm boven de muis en leiden van de laserstraal van de sensor naar de liezen van de muis.
7. Wanneer de muis en de Doppler sensor in positie zijn, kunnen beelden worden gemaakt met behulp van de LDPIwin software door op de Start-knop.
8. Relatieve perfusiemetingen kunnen worden genomen door het aangeven van beide achterpoten (ischemische en niet-ischemische) als regio van belang (ROI). De verhouding van de gemiddelde perfusie van ischemisch de niet-ischemische achterpoot zal relatief perfusie geven.

8. Tissue Harvest Procedure

1. Wanneer bereid oogst muis tisaanklagen voor histologie en / of biochemische processen, moet de muis worden gedood. Hier wordt de muis gedood door blootstelling aan 5% isofluraan gedurende 3-5 min, vervolgens euthanasie de muis door cervicale dislocatie.
2. Snijd de bovenliggende huid rond de omtrek achterbeen aan het distale abdominale gebied en proximaal van het achterbeen. De huid wordt gesneden uit de ventrale naar de dorsale oppervlakken, zodat de huid kan worden teruggetrokken via achterbeen aan de voet.
3. Bij het trekken van de huid weer, kon het ledemaat worden geamputeerd door gebruik te maken van stompe dissectie schaar te knippen bij het bekken en dijbeen gewricht.
4. Twee belangrijke weefsels worden genomen voor analyse: de mediale adductoren en de gastrocnemius spieren.
5. Voor histologie, insluiten een of beide weefsels in optimale snijtemperatuur (oktober) voor cryosectioning.
6. Voor biochemische analyse, verzamel een of beide weefsels in een 1,5 ml Eppendorf en onderdompelen in een bad van vloeibare stikstof gedurende ten minste 2 minuten. De monsters kunnen wordenbewaard bij -80 ° C voor verdere verwerking.

Results

Na mengen, de positief geladen polymeer (C32-122) en negatief geladen DNA plasmide zichzelf assembleert in nanodeeltjes. Vorming van het nanodeeltje kan worden bevestigd door middel van elektroforese analyse dwz de complexvorming tussen C32-122 en plasmide-DNA wordt voorkomen dat de mobilisatie van het DNA tijdens de elektroforese. Het polymeer dient als een transfectie reagens om verbeterde opname van DNA in de doelcellen en de daaropvolgende expressie van coderend voor eiwitten (Figuur 2) te ...

Discussion

Hier melden wij een methode om volwassen stamcellen programmeren therapeutische factoren overexpressie behulp van niet-virale, biologisch afbreekbare nanodeeltjes. Dit platform is bijzonder bruikbaar voor het behandelen van ziekten waarbij stamcellen kan natuurlijk huis, zoals ischemie en kanker. ^9-10 In de non-virale gentherapie platform biedt voor transiënte overexpressie van therapeutische factoren, die geschikt is voor de meeste weefselregeneratie en wond genezingsproces. De transfectie proces afhankelijk...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
DMEM	Invitrogen	11965
Fetal Bovine Serum	Invitrogen	10082
Penicillin/Streptomycin	Invitrogen	15070
Basic Fibroblast Growth Factor	Peprotech	100-18B
1,4-Butanediol Diacrylate (90 %)	Sigma Aldrich	411744	Acronym: C
5-amino-1-pentanol (97 %)	Alfa Aesar	2508-29-4	Acronym: 32
Tetraethyleneglycoldiamine >99 %)	Molecular Biosciences	17774	Acronym: 122
Sodium Acetate	G-Biosciences	R010
Phosphate Buffered Saline	Invitrogen	14190-144
Tetrahyofuran Anhydrous (>99.9 %)	Sigma Aldrich	401757
Diethyl Ether Anhydrous (>99 %)	Fisher Scientific	E138-4
DMSO Anhydrous (>99.9 %)	Sigma Aldrich	276855
Gelatin	Sigma Aldrich	G9391
Trypsin-EDTA	Invitrogen	25200
D-luciferin	GoldBio
Optimal Cutting Temperature (O.C.T)	Tissue-Tek	4583
Rat anti-Mouse CD31	BD Pharmingen	550274
Alexa Fluor 594 anti-rat IgG	Invitrogen	A11007