Methodenartikel

Een snelle protocol voor de integratie Extrachromosomaal Arrays Met High Transmission Rate in de

9K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/50773

⸱

9 december 2013

 ,  ,  , 
1Université Claude Bernard Lyon, 2Centre de Génétique et de Physiologie Moléculaires et Cellulaires, CNRS UMR 5534

In dit artikel

Samenvatting

Dit protocol beschrijft een snelle en materiaalbesparende procedure voor de integratie van transgene extrachromosomale arrays in het Caenorhabditis elegans genoom met behulp van ultraviolette (UV) bestraling. Bovendien is dit protocol bijzonder geschikt voor transgene lijnen die extrachromosomale arrays met een hoge snelheid overdragen.

Samenvatting

Het micro-injecteren van DNA in het cytoplasma van de syncitiële gonade van Caenorhabditis elegans is de belangrijkste techniek die wordt gebruikt om transgene lijnen te vestigen die gedeeltelijke en variabele transmissiepercentages van extrachromosomale arrays naar de volgende generatie vertonen. Bovendien zijn transgene dieren mozaïek en drukken het transgen uit in een variabel aantal cellen. Extrachromosomale arrays kunnen in het C. elegans genoom worden geïntegreerd met behulp van UV-bestraling om niet-mozaïsche transgene stammen met 100% transmissiepercentage van het transgen te vestigen. In dit opzicht worden F1-nakomelingen van UV-bestraalde transgene dieren gescreend op dieren die een heterozygote integratie van het transgen dragen, wat leidt tot een Mendeliaanse transmissiepercentage van 75% naar de F2-nakomelingen. Een van de uitdagingen van deze methode is om onderscheid te maken tussen het percentage transgen-transmissie in een populatie voor (X% transgene dieren) en na integratie (≥75% transgene F2-dieren). Daarom vereist deze methode het kiezen van een niet-geïntegreerde transgene lijn met een percentage transgene dieren dat significant lager is dan de Mendeliaanse segregatie van 75%. Bijgevolg worden niet-geïntegreerde transgene lijnen met een transmissiepercentage van extrachromosomale arrays naar de volgende generatie ≤60% meestal geprefereerd voor integratie, en transgen-integratie in sterk overdragende stammen is moeilijk. Hier laten we zien dat de efficiëntie van integratie van extrachromosomale arrays in het genoom toeneemt wanneer hoog overdragende transgene lijnen worden gebruikt (≥80%). Het beschreven protocol maakt eenvoudige selectie mogelijk van verschillende onafhankelijke lijnen met homozygote transgen-integratie in het genoom na UV-bestraling van transgene wormen die een hoge transmissie van extrachromosomale arrays vertonen. Bovendien is deze methode vrij snel en vereist weinig materiaal. De mogelijkheid om snel verschillende lijnen te genereren die een bepaald geïntegreerd transgen tot expressie brengen, is van groot belang voor studies gericht op genexpressiepatroon en -regulatie, eiwitlokalisatie en -overexpressie, evenals voor de ontwikkeling van subcellulaire markers.

Inleiding

Transgenen worden veelvuldig gebruikt in C. elegans voor een groot scala aan toepassingen. Transgene stammen worden meestal gegenereerd door DNA-injectie in de syncitiële hermafrodiet gonaad1,2. Het DNA dat het transgene van belang draagt, wordt meegeïnjecteerd met plasmiden die coderen voor co-injectiemarkers1,3,4. Co-injectiemarkers zijn gevestigde transgenen die leiden tot de expressie van een fluorescerende eiwit of tot een specifiek gedrags- of morfologisch fenotype. De geïnjecteerde DNA's herschikken zich om multi-copy extrachromosomale arrays te vormen; dus worden het transgene van belang en de co-injectiemarker samen overgedragen5,4. Transgene lijnen worden geselecteerd in de F2-generatie van geïnjecteerde dieren door het volgen van het fenotype geïnduceerd door de expressie van de co-injectiemarker (fluorescentie of specifiek fenotype)1. Transgene lijnen vertonen gedeeltelijke en variabele transmissiepercentages van de extrachromosomale arrays naar de volgende generatie. Afhankelijk van de stam erft 10-100% (100% is een zeldzaam voorval) van de dieren extrachromosomale arrays. Bovendien zijn transgene dieren mozaïek en drukken het transgene uit in een variabel aantal cellen. Dit mozaïcisme is waarschijnlijk gecorreleerd met de transmissiepercentage naar de volgende generatie. Inderdaad, zowel in de geslachtslijn als in somatische cellen hangt de transmissiepercentage af van de segregatie van de extrachromosomale arrays tijdens celdelingen. Een manier om dit probleem te vermijden is om het transgene in het genoom te integreren. Klassiek gezien vertrouwt de integratie van een transgene in een chromosoom op bestraling (ultraviolet of gamma) van transgene wormen die extrachromosomale arrays dragen3. In het kort worden 50-100 hermafrodiet dieren bestraald in het L4-larvestadium. In de F1-generatie worden 200-800 transgene dieren geselecteerd en individueel gekweekt op platen. Volgens Mendeliaanse segregatie zouden transgene F1-dieren die een heterozygote integratie van het transgene in het genoom dragen, 1/2 van transgene nakomelingen produceren die heterozygoot zijn voor de geïntegreerde array, 1/4 van transgene nakomelingen zijn homozygoot voor de geïntegreerde array en 1/4 van nakomelingen die de array niet hebben geïntegreerd (Figuur 1). Dus worden platen met de F2-generatie visueel gescreend op ≥75% transgene dieren zoals waargenomen door de expressie van de co-injectiemarker. Ongeveer 1/3 van de F2-dieren die zijn geselecteerd als integratiekandidaten wordt verondersteld homozygoot te zijn voor de geïntegreerde array en 100% van homozygote F3-dieren te produceren. Dus, van elke geselecteerde plaat worden drie tot acht transgene F2-dieren individueel gekweekt en platen met 100% transgene nakomelingen worden geselecteerd. Vervolgens worden acht F3-dieren individueel gekweekt om de 100% overerving van het transgene te bevestigen.

De belangrijkste nadelen van deze methode zijn dat

  1. het een visuele screening van enkele honderden F1-platen voor ≥75% transgene F2-nakomelingen vereist, wat tijdrovend is vanwege het variabele en onvoorspelbare percentage van transmissie van niet-geïntegreerde extrachromosomale arrays. Als alternatief, om de screening van F1-platen te vermijden, kunnen na bestraling van P0-dieren verschillende opeenvolgende hongerstaps worden uitgevoerd; gevolgd door het plukken van 100 transgene dieren en screenen voor 100% transgene nakomelingen3.
  2. het niet geschikt is voor stammen met een percentage transmissie van extrachromosomale arrays hoger dan 60% aangezien dit percentage moeilijk te onderscheiden is van 75%.
  3. aangezien alleen stammen met een relatief lage transmissiepercentage kunnen worden gebruikt, is een hoog aantal bestraalde transgene P0-dieren noodzakelijk evenals de observatie van talrijke F1- en F2-dieren, wat zeer tijdrovend is en een aanzienlijk aantal platen vereist.

De bestraling van wormen induceert vermoedelijk dubbelstrengsbreuken in het DNA en integratie van extrachromosomale arrays in chromosomen vindt plaats tijdens DNA-herstel. Dus is het waarschijnlijk dat de kansen om succesvolle bestraling-gemedieerde integratie te verkrijgen direct evenredig zijn aan het aantal geslachtslijncellen dat een extrachromosomale array draagt. Stammen met een hoge transmissiepercentage kunnen meer transgene DNA-arrays bevatten dan stammen met een laag transmissiepercentage zoals gesuggereerd in2, en een hoger aantal geslachtslijncellen vertonen die extrachromosomale arrays dragen. Dus redeneerden we dat in lijnen met een hoge transmissie, transgenen gemakkelijker te integreren kunnen zijn dan in lijnen met een laag transmissiepercentage. Echter, het standaardprotocol sluit de mogelijkheid uit om transgenen met hoog transmissiefrequentie te integreren aangezien het percentage van transgene dieren met een niet-geïntegreerde extrachromosomale array nauwelijks kan worden onderscheiden van dat van de nakomelingen van een F1-dier dat een heterozygote integratie van het transgene in het genoom draagt (Figuur 1).

Hier laten we zien dat voor een bepaald transgene, het aantal geïntegreerde lijnen dat wordt teruggevonden na bestraling met ultraviolet (UV) licht afhankelijk is van het initiële percentage transmissie van de niet-geïntegreerde array. We presenteren een verbeterd protocol voor UV-bestraling-gemedieerde transgene-integratie dat bijzonder relevant is voor lijnen die een hoog percentage transmissie van transgene array vertonen.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

1. Culturing Transgenic Nematodes Prior to Integration

Transgene lijningen kunnen worden gegenereerd zoals beschreven in1. Deze lijningen bevatten meestal een co-injectie marker plasmide dat leidt tot de expressie van een fluorescente eiwit of tot een specifiek gedrags- of morfologisch fenotype in een bepaalde ontwikkelingsfase1,3. Dit integratieprotocol kan worden toegepast op stammen die fluorescente of niet-fluorescente co-injectie markers tot expressie brengen. In het voorbeeld dat volgt, werd een stam met een fluorescente co-injectie marker gebruikt.

  1. Bereid kweekplaten voor:
    1. Bereid ongeveer 500 grote 60 mm Petri-schalen voor, die asseptisch zijn gevuld met elk 10 ml Nematode Growth Medium (NGM)6,7.
    2. Bewaar elke plaat met 0,3 ml van een verzadigde Escherichia coli OP50 cultuur volgens standaardprocedure6,7.
  2. Evalueer de transmissie snelheid van de te integreren transgene lijn:
    1. Voor elke transgene lijn, pluk tien fluorescente gravide volwassenen op tien afzonderlijke kweekplaten onder een fluorescente stereoscoop met behulp van een worm pick zoals beschreven in7.
    2. Kweek de dieren in een worm incubator bij 15-25 °C (afhankelijk van de genetische achtergrond) om de wormen te laten reproduceren.
    3. Observeer de nakomelingen elke dag om te evalueren op welk ontwikkelingsstadium de co-injectie marker wordt tot expressie gebracht en het best kan worden waargenomen. De expressie van de meeste momenteel gebruikte co-injectie markers wordt waargenomen in het L4 larvenstadium of op volwassen leeftijd.
    4. Evalueer de transmissie snelheid van de nakomelingen door het percentage van fluorescente nakomelingen te bepalen door observatie onder een fluorescente stereoscoop.
  3. Kies een transgene lijn voor transgen integratie:
    1. Selecteer de transgene lijn met de hoogst mogelijke transmissie snelheid (idealiter ≥80%).
  4. Verkrijg een populatie van transgene dieren gesynchroniseerd in het L4 larvenstadium voor integratie:
    1. Pluk 30 fluorescente gravide volwassenen op vijf kweekplaten (zes dieren per plaat).
    2. Laat de wormen 3-4 uur eieren leggen bij 15 °C.
    3. Verwijder de volwassenen van de platen na controle op de aanwezigheid van minimaal 30 eieren per plaat.
    4. Kweek de dieren in een worm incubator bij 15-25 °C tot de nakomelingen het L4 larvenstadium bereiken (96 uur bij 15 °C of 36 uur bij 25 °C).

2. UV Irradiatie en Herstel van Transgene Wormen

  1. Worm irradiëren:
    1. Pluk 30-100 fluorescente transgene L4 dieren op afzonderlijke kweekplaten (15-20 dieren per plaat).
    2. Plaats de platen, met de deksels verwijderd, in een UV cross-linker. Irradieer de wormen bij 0,012 J/cm2. Merk op dat stammen meer of minder gevoelig zijn voor UV en dat resultaten kunnen variëren afhankelijk van de gebruikte UV irradiator. Een dosisbereik tussen 0,010-0,015 J/cm2 kan worden getest.
  2. Worm herstel na bestraling:
    1. Plaats platen met bestraalde wormen een nacht bij 15 °C voor herstel.
    2. Controleer het aantal dieren dat in leven is. In onze ervaring is een overlevingspercentage van ongeveer 80-90% geschikt voor een efficiënte bestraling.
    3. Kweek de bestraalde dieren bij 15-25 °C tot de nakomelingen het ontwikkelingsstadium hebben bereikt dat toelaat om de expressie van de co-injectie marker waar te nemen, zoals vastgesteld in stap 1.2.

3. Isolatie van Geïntegreerde Transgene Lijnen

  1. Selectie van F1 dieren:
    1. Pluk één 150-200 fluorescente F1 dieren op afzonderlijke kweekplaten. Voor lijnen met een hoge transmissie (≥80%), zijn 100 F1 dieren voldoende.
    2. Bewaar deze F1 platen bij 15-25 °C tot de nakomelingen een geschikt stadium bereiken voor de observatie van fluorescente F2 dieren.
    3. Verwerp alle F1 platen die i) geen nakomelingen vertonen, wat aangeeft dat het F1 dier steriël was of is gestorven, of ii) geen of slechts enkele fluorescente F2 dieren, wat aangeeft dat het F1 dier het transgeen niet heeft overgedragen met de verwachte snelheid. Deze stap is snel en vertegenwoordigt een reëel voordeel in vergelijking met het standaardprotocol dat een schatting van het percentage van fluorescente F2 wormen vereist om F1 platen te selecteren met ≥75% fluorescente nakomelingen (Tabel 1).
  2. Selectie van F2 dieren:
    1. Pluk vier fluorescente transgene F2 dieren van elke geselecteerde F1 plaat. Bij gebruik van fluorescente transgenen (bijvoorbeeld mCherry8, gfp9, of dsRed10), pluk F2 wormen met een hoog niveau van fluorescentie, aangezien dit kan aangeven dat deze dieren homozygoot zijn voor de geïntegreerde array. Merk op dat bij het plukken van F2 dieren het kritisch is om geen eieren of larven mee te nemen, om valse negatieven in de volgende stap te voorkomen.
    2. Kweek F2 dieren bij 15-25 °C.
  3. Isolatie en validatie van geïntegreerde transgene stammen:
    1. Screen F2 platen

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

Integraties van transgenen in twee verschillende lijnen die extrachromosomale arrays overdragen met ongeveer dezelfde frequentie (50-60%) werden uitgevoerd met behulp van de standaard- en de verbeterde protocollen (Tabel 1). Het standaardprotocol maakte de recoverie mogelijk van drie onafhankelijke geïntegreerde lijnen na UV-bestraling van 91 transgene L4-dieren, terwijl het verbeterde protocol de recoverie mogelijk maakte van één geïntegreerde lijn na UV-bestraling van 30 transgene L4-dieren. Dit sugger...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

Het hier beschreven protocol biedt een efficiënte methode om extrachromosomale transgene arrays te integreren in het genoom van C. elegans. Met behulp van verschillende niet-geïntegreerde lijnen, die hetzelfde transgen Pdyc-1::dyc-1::gfp (pKG45) met verschillende snelheden overdragen (10-15%, 50-60% en >80%), toonden we aan dat het aantal geïntegreerde stammen dat na UV-bestraling wordt teruggevonden, afhankelijk is van het oorspronkelijke transmissieniveau van de niet-geïntegreerde lijn (Tabel ...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs verklaren dat zij geen concurrerende financiële belangen hebben.

Dankbetuigingen

De auteurs willen Claire Lecroisey en Laurent Ségalat bedanken voor het genereren van niet-geïntegreerde Pdyc-1::dyc-1::gfp; Pmyo-2::dsRed en Pmyo-3::gfp transgene stammen. We danken Andy Fire voor het geschenk van het Pmyo-2::dsRed plasmid en Pamela Hoppe voor het geschenk van het Pmyo-3::gfp plasmid. Dit werk werd mogelijk gemaakt door het Franse Nationaal Centrum voor Wetenschappelijk Onderzoek (CNRS) en de Claude Bernard Universiteit van Lyon.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
AgarProlabo20768.292voor NGM (nematode groeimedium) voorbereiding (6,7)
NaClChimie-Plus40045voor NGM voorbereiding
Bacto-peptoneBD211820voor NGM voorbereiding
KH2PO4Roth3904-1voor NGM voorbereiding
K2HPO4Prolabo26930.293voor NGM voorbereiding
MgSO4RothP027.2voor NGM voorbereiding
CaCl2Prolabo22317.297voor NGM voorbereiding
CholesterolRectapurvoor NGM voorbereiding
LB-brothSigmaL3022voor kweek van OP50 bacteriën
EQUIPMENT
U.V. cross-linkerFischer ScientificGolflengte 254 nm
Microscope SteREO Discovery V8Carl Zeiss, Inc.
Petri schotels, 60 mmCMLBPS55E6
Platinium draad 0.25 mmAlfa Aesar7440-06-4Om een pick voor wormen te maken (7)

Referenties

  1. Berkowitz, L. A., Knight, A. L., Caldwell, G. A., Caldwell, K. A. Generation of stable transgenic C. elegans using microinjection. J. Vis. Exp. (18), e833(2008).
  2. Mello, C., Kramer, J. M., Stinchlomb, D., Ambros, V. Efficient gene transfer in C.elegans: extrachromosomal maintenance and integration of transforming sequences. EMBO J. 10 (12), 3959-3970 (1991).
  3. Transformation and microinjection. WormBook. Evans, T. C. , The C. elegans Research Community, WormBook. (2006).
  4. Hobert, O. PCR Fusion-Based Approach to Create Reporter Gene Constructs for Expression Analysis in Transgenic C. elegans. BioTechniques. 32, 728-730 (2002).
  5. Stinchcomb, D. T., Shaw, J. E., Carr, S. H., Hirsh, D. Extrachromosomal DNA transformation of Caenorhabditis elegans. Mol. Cell. Biol. 5, 3484-3496 (1985).
  6. Brenner, S. The genetics of Caenorhabditis elegans. Genetics. 77, 71-94 (1974).
  7. Chaudhuri, J., Parihar, M., Pires-daSilva, A. An Introduction to Worm Lab: from Culturing Worms to Mutagenesis. J. Vis. Exp. (47), e2293(2011).
  8. Merritt, C., Rasoloson, D., Gallo, C., Voronina, E., Ko, D., Seydoux, G. A modular vector kit for transgenesis in C. elegans. International Worm Meeting. , (2007).
  9. Chalfie, M., Tu, Y., Euskirchen, G., Ward, W., Green Prasher, D. Fluorescent protein as a marker for gene expression. Science. 263, 802-805 (1994).
  10. Fleenor, J., Fire, A. Discosoma sp. Red Fluorescent Protein (dsRED) as a reporter in C. elegans. Worm Breeder's Gazette. 16 (3), 16(2000).
  11. Lecroisey, C., et al. ZYX-1, the unique zyxin protein of Caenorhabditis elegans, is involved in dystrophin-dependent muscle degeneration. Mol. Biol. Cell. , (2013).
  12. Praitis, V., Casey, E., Collar, D., Austin, J. Creation of low-copy integrated transgenic lines in Caenorhabditis elegans. Genetics. 157 (3), 1217-1226 (2001).
  13. Frøkjaer-Jensen, C., et al. Single-copy insertion of transgenes in Caenorhabditis elegans. Nat. Genet. 40 (11), 1375-1383 (2008).
  14. Dickinson, D. J., Ward, J. D., Reiner, D. J., Goldstein, B. Engineering the Caenorhabditis elegans genome using Cas9-triggered homologous recombination. Nat. Methods. 10 (10), 1028-1034 (2013).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

UV bestralingselectie van transgene lijnenfluorescentiescreeninghomozygote integratieanalyse van de transmissiesnelheidscreening van F1 nakomelingenF2 plaatselectiegeneratie van onafhankelijke stammen

Gerelateerde artikelen