We demonstreren een eenvoudige multiplex PCR-test voor snel screenen en typeren van Staphylococcal Cassette Chromosome mec (SCCmec) typen I-V voor methicilline-resistente Staphylococcus aureus, en bieden enkele van de essentiële stappen en procedurele nuances die het succesvol maken om deze test aan te passen aan individuele laboratoria.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Multiplex PCR-test voor het typen van Staphylococcus Cassette Chromosome Mec Types I tot en met V in Methicilline-resistente
In dit artikel
Erratum-melding
Important: There has been an erratum issued for this article. View Erratum Notice
Samenvatting
Samenvatting
Staphylococcen Cassette Chromosome mec (SCC mec) typen is een zeer belangrijke moleculaire tool voor het begrijpen van de epidemiologie en klonale stam verwantschap van methicilline-resistente Staphylococcus aureus (MRSA), met name de opkomende uitbraken van de gemeenschap-geassocieerde MRSA (CA-MRSA) die zich op een wereldwijde basis. Traditionele PCR typering's classificeren SCC mec door targeting en identificeerbaar is mec en ccr gen complexe vormen, maar vereisen het gebruik van veel primer sets en meerdere afzonderlijke PCR experimenten. We ontwierpen en publiceerde een eenvoudige multiplex PCR-test voor het snel-screening van grote SCC mec types en subtypes I tot V, en later bijgewerkt als beschikbaar werd nieuwe sequentie-informatie. Deze eenvoudige test richt zich op individuele SCC mec types in een enkele reactie, is het gemakkelijk te interpreteren en is uitgebreid wereldwijd gebruikt. Vanwege de verfijnde nature van de test en het grote aantal primers in de reactie, is de kans op problemen tijdens de aanpassing van deze assay aan elk laboratorium. Om het proces van de oprichting van een MRSA SCC mec test te vergemakkelijken, hier laten we zien hoe het opzetten van onze multiplex PCR-test, en bespreken een aantal van de essenti
Inleiding
Methicilline-resistente Staphylococcus aureus (MRSA) is overgenomen en ge....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
Deze procedures moeten worden uitgevoerd in een gecertificeerde bioveiligheidsniveau 2 laboratorium. Geschikte persoonlijke beschermingsmiddelen zoals handschoenen en witte jassen moeten worden gebruikt op alle tijden.
1. Monstervoorbereiding
- Verse overnight plaat culturen van MRSA zijn vereist. Op de dag voor PCR gedaan moet worden, selecteert u een enkele kolonie van MRSA met een steriele cultuur stok en bereiden een zware streep van de bacteri....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
Deze bijgewerkte M-PCR is in staat om SCCmec-typen I-V te bepalen (classificeren), evenals de belangrijkste subtypen van SCCmec IV. De assay richt zich op unieke en specifieke loci van SCCmec I, II, III, IVa, IVb, IVc, IVd, IVE en V, met gelijktijdige detectie van het mecA-gen. Voorlopige identificatie van SCCmec VI en VIII is ook mogelijk, maar zou verdere testen vereisen ter bevestiging. Figuur 3 illustreert representatieve SCCmec I-VI en VIII en de.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
De hier beschreven multiplex PCR-assay biedt een eenvoudige, betrouwbare methode voor het classificeren van typen en belangrijke subtypes van SCCmec I-V in Staphylococci, met gelijktijdige onderscheiding van MRSA van MSSA. De assay is robuust, gemakkelijk uit te voeren in een enkele PCR-reactie en de resultaten zijn eenvoudig te interpreteren. De assay heeft wel beperkingen, omdat hij zich richt op individuele loci binnen elk SCCmec-type, maar biedt geen uitgebreide ccr- en mec-complex.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
Geen belangenconflicten verklaard.
Dankbetuigingen
We danken T. Ito, K. Hiramatsu, R. Daum, H. de Lencastre en D. Coleman voor de vriendelijke gift van enkele referentiestammen die in dit onderzoek zijn gebruikt. Dit werk werd gedeeltelijk financieel ondersteund door het Centre for Antimicrobial Resistance (CAR), Alberta Health Services-Calgary/Calgary Laboratory Services/University of Calgary.
....Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| Tryptic Soy Agar | Fisher (BD) | CA90002-700 (236920) | |
| Sterieel gedistilleerd water | Life Technologies | 10977-015 | |
| Platinum Taq: inclusief 10x PCR buffer en 50 mM MgCl2 | Life Technologies | 10966-034 | |
| 100 mM dNTP | Life Technologies | 10297-018 | |
| Tris base | Sigma-Aldrich | T6066 | |
| Boorzuur | Sigma-Aldrich | B7901 | |
| EDTA | Life Technologies | 15576-028 | |
| Agarose | Life Technologies | 16500-500 | |
| Glycerol | Life Technologies | 15514-011 | |
| Broomfenolblauw | Sigma-Aldrich | B8026 | |
| 1Kb+ DNA ladder | Life Technologies | 10787-026 | |
| Ethidiumbromide | Sigma-Aldrich | E7637 | |
| 1,5 ml microcentrifugebuisjes | VWR (Axygen Scientific) | 10011-700 | |
| Cultuurstokjes | VWR | CA10805-018 | |
| PCR buisjes | Diamed | AD0210-FCN (nieuw nummer: DIATEC420-1250) | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5417c | |
| Heat block | VWR | 13259-030 / 13259-286 | |
| Thermische cycler | Applied Biosystems (2720) | 4359659 | |
| Horizontaal, dompelbaar gelelektroforese systeem met gelvorm | BioRad | 170-4469 | |
| Voeding | BioRad | 164-5050 | |
| Roterende schudler | VWR | 40000-300 | |
| Moleculair beeldvormingsgel Doc systeem | BioRad | 1708170 |
Referenties
- IWG-SCC. Classification of staphylococcal cassette chromosome mec (SCCmec): guidelines for reporting novel SCCmec elements. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 53 (12), 4961-4967 (2009).
- Ito, T., Hiramatsu, K., Tomasz, A., de Lencastre, H., Perreten, V., Holden, M., et al.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
Erratum
Formal Correction: Erratum: Multiplex PCR Assay for Typing of Staphylococcal Cassette Chromosome Mec Types I to V in Methicillin-resistant Staphylococcus aureus
Posted by JoVE Editors on 3/19/2019. Citeable Link.
An erratum was issued for: Multiplex PCR Assay for Typing of Staphylococcal Cassette Chromosome Mec Types I to V in Methicillin-resistant Staphylococcus aureus. There was a typo in Table 1.
In Table 1, the Oligonucleotide sequence for Type III-F5 was updated from:
TTCTCATTGATGCTGAAGCC
To:
GAAACTAGTTATTTCCAACGG
