Een gevoelige en specifieke kwantificering Methode voor het bepalen van Serum cardiale myosine bindend eiwit C door elektrochemiluminescentie-Immunoassay

Summary

Het meten van biomarkers in complexe biologische monsters wordt in toenemende mate leidend klinische besluitvorming. We beschrijven een zeer gevoelige methode voor het gelijktijdig meten cardiale myosine bindend eiwit C, creatine kinase MB, troponine I en in serummonsters van patiënten met myocardiaal infarct en gezonde controlepersonen.

Abstract

Biomarkers worden steeds belangrijker in de klinische besluitvorming, evenals fundamentele wetenschap. Diagnose van myocardiaal infarct (MI) wordt grotendeels bepaald door het detecteren van cardiaal-specifieke eiwitten in serum of plasma van patiënten als indicator van myocardiale schade. Onlangs hebben aangetoond dat cardiale myosine bindend eiwit C (cMyBP-C) detecteerbaar is in het serum na MI, hebben we voorgesteld als potentiële biomarker voor MI. Biomarkers worden typisch gedetecteerd door traditionele sandwich enzyme-linked immunosorbent assays. Deze techniek vereist een groot monstervolume, een klein dynamisch bereik, en kan slechts een eiwit meten tegelijk.

Hier laten we een multiplex immunoassay waarbij drie cardiale eiwitten gelijktijdig worden gemeten met een hoge gevoeligheid. Meten cMyBP-C in Uniplex of samen met creatine kinase MB en troponine I toonde vergelijkbare gevoeligheid. Deze techniek maakt gebruik van de Meso Scale Discovery(MSD) methode van multiplexen in een 96-wells plaat in combinatie met electrochemiluminescence voor detectie. Terwijl slechts kleine steekproef volumes nodig zijn, worden hoge gevoeligheid en een groot dynamisch bereik gerealiseerd. Met deze techniek, hebben we gemeten cMyBP-C, creatine kinase MB, en cardiale troponine I niveau in het serum monsters van 16 patiënten met MI en vergeleken de resultaten met 16 controlepersonen. We waren in staat om alle drie de markers te detecteren in deze monsters en vond alle drie biomarkers worden verhoogd na MI. Deze techniek is daarom geschikt voor de gevoelige detectie van cardiale biomarkers in serummonsters.

Introduction

Het meten van lage hoeveelheden eiwit in complexe biologische monsters, zoals serum, wordt steeds klinisch belang voor patiëntbehandeling, alsmede fundamentele wetenschap. Bijvoorbeeld, een de serumniveaus van cardiale biomarkers, zoals troponine I, in een klinische setting is met acuut myocardiaal infarct (MI) ^1. Om eiwitten in serummonsters detecteren standaard enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) is de meest gebruikte techniek omdat het hogere gevoeligheid en maakt absolute kwantificering van de analyt. Echter, traditionele ELISA een betrekkelijk grote hoeveelheid monster (meestal 100 pl), hoge achtergrondsignaal in sommige biologische vloeistoffen....

Protocol

1. Uniplex cMyBP-C Assay

1. De dag voor het experiment, de vacht van de 96-well MSD kale standaard plaat met invangantilichaam. Voor cMyBP-C is een 30 gl volume van muizen monoklonaal anti-cMyBP-C-antilichaam (gelatinevrije) bij een concentratie van 5 ug / ml verdund in fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS).
2. Omdat het goed is hydrofoob, pipet de oplossing in de rechter benedenhoek van de put; tik op de zijkanten van de plaat aan de oplossing over de gehele goed verspreid.
3. De plaat is bedekt met een plaat sealer en gedurende O / N bij 4 ° C zonder schudden.
4. Verwijder de invangantilichaam oplossing door te tikken op de oplossing u....

Results

De basisprincipes en workflow van de 3-plex assay worden getoond in figuur 1, en ​​de algehele werkstroom wordt beschreven in Tabel 1. Uniplex assays werken volgens hetzelfde principe, behalve dat de gehele onderkant goed bekleed met een capture-antilichaam. Signaaldetectie uitgevoerd door ECL waarbij een elektrisch signaal wordt toegevoerd aan de bodem van de put. Dit op zijn beurt, initieert een lokale productie van licht door een chemische reactie van de lees-buffer met SULFO TAG-lab.......

Discussion

In deze studie tonen we de toepassing van een multiplex immunoassay voor de detectie van meerdere cardiale biomarkers in serum van patiënten. Deze techniek heeft vele voordelen ten opzichte van traditionele ELISA. Eerst ECL in de testkit wordt gebruikt in plaats van colorimetrische detectie. In ECL, een elektrisch signaal stimuleert de lokale productie van de gemeten eigenschap (licht), waardoor het ontkoppelen van de stimulatie gebeurtenis het signaal, waarbij die ¹⁴ vermindert. Dit maakt hoge gevoeligheid, .......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Reagents
MSD Read-Buffer T (4X) with surfactant	Meso Scale Discovery	R92TC-2
Tween-20	Acros	9005-64-5
MSD Blocker A	Meso Scale Discovery	R93BA-1
Phosphate buffered saline, 10X	Fisher BioReagents	BP399-4	Filter before use
Myosin binding protein C antibody, mouse monoclonal (E7), gelatin free	Santa Cruz	SC-137180L	For coating, antibody has to be gelatin free
Plates and Equipment
Multi-Array 96-well standard plate	Meso Scale Discovery	L15XA-3
A prototype 3-plex, four-spot, 96-well plate with cMyBP-C, cTnI and CK-MB	Meso Scale Discovery	N452A-1
ThermaSeal Sealing Film	Life Science Products Inc.	ST-3098
MSD SECTOR Imager 2400A	Meso Scale Discovery
MTS 2/4 digital microtiter shaker	IKA	3208001