Een gevoelige en specifieke kwantificering Methode voor het bepalen van Serum cardiale myosine bindend eiwit C door elektrochemiluminescentie-Immunoassay

Summary

Het meten van biomarkers in complexe biologische monsters wordt in toenemende mate leidend klinische besluitvorming. We beschrijven een zeer gevoelige methode voor het gelijktijdig meten cardiale myosine bindend eiwit C, creatine kinase MB, troponine I en in serummonsters van patiënten met myocardiaal infarct en gezonde controlepersonen.

Abstract

Biomarkers worden steeds belangrijker in de klinische besluitvorming, evenals fundamentele wetenschap. Diagnose van myocardiaal infarct (MI) wordt grotendeels bepaald door het detecteren van cardiaal-specifieke eiwitten in serum of plasma van patiënten als indicator van myocardiale schade. Onlangs hebben aangetoond dat cardiale myosine bindend eiwit C (cMyBP-C) detecteerbaar is in het serum na MI, hebben we voorgesteld als potentiële biomarker voor MI. Biomarkers worden typisch gedetecteerd door traditionele sandwich enzyme-linked immunosorbent assays. Deze techniek vereist een groot monstervolume, een klein dynamisch bereik, en kan slechts een eiwit meten tegelijk.

Hier laten we een multiplex immunoassay waarbij drie cardiale eiwitten gelijktijdig worden gemeten met een hoge gevoeligheid. Meten cMyBP-C in Uniplex of samen met creatine kinase MB en troponine I toonde vergelijkbare gevoeligheid. Deze techniek maakt gebruik van de Meso Scale Discovery(MSD) methode van multiplexen in een 96-wells plaat in combinatie met electrochemiluminescence voor detectie. Terwijl slechts kleine steekproef volumes nodig zijn, worden hoge gevoeligheid en een groot dynamisch bereik gerealiseerd. Met deze techniek, hebben we gemeten cMyBP-C, creatine kinase MB, en cardiale troponine I niveau in het serum monsters van 16 patiënten met MI en vergeleken de resultaten met 16 controlepersonen. We waren in staat om alle drie de markers te detecteren in deze monsters en vond alle drie biomarkers worden verhoogd na MI. Deze techniek is daarom geschikt voor de gevoelige detectie van cardiale biomarkers in serummonsters.

Introduction

Het meten van lage hoeveelheden eiwit in complexe biologische monsters, zoals serum, wordt steeds klinisch belang voor patiëntbehandeling, alsmede fundamentele wetenschap. Bijvoorbeeld, een de serumniveaus van cardiale biomarkers, zoals troponine I, in een klinische setting is met acuut myocardiaal infarct (MI) ^1. Om eiwitten in serummonsters detecteren standaard enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) is de meest gebruikte techniek omdat het hogere gevoeligheid en maakt absolute kwantificering van de analyt. Echter, traditionele ELISA een betrekkelijk grote hoeveelheid monster (meestal 100 pl), hoge achtergrondsignaal in sommige biologische vloeistoffen, en zijn beperkt tot het meten van slechts een analyt per ELISA ^2.

Onlangs werd een nieuwe immunoassay techniek leidt dat veel van deze nadelen omzeilt. Deze gemodificeerde test, ontwikkeld door MSD, gebruikt electrochemiluminesclingen (ECL) voor signaaldetectie, die zorgt voor een zeer lage achtergrond en een verhoogde gevoeligheid, waardoor het gebruik van kleine monstervolumes. Electrochemiluminescence is gebaseerd op het reportermolecuul ruthenium (II) trisbipyridal, die is bevestigd aan de detectie-antilichamen. Het reportermolecuul zendt licht bij 620 nm van de elektrische stimulatie van de bodem van de 96-well plaat die koolstof elektroden geïntegreerd in deze ³ heeft. Ook, door spot coating, verschillende capture antilichamen kunnen worden aangebracht in een putje (tot 10 op een 96-well plaat), waardoor gelijktijdige kwantificering van verschillende eiwitten in een monster ^4. Deze techniek Onlangs is een pro-inflammatoire cytokine profielen ^5,6 serum meten. De multiplex platen van MSD gunstig in vergelijking met andere multiplex assay platformen ^7.

Met behulp van MSD als de primaire-test platform, hebben we verder een op maat gemaakte 3-plex plaat ontwikkeld dat cEen gelijktijdig kwantificeren van het niveau van cardiale myosine bindend eiwit C (cMyBP-C), creatine-kinase MB (CK-MB) en cardiaal troponine I (cTnI) en de resultaten werden vergeleken met monoplex detectie van cMyBP-C. CK-MB en troponine zijn gevestigde biomarkers voor MI. Echter, toename van deze biomarkers worden veroorzaakt door andere dan MI pathologieën, zoals myocarditis of nierfalen ^8. Dit pleit voor het toevoegen van extra biomarkers om de specificiteit van de MI diagnose te verhogen. We hebben onlangs aangetoond dat cMyBP-C is ook een potentiële biomarker voor MI ^9. cMyBP-C is een dikke filament geassocieerd eiwit dat tot expressie gebracht in het hart, ^10-12 maar niet in skeletspieren en gladde spieren. Dus het verhoogde niveau van cMyBP-C in de bloedsomloop is een specifieke indicator van hartschade ^13.

In deze studie vergeleken we Uniplex detectie van cMyBP-C met behulp van een aangepaste 3-plex assay voor serumniveaus van metencMyBP-C, CK-MB en troponine in het serum van patiënten met MI. In de toekomst zou deze handtekening techniek worden gebruikt om MI te diagnosticeren bij patiënten met pijn op de borst in de spoedafdeling.

De instelling Review Board (IRB) van de Loyola University Chicago ingestemd met de studie voor het gebruik van deidentified menselijke populaties en het gebruik van de immunoassay (LU # 20392).

Protocol

1. Uniplex cMyBP-C Assay

1. De dag voor het experiment, de vacht van de 96-well MSD kale standaard plaat met invangantilichaam. Voor cMyBP-C is een 30 gl volume van muizen monoklonaal anti-cMyBP-C-antilichaam (gelatinevrije) bij een concentratie van 5 ug / ml verdund in fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS).
2. Omdat het goed is hydrofoob, pipet de oplossing in de rechter benedenhoek van de put; tik op de zijkanten van de plaat aan de oplossing over de gehele goed verspreid.
3. De plaat is bedekt met een plaat sealer en gedurende O / N bij 4 ° C zonder schudden.
4. Verwijder de invangantilichaam oplossing door te tikken op de oplossing uit over een wastafel en vervolgens op een stapel papieren handdoeken. Niet-specifieke binding aan de plaat wordt door toevoegen van 150 pi van een 5% (w / v) blocker A (hoogwaardig BSA) oplossing in PBS aan elk putje.
5. Sluit de plaat en incubeer gedurende 1 uur bij kamertemperatuur onder schudden bij 700 rpm.
6. Tijdens de blokkering stap, de voorbereiding van de normen en samples. Voeg de standaardreeks door verdunning recombinant cMyBP-C proteïne fragment (aminozuren 1-271) een beginconcentratie van 2,000 ng / ml in 1% (w / v) blocker A / PBS. Vervolgens serieel verdund met een factor 5 in 1% (w / v) blocker A / PBS. Totaal 7 normen + 1 blank (1% (w / v) blocker A / PBS alleen) gebruikt.
7. Verwijder de blokkering oplossing en was de plaat 3x met 150 pi 0,05% (v / v) Tween-20/PBS. Elke keer, verwijder de wasoplossing door het omkeren van de plaat boven een gootsteen. Na de derde wasstap, krachtig flick de plaat over een wastafel en dep de plaat krachtig op een laag van papieren handdoeken totdat het volledig droog is. Dit is een cruciale stap, zoals volumes incubatie klein, en de overgebleven wasoplossing de volgende incubatie sterk verdunnen.
8. Pipetteer 25 ul van standaarden en monsters in de putjes. Sluit de plaat en incubeer bij kamertemperatuur onder schudden bij 700 rpm gedurende 1 uur.
9. Bereid de detectieantilichaam oplossing bij 1 ug / ml in 1% blocker A / PBS. A custom gemaakt cMyBP-C-antilichaam (epitoop aminozuren 2-14) met MSD SULFO-TAG etikettering dient als de detectie antilichaam. Kits zijn beschikbaar voor SULFO-TAG etikettering, waardoor het een relatief eenvoudige procedure om het etiket elk antilichaam.
10. Herhaal de wasstap zoals beschreven in stap 1.4.
11. Voeg 25 ul van detectieantilichaam oplossing in elk putje, sluit de plaat en incubeer bij kamertemperatuur gedurende 1 uur op een plaat schudder ingesteld op 700 rpm.
12. Tijdens de incubatieperiode, draaien MSD's demo-plaat (plaat met LED-verlichting) voor een goede werking van de sector Imager en software (zie paragraaf reagens) zorgen. Ook verdunnen read-buffer, die wordt verzorgd door MSD, door toevoeging van 5 ml van 4x lees-buffer en 15 ml gedestilleerd water.
13. Herhaal de wasstap zoals beschreven in stap 1.4.
14. Voeg 150 ul van lees-buffer aan elk putje met behulp van een multichannel pipet. Zorg ervoor dat u luchtbellen (reverse pipetteren is een geschikte methode) te vermijden. Na toevoeging van de lees-buffer onmiddellijk de plaat in de sector scannenImager.

2. 3-plex cMyBP-C, CK-MB en troponine Assay

1. Een 96-well plaat 3-plex en verdunningsmiddel oplossingen equilibreren tot kamertemperatuur vóór gebruik. Deze plaat is pre-coated met capture antilichamen voor cMyBP-C, CK-MB en troponine door MSD.
2. Voeg 25 ul van 1% (w / v) blocker A / PBS aan elk putje. Tik op de zijkanten van de plaat om ervoor te zorgen dat het gehele goed wordt gedekt door oplossing.
3. Seal de plaat met een plaatafdichter, plaatst u de plaat op een bord shaker en schud bij 700 rpm gedurende 30 minuten.
4. Intussen wordt een verdunningsreeks van afzonderlijke bereide kalibrators. Want elk heeft ook drie invangantilichamen drie ijkpunten moeten worden gemengd en serieel verdund vóór gebruik. Verdun recombinant cMyBP-C, CK-MB (MSD) en troponine (MSD) samen in 1% (w / v) blocker A / PBS om een ​​monster te maken met 2000 ng / ml cMyBP-C, 100 ng / ml CK- MB, en 25 ng / ml cTnI (monster A).
5. Een eindvolume van ten minste 100 pi bereid voor elke standaard. Naarvullen de standaard serie, serieel verdunnen de monsters met een factor 5. Gebruik 25 gl monster A in 100 gl 1% (w / v) blocker A / PBS monster B. maken dan gebruik van 25 gl monster B in 100 pl 1% (w / v) blocker A / PBS om monster C creëren , enzovoort. Menselijk serum monsters van 16 patiënten met MI en 16 controlepersonen werden gebruikt om cMyBP-C, CK-MB en troponine niveaus te meten. Deze monsters werden 2x verdund in 1% (w / v) blocker A / PBS.
6. Voeg 25 ul van de verdunde monsters en standaarden om de 25 ul reeds in de putjes van de 3-plex plaat. Het is belangrijk ook een blanco (alleen verdunningsmiddel) bevatten. Om de techniek vast te stellen, worden monsters geladen in technische drievoud. Anders duplicaten voldoende.
7. Weer sluiten, de plaat (plaatafdichter kunnen worden hergebruikt) en incubeer op een bord shaker (700 rpm) bij kamertemperatuur gedurende 2 uur.
8. Vlak voor de incubatie is voltooid, wordt het detectie-antilichaam oplossing bereid. Het verdunningsmiddel is 1% (w / v) blocker A in PBS. Alle three SULFO-gemerkte detectie-antilichamen worden samen verdund tot een eindconcentratie van 1 ug / ml elk. Detectie antilichamen worden meestal verzorgd op een 50x voorraad concentratie.
9. Voor een volledige 96-well plaat, is 2.700 gl totale verdunde oplossing nodig (met pipetteren fout inbegrepen). Voeg 54 ul van elke detectieantilichaam 2,538 gl 1% (w / v) blocker A / PBS.
10. Na 2 uur, verwijder oplossingen door krachtig te vegen het bord boven een gootsteen. Was de putjes 3x met 150 ul 0.05% Tween-20 in PBS. Voeg 25 ul van detectieantilichaam oplossing in elk putje met een multichannel pipet en de zijkanten van de plaat worden onttrokken om aan dat de gehele put onder oplossing.
11. Seal de plaat en incubeer gedurende 1 uur onder schudden bij 700 rpm.
12. Tijdens de incubatieperiode, draaien MSD's demo-plaat (plaat met LED-verlichting) voor een goede werking van de sector Imager en software garanderen. Ook verdunnen de lees-buffer, die wordt verzorgd door MSD, door toevoeging van 5 ml van 4x lezenbuffer op 15 ml gedestilleerd water.
13. Herhaal de wasstap in stap 2.8 beschreven.
14. Voeg 150 ul van lees-buffer aan elk putje met behulp van een multichannel pipet. Het vermijden van luchtbellen is kritisch (omgekeerd pipetteren een geschikte werkwijze). Na toevoeging van de lees-buffer, meteen de plaat in de sector Imager scannen.

Results

De basisprincipes en workflow van de 3-plex assay worden getoond in figuur 1, en ​​de algehele werkstroom wordt beschreven in Tabel 1. Uniplex assays werken volgens hetzelfde principe, behalve dat de gehele onderkant goed bekleed met een capture-antilichaam. Signaaldetectie uitgevoerd door ECL waarbij een elektrisch signaal wordt toegevoerd aan de bodem van de put. Dit op zijn beurt, initieert een lokale productie van licht door een chemische reactie van de lees-buffer met SULFO TAG-lab...

Discussion

In deze studie tonen we de toepassing van een multiplex immunoassay voor de detectie van meerdere cardiale biomarkers in serum van patiënten. Deze techniek heeft vele voordelen ten opzichte van traditionele ELISA. Eerst ECL in de testkit wordt gebruikt in plaats van colorimetrische detectie. In ECL, een elektrisch signaal stimuleert de lokale productie van de gemeten eigenschap (licht), waardoor het ontkoppelen van de stimulatie gebeurtenis het signaal, waarbij die ¹⁴ vermindert. Dit maakt hoge gevoeligheid, ...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Reagents
MSD Read-Buffer T (4X) met oppervlakteactieve stof	Meso Scale Discovery	R92TC-2
Tween-20	Acros	9005-64-5
MSD Blocker A	Meso Scale Discovery	R93BA-1
Fosfaat gebufferde zoutoplossing, 10X	Fisher BioReagents	BP399-4	Filter voor gebruik
Myosine binding eiwit C antilichaam, muis monoklonaal (E7), gelatine vrij	Santa Cruz	SC-137180L	Voor coating, antilichaam moet gelatine vrij zijn
Platen en apparatuur
Multi-Array 96-well standaard plaat	Meso Scale Discovery	L15XA-3
Een prototype 3-plex, vier-spot, 96-well plaat met cMyBP-C, cTnI en CK-MB	Meso Scale Discovery	N452A-1
ThermaSeal sealing film	Life Science Products Inc.	ST-3098
MSD SECTOR Imager 2400A	Meso Scale Discovery
MTS 2/4 digitale microtiter shaker	IKA	3208001