Clostridium difficile is een pathogene bacterie die een strikt anaerobe en veroorzaakt antibiotica geassocieerde diarree (AAD). Hier, werkwijzen voor het isoleren, kweken en onderhouden C. difficile vegetatieve cellen en sporen worden beschreven. Deze technieken vereisen een anaërobe kamer, die regelmatig onderhoud nodig heeft om te zorgen voor een goede voorwaarden voor een optimale C. difficile teelt.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Clostridium difficile is een Gram-positieve, anaërobe, sporogenic bacterie die primair verantwoordelijk is voor antibiotica geassocieerde diarree (AAD) en is een belangrijke nosocomiale pathogenen. C. difficile is notoir moeilijk te isoleren en cultiveren en is zeer gevoelig voor zelfs kleine zuurstof in de omgeving. Hier, werkwijzen voor het isoleren C. difficile van fecale monsters en vervolgens het kweken van C. difficile voor de bereiding van glycerol bestanden langetermijnopslag gepresenteerd. Technieken voor het bereiden en het opsommen spore aandelen in het laboratorium voor verschillende stroomafwaartse toepassingen zoals microscopie en dierlijke studies beschreven. Deze technieken vereisen een anaërobe kamer, die een consistente anaëroob milieu te zorgen voor een juiste omstandigheden voor een optimale C. onderhoudt difficile groei. Wij bieden protocollen voor de overdracht van materialen in en uit de kamer zonder camet behulp van aanzienlijke verontreiniging zuurstof samen met suggesties voor regelmatig onderhoud nodig om de juiste anaëroob milieu te ondersteunen voor een efficiënte en consistente C. difficile teelt.
Inleiding
Clostridium difficile is een grampositieve, sporenvormende bacterie die een obligaat anaërobe en een potentieel fatale gastrointestinale pathogenen van mensen en dieren. Aanvankelijk beschreven in 1935 als een commensaal organisme gevonden in fecale monsters van pasgeborenen 1, C. difficile werd later aangetoond dat de verwekker van pseudomembraneuze colitis geassocieerd met antibiotica 2 zijn. C. difficile infecties (CDI) worden gewoonlijk voorafgegaan door antibiotische behandeling die resulteert in de verstoring van de normale darmflora, het creëren van een nis voor C. difficile te gedijen 2.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
Opmerking: C. difficile is een menselijke en dierlijke ziekteverwekker die gastro-intestinale aandoeningen kunnen veroorzaken. Experimenten met C. difficile moet worden uitgevoerd met de juiste voorzorgsmaatregelen bioveiligheid (BSL-2).
1. Anaërobe Chamber gebruik en onderhoud
C. difficile is een strikt anaërobe en is zeer gevoelig voor zelfs lage concentraties van zuurstof in de atmosfeer. Daarom wordt een gecontroleerde, anaëroob milieu nodig voor een succesvolle manipulatie. Het gebruik van een anaërobe kamer (figuur 1A) geeft de meest stabiele omgeving en ideale o....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
Een voorbeeld van C. difficile geteeld op BHIS en Columbia schapen anaërobe agar media kan worden gezien in figuur 2. C. difficile vormt onregelmatige kolonies die plat zijn en beschikken over ingeslepen verschijning die duidelijk op beide media. Hier, een erytromycine gevoelige klinisch isolaat van C. difficile, 630E 30, wordt gekweekt op agar BHIS een verrijkte, niet-selectief medium gedurende 24 uur bij 37 ° C (Figuur 2A). Kolonies op Columbia sc.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
De hier beschreven methoden is het mogelijk voor een eenvoudige en snel herstel van C. difficile uit verschillende fecale monsters, waaronder mensen, muizen en hamsters, alsmede de opslag van C. langdurige difficile glycerol of spore voorraden. C. difficile kan een moeilijke organisme te kweken, maar zorgvuldig onderhoud van een anaëroob milieu en de toepassing van aseptische technieken voor robuuste groei en een vermindering van verontreiniging.
Anaërobe kam.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
Geen belangenconflicten verklaard.
Dankbetuigingen
Wij willen Coy Laboratories bedanken voor vriendelijk verstrekken van foto's van de anaërobe kamer. Dit werk werd ondersteund door de National Institutes of Health subsidie DK087763 (SMM) en een STEP / HHMI Leerplanontwikkeling Fellowship (ANE).
....Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| Proteose Peptone no. 2 | BD | 212120 | |
| Na2HPO4 | Fisher | S373 | |
| KH2PO4 | Fisher | BP362 | |
| NaCl | Fisher | S27 | |
| MgSO4 (anhydrous) | Fisher | M65 | |
| á´…-Fructose | Fisher | L96 | |
| Sodium taurocholate | Sigma | T4009 | |
| á´…-cycloserine | Sigma | C6880 | |
| Cefoxitin | Fluka | C4786 | |
| Brain heart infusion medium | BD | 237300 | |
| Proteose Peptone | BD | 211684 | |
| (NH4)2SO4 | Sigma | A5132 | |
| Tris base | Fisher | BP152 | |
| Agar | BD | 214010 | |
| L-cysteine | Sigma | C7755 | |
| BactoPeptone | BD | 211684 | |
| Columbian sheep blood agar | Fisher | L21928 | |
| NaCl | Fisher | S27 | |
| KCl | Fisher | P217 | |
| Glycerol | Fisher | BP2291 | |
| Sterile inoculating loops | Fisher | 22363596 | |
| Sterile swabs | Fisher | 1495990 | |
| Coy Vinyl Anaerobic Chamber and Accessories | Coy Laboratory Products, Inc | Klantgespecificeerd | Deze items worden per laboratoriumbehoeften op maat besteld |
| Materialen | |||
| TCCFA agar Proteose pepton nr. 2 (Difco) 40 g Na2HPO4 5 g KH2PO4 1 g NaCl 2 g MgSO4 (anhydrous) 0,1 g Fructose 6 g Agar 20 g Breng aan tot 1 L met gedeïoniseerd water en autoclaveer bij 121 °C gedurende 20 min om te steriliseren. Na het autoclaveren, voeg toe: 10 ml van 10% (w/v) natriumtaurocholaat, filtergesteriliseerd (oplossen in water; eindconcentratie, 0,1%) 25 ml van 10 mg/ml á´…-cycloserine, filtergesteriliseerd (oplossen in water; eindconcentratie, 250 μg/ml) 1,6 ml van 10 mg/ml cefoxitine, filtergesteriliseerd (oplossen in water; eindconcentratie, 16 μg/ml) BHIS-medium Brain heart infusion 37 g Gistextract 5 g Voor platen, voeg 15 g agar toe. Breng aan tot 1 L met gedeïoniseerd water en autoclaveer bij 121 °C gedurende 20 min om te steriliseren. Optioneel (voeg toe na het autoclaveren): 3 ml van 10% (w/v) L-cysteïne (oplossen in water; eindconcentratie, 0,03%) 10 ml van 10% (w/v) natriumtaurocholaat (oplossen in water; eindconcentratie, 0,1%) SMC-sporulatiemedium BactoPeptone 90 g Protease peptone 5 g (NH4)2SO4 1 g Tris base 1,5 g Agar 15 g Breng aan tot 1 L met gedeïoniseerd water en autoclaveer bij 121 °C gedurende 20 min om te steriliseren. Optioneel (voeg toe na het autoclaveren): 3 ml van 10% (w/v) L-cysteïne (oplossen in water; eindconcentratie, 0,03%) 70:30 Medium BactoPeptone 63 g Protease peptone 3,5 g Brain heart infusion 11,1 g Gistextract 1,5 g (NH4)2SO4 0,7 g Tris base 1,06 g Voor platen, voeg 15 g agar toe. Breng aan tot 1 L met gedeïoniseerd water en autoclaveer bij 121 °C gedurende 20 min om te steriliseren. Na het autoclaveren, voeg 3 ml van 10% (w/v) L-cysteïne toe (eindconcentratie, 0,03%). Bloedagar Het gebruik van voorgemaakte Columbia anaerobe schapenbloedagarplaten (Fisher Scientific, L21928)35 wordt aanbevolen. 1X Fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS) NaCl 8,01 g KCl 0,2 g Na2HPO4 1,44 g KH2PO4 0,27 g Breng aan tot 1 L met gedeïoniseerd water en pas de pH aan tot 7,4 met HCl. Filter steriliseer voor gebruik. |
Referenties
- Hall, I. C., O'Toole, E. Intestinal flora in new-borin infants - With a description of a new pathogenic anaerobe, Bacillus difficilis. Am. J. Dis. Child. 49, 390-402 (1935).
- Tedesco, F. J., Barton, R. W., Alpers, D. H. Clindamycin-Associated Coliti....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
