Methodenartikel

Het kweken en onderhouden

40K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/50787

⸱

14 september 2013

 ,  , 
1Department of Microbiology and Immunology, Emory University School of Medicine

In dit artikel

Samenvatting

Clostridium difficile is een pathogene bacterie die een strikt anaerobe en veroorzaakt antibiotica geassocieerde diarree (AAD). Hier, werkwijzen voor het isoleren, kweken en onderhouden C. difficile vegetatieve cellen en sporen worden beschreven. Deze technieken vereisen een anaërobe kamer, die regelmatig onderhoud nodig heeft om te zorgen voor een goede voorwaarden voor een optimale C. difficile teelt.

Samenvatting

Clostridium difficile is een Gram-positieve, anaërobe, sporogenic bacterie die primair verantwoordelijk is voor antibiotica geassocieerde diarree (AAD) en is een belangrijke nosocomiale pathogenen. C. difficile is notoir moeilijk te isoleren en cultiveren en is zeer gevoelig voor zelfs kleine zuurstof in de omgeving. Hier, werkwijzen voor het isoleren C. difficile van fecale monsters en vervolgens het kweken van C. difficile voor de bereiding van glycerol bestanden langetermijnopslag gepresenteerd. Technieken voor het bereiden en het opsommen spore aandelen in het laboratorium voor verschillende stroomafwaartse toepassingen zoals microscopie en dierlijke studies beschreven. Deze technieken vereisen een anaërobe kamer, die een consistente anaëroob milieu te zorgen voor een juiste omstandigheden voor een optimale C. onderhoudt difficile groei. Wij bieden protocollen voor de overdracht van materialen in en uit de kamer zonder camet behulp van aanzienlijke verontreiniging zuurstof samen met suggesties voor regelmatig onderhoud nodig om de juiste anaëroob milieu te ondersteunen voor een efficiënte en consistente C. difficile teelt.

Inleiding

Clostridium difficile is een grampositieve, sporenvormende bacterie die een obligaat anaërobe en een potentieel fatale gastrointestinale pathogenen van mensen en dieren. Aanvankelijk beschreven in 1935 als een commensaal organisme gevonden in fecale monsters van pasgeborenen 1, C. difficile werd later aangetoond dat de verwekker van pseudomembraneuze colitis geassocieerd met antibiotica 2 zijn. C. difficile infecties (CDI) worden gewoonlijk voorafgegaan door antibiotische behandeling die resulteert in de verstoring van de normale darmflora, het creëren van een nis voor C. difficile te gedijen 2. C. difficile als een slapende spore via de fecaal-orale weg overgebracht en vervolgens ontkiemt in het maagdarmkanaal, vegetatief cellen kan genereren verscheidene toxine en veroorzaken ernstige ziekte en colitis 3. CDI zijn vaak ongevoelig voor conventionele behandelingen en deze infections worden vaak terugkerende 4. Daardoor CDI zijn verantwoordelijk voor $ 4,8 miljard aan gezondheidszorgkosten in de Verenigde Staten 5-7.

C. difficile is zeer gevoelig voor zelfs kleine zuurstof in de omgeving. Voor C. difficile te blijven in het milieu en efficiënt worden overgedragen van gastheer naar gastheer, de vorming van een metabolisch inactieve spore is van cruciaal belang 8. Omdat het laboratorium onderhoud en manipulatie van C. difficile is een gecontroleerde, anaëroob milieu, deze technieken vereisen het gebruik van een anaërobe kamer. Gebruik van anaërobe kamers heeft geleid tot een toegenomen terugwinning en isolatie van obligate anaerobe 9-11, en ​​heeft geleid tot een aantal moleculaire technieken in een anaërobe atmosfeer worden uitgevoerd.

Naast C. difficile, de anaërobe kamer gebruik en onderhoud hier beschreven toepassingandere obligate anaerobe bacteriën zoals Clostridium andere soorten (bijv. C. perfringens), andere maag-soorten (bijvoorbeeld Bacteroides soorten 12) en periodontale pathogenen (bv. Peptostreptococcus species 13).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

Opmerking: C. difficile is een menselijke en dierlijke ziekteverwekker die gastro-intestinale aandoeningen kunnen veroorzaken. Experimenten met C. difficile moet worden uitgevoerd met de juiste voorzorgsmaatregelen bioveiligheid (BSL-2).

1. Anaërobe Chamber gebruik en onderhoud

C. difficile is een strikt anaërobe en is zeer gevoelig voor zelfs lage concentraties van zuurstof in de atmosfeer. Daarom wordt een gecontroleerde, anaëroob milieu nodig voor een succesvolle manipulatie. Het gebruik van een anaërobe kamer (figuur 1A) geeft de meest stabiele omgeving en ideale omstandigheden voor een effectieve kweken van C. difficile en andere anaërobe bacteriën 14. Hier kan een atmosfeer die een gasmengsel (5% CO2, 10% H2, 85% N2) stabiel worden gehandhaafd.

Om alle items in de kamer zonder noemenswaardige verontreiniging zuurstof te introduceren,een luchtsluis moet worden gebruikt (figuur 1B). Dit apparaat fungeert als een gas-uitwisseling en werkt automatisch, semi-handmatig of handmatig. De sluis heeft twee deuren: een toegang tot de buitenkant van de luchtsluis en de andere toegang tot het inwendige van de anaërobe kamer. Afhankelijk van het model, kan de luchtsluis een extra deur, die toegang geeft tot een aangrenzende anaerobe kamer kan aanbieden, dus besparing van de kosten van een aparte luchtsluis. Tenzij actief verplaatsen van items in of uit de kamer, moeten beide deuren gesloten blijven te allen tijde aan zuurstof te voorkomen. De luchtsluis beschikt over een aan / uit schakelaar aan de voorzijde en een paneel met vier knoppen. De gasleidingen en vacuümpomp slang worden aangesloten aan de achterzijde van de luchtsluis, vlakbij het ​​paneel wanneer de schakelaars voor volledig handmatige bediening van het apparaat bevinden. Aanbevolen wordt twee spoelcycli, met stikstofgas (N2), worden gebruikt voor het vullen van de uitwisseling met gasmengsel (5% CO 2, 10% H2, 85% N2) de hoeveelheid zuurstof ingebracht in de kamer verminderen. Het is ook belangrijk om nooit beide deur open langer dan de hoeveelheid tijd die nodig is om items te verplaatsen in en uit de uitwisseling en zorgvuldig plannen van experimenten om de frequentie van het verplaatsen van items in en uit de kamer te verminderen. De verschillende operationele procedures voor vinyl anaërobe kamers worden hieronder beschreven. Voordat u deze protocollen, ervoor zorgen dat deze verenigbaar zijn met de instructies van de fabrikant, mits met de kamer.

  1. Automatische modus
    Dit is een programmeerbare en aanpasbare modus en wordt volledig door de luchtsluis. Om de luchtsluis te programmeren, raadpleegt u de instructies van de fabrikant. Een aanbevolen programma voor typische binnenkomst in de kamer bestaat uit twee spoelcycli met behulp van stikstofgas, gevolgd door het vullen van de sluis met een gasmengsel dat overeenkomt met de sfeer gehandhaafd binnen de chamber. Tijdens elke vacuüm cyclus, raden de standaard fabrieksinstellingen procedures trekken van een vacuüm tot 20 Hg en zuiveren tot 1 Hg.
    1. Zorg ervoor dat de binnenste luchtsluis deur volledig is gesloten.
    2. Open de buitenste luchtsluis deur.
    3. Plaats items in de luchtsluis en sluit de buitenste luchtsluis deur. Als de invoering van vloeistoffen, draai de doppen half in om een ​​efficiënte uitwisseling van gas te garanderen. Verzegelde verpakkingen en containers moeten voor het begin van de cyclus worden geopend; afzien van dit kan vervormen en beschadiging plasticware en containers. Om de steriliteit te behouden, opent u de pakketten genoeg om alleen een efficiënte gasuitwisseling.
    4. Druk op de knop Start.
    5. Wacht tot de luchtsluis heeft gefietst door het programma en op de display "Anaërobe."
    6. Open innerlijke luchtsluis.
    7. Verplaats items in de kamer.
    8. Sluit binnendeur.
  2. Semi-manual modus
    Deze modus kan worden gebruikt bij het verplaatsen van voorwerpen in of uit de kamer en is noodzakelijk wanneer cycling het gas in de kamer nodig.
    1. Zorg ervoor dat de binnenste luchtsluis deur volledig is gesloten.
    2. Open de buitenste luchtsluis deur.
    3. Plaats items in de luchtsluis en sluit de buitenste luchtsluis deur. Als de invoering van vloeistoffen, draai de doppen half in om een ​​efficiënte uitwisseling van gas te garanderen. Gesloten verpakkingen, zoals entnaalden en 96 putjes, moet voor het begin van de cyclus worden geopend.
    4. Druk op Menu.
    5. Druk op Start. De sluis zal de functie van elke knop weer te geven en zal niet reageren totdat deze is voltooid:
      • Pijl omhoog: activeert de vacuümpomp.
      • Pijl omlaag: initieert de stikstof (purge) gasstroom.
      • Start: initieert het gasmengsel flow.
      • Menu: terug naar de standaard weergave.
    6. Druk op "Up", het verwijderen van gas uit de luchtsluis, tot de display 20 Hg.
    7. Druk op "Omlaag", het vullen van de luchtsluis met stikstof, tot de display minder dan 1 Hg. Niet overshoot, want dit positieve druk in de luchtsluis creëren, die de integriteit kunnen beïnvloeden.
    8. Herhaal de stappen 6 en 7 om een ​​extra spoelcyclus uitvoeren.
    9. Druk op "Up" tot de display 20 Hg.
    10. Druk op "Start", het vullen van de uitwisseling met gasmengsel, tot de display minder dan 1 Hg.
    11. Open innerlijke luchtsluis.
    12. Verplaats items in de kamer.
    13. Sluit binnendeur.
  3. Handmatige modus
    Deze modus kan worden gebruikt wanneer de automatische of semi-handmatige modus niet werken of als er geen stroom naar de luchtsluis. Deze modus werkt niet wanneer de luchtsluis is, daarom is het moeilijk om de druk in de luchtsluis bepalen. Omdat het vacuüm trekken en gasspoelen tijd is afhankelijk vacuüm en de gasstromen, respectievelijk het gebruik van een drukmeter in de uitwisseling moet Drukregelaar en het risico van persoonlijk letsel en schade aan de luchtsluis verminderen.
    1. Zorg ervoor dat de binnenste luchtsluis deur volledig is gesloten.
    2. Open de buitenste luchtsluis deur.
    3. Plaats items, waaronder de manometer, in luchtsluis en sluit de buitenste luchtsluis deur. Als de invoering van vloeistoffen, draai de doppen half in om een ​​efficiënte uitwisseling van gas te garanderen. Gesloten verpakkingen, zoals entnaalden en 96 putjes, moet voor het begin van de cyclus worden geopend.
    4. Zoek de drie schakelaars op de achterkant van de luchtsluis label "Handbediening Switches." Deze worden afzonderlijk aangeduid als:
      • Stofzuigen
      • Stikstof
      • Gas Mix
    5. Flip de om te schakelen vakuumschakelaar totdat de drukmeter ongeveer 20 Hg.
    6. Flip de Stikstof schakelaar totdat de drukmeter ongeveer 1 Hg.
    7. Flip de om te schakelen vakuumschakelaar totdat de drukmeter ongeveer 20 Hg.
    8. Flip de Stikstof schakelaar totdat de drukmeter ongeveer 1 Hg.
    9. Flip de om te schakelen vakuumschakelaar totdat de drukmeter ongeveer 20 Hg.
    10. Flip de Gas Mix schakelaar totdat de drukmeter ongeveer 1 Hg.
    11. Open innerlijke luchtsluis.
    12. Verplaats items in de kamer.
    13. Sluit binnendeur.

2. Kweken, opsommen en opslaan C. difficile van ontlasting

Deze procedure is bedoeld om C. herstellen difficile van fecale monsters die sporen en vervolgens te houden geïsoleerde kolonies als vegetatieve cellen of sporen in de lange-termijn opslag als glycerol voorraden. Alternatief kan deze procedure worden gebruikt om het aantal C. sommen difficile aanwezig in de ontlasting monsters (bijvoorbeeld uit dierproeven). Om selectief en differentieel verrijken voor C. difficile, taurocholaat-cefoxitine-fructose cycloserine-agar (TCCFA) wordt gebruikt om de groei van normale fecale flora 15-16 remmen. Cycloserine is bacteriostatisch Gram-negatieve bacteriën, terwijl cefoxitine ruimer remt groei van zowel Gram-negatieve en-positieve bacteriën, behalve C. difficile en meest voer kokken stammen. Een pH-indicator, neutraal rood, kunnen in het medium als de fermentatie fructose leidt tot een afname in pH en een volgende kleurverandering van rood / oranje naar geel. Om efficiënt herstellen sporen van C. difficile als vegetatieve bacteriën, de galzouten natriumtaurocholaat wordt gebruikt om kieming 17-18 induceren. Omdat C. difficile vormt sporen, alcohol of warmtebehandeling monsters kan worden gebruikt om de vegetatieve cellen te verminderen of te elimineren, het beperken van de groei van verontreinigende flora die de efficiëntie van C stijgen difficile herstel 19. Zoals hierboven vermeld, is het essentieel om vooraf verminderen alle platen tenminste 1-2 uur in de anaërobe kamer voor gebruik bij de verwijdering van de achtergebleven zuurstof te garanderen. Air drying de platen voor gebruik in de kamer kan condens. Vloeibare medium kan tot 24 uur moeten verminderen afhankelijk van het volume en het oppervlak-tot-luchtverhouding van de verpakking worden gebruikt.

Voordat u begint, moet de volgende items in de anaërobe tank worden bevestigd:

  • Kruksteekproef
  • Steriele wattenstaafjes
  • Steriel entnaalden
  • 1x PBS (zie ook Materiaal)
  • TCCFA platen (zie ook Materiaal)
  • BHIS (Brain Heart Infusion medium met gistextract) borden en bouillon (zie ook Materiaal)
  • 50% glycerol (gesteriliseerd)
  • 10% L-cysteïne (gesteriliseerde)
  • Cryogene opslag flacons

* Alternatief kunnen geïsoleerde kolonies worden uitgespreid op BHIS agarplaten en vervolgens afgeschraapt en gesuspendeerd in BHIS vloeibaar medium met 15% glycerol voor langdurige opslag bij -80 ° C. ** Het is belangrijk op te merken dat de Gram-kleuring is niet een effectieve strategie om C. te identificeren difficile direct van ontlasting 23 ; C. difficile zich eerst worden geïsoleerd van de andere flora in de ontlasting.

  1. Resuspendeer de ontlasting monster in 1x PBS (dit kan in aërobe omstandigheden worden uitgevoerd), en ervoor zorgen dat de ontlasting volledig is gesuspendeerd in 1x PBS door vortexen. Als opsommen C. difficile uit de ontlasting, wegen de ontlasting vóór de toevoeging van 1 x PBS.
  2. Maak seriële verdunningen van de geresuspendeerde ontlasting in 1x PBS passende isolatie of opsomming van kolonievormende eenheden (CFU) per gram ontlasting.
  3. Met behulp van aseptische techniek, toepassing 100 pi van elke seriële verdunning tot TCCFA platen.
  4. Met behulp van een reeks van steriele entogen, streep de toegepaste cultuur voor geïsoleerde kolonies of gelijkmatig verdeeld de toegepaste cultuur op het oppervlak van de TCCFA plaat voor de telling van de kolonies.
  5. Incubeer de plaat anaëroob gedurende 48 uur bij 37 ° C. Het is mogelijk de detectie en identificatie C. difficile kolonies binnen 24 uur gebaseerd opde platte, onregelmatige, geslepen glas uiterlijk van de kolonies 15, hoewel meer accurate identificatie en telling wordt bereikt na 48 uur.
  6. Met behulp van steriele entogen, subcultuur elke kolonies die lijken te zijn C. difficile op voorgereduceerd BHIS agarplaten, aangevuld met 0,03% L-cysteïne 20. Kies een individuele kolonie, en streep op de plaat in kwadranten, met een nieuwe steriele entnaald voor elk kwadrant, om geïsoleerde kolonies te verkrijgen. Als alternatief, tel de C. difficile kolonies van elke verdunning (dit kan worden uitgevoerd in aërobe omstandigheden), en bereken het aantal kolonievormende eenheden per gram ontlasting.
  7. Bevestig C. difficile identificatie via Gram-kleuring. Na Gram-kleuring, C. difficile zal verschijnen als paarse staven en sommige cellen kunnen terminal endosporen bevatten. Polymerase kettingreactie (PCR) identificatie van de genen die coderen voor toxine B kan verder bevestigd biedentoxigene stammen van C. difficile 21 terwijl multilocus sequence typing (MLST) succesvol voor de identificatie en nauwkeurig typen van onbekende en niet-toxigene stammen van C. is difficile 22.
  8. Om een voorraad van C te houden difficile bij -80 ° C, kies individuele, geïsoleerde kolonie van de BHIS agarplaat met een steriele entnaald en resuspendeer de kolonie in 10 ml voorgereduceerd BHIS vloeibaar medium aangevuld met 0,03% L-cysteïne. *
  9. Incubeer overnacht anaëroob bij 37 ° C, of ​​tot de kweek troebel.
  10. Voeg 333 ul van 50% glycerol en 666 pl van de C. difficile cultuur naar een 1,8 ml cryogene buis naar een 15% glycerol voorraad van de geïsoleerde stam te creëren.
  11. Nauw cap de cryogene buis, goed mengen en onmiddellijk de voorraad bij de anaërobe kamer en plaats in een -80 ° C vriezer voor opslag op lange termijn.

3. Het kweken van C. difficile van Frozen glycerolvoorraden

Deze procedure voorziet in het herstel van C. difficile uit glycerol voorraden bewaard bij -80 ° C. Omdat herhaalde vries-dooi cycli vegetatieve cellen te doden, is het belangrijk om de glycerol voorraden te allen tijde houden bevroren. We raden het gebruik van droogijs voor het overbrengen van stammen in en uit de kamer als de verdamping van droogijs het milieu binnen de kamer kan veranderen aanraden. In plaats daarvan raden wij het gebruik van bevroren koeling rekken tot glycerol voorraden tijdens het transport bevroren te houden. Voor diverse selectieve en differentiële doeleinden worden drie media gebruikt voor kweken C. difficile. TCCFA, zoals hierboven besproken, is selectief voor C. difficile en bevat natriumtaurocholaat, een ontkiemende. Brain Heart Infusion aangevuld met gistextract (BHIS) is een veel gebruikte, verrijkte, niet-selectief medium dat zorgt voor de groei van een grote verscheidenheid van organismen (figuur 2A) 24. Vaak, L-cysteïnee wordt aan BHIS toegevoegd als reductiemiddel 20. Tenslotte, het toevoegen van bloed aan het medium (figuur 2B) maakt een efficiënter sporulatie dan op TCCFA en detectie verschaft van de unieke groen of chartreuse fluorescentie vertoond door C. difficile op basis van lange-golf ultraviolet (UV) licht 15 (figuur 2C). Bij het ​​kweken van C. difficile uit spore voorraden, is het essentieel om te onthouden dat natriumtaurocholaat moet worden toegevoegd aan het medium om kieming te garanderen.

Voordat u begint, moet de volgende items in de anaërobe tank worden bevestigd:

  • Bevroren glycerol voorraad (in koeling rack)
  • Steriel entnaalden
  • TCCFA of BHIS platen (zie ook Materiaal)
  • BHIS bouillon (zie ook Materiaal)
  • 50% glycerol (gesteriliseerd)
  • Cryogene opslag flacons
  1. Plaats de bevroren glycerol voorraad van C. difficile in kuvettenstandaard die is opgeslagen bij -80 ° C prIOR gebruiken om ontdooien te voorkomen.
  2. Breng de bevroren glycerol voorraad op droog ijs in de anaërobe kamer.
  3. Met behulp van aseptische techniek en een steriel entnaald, plaats een kleine hoeveelheid van de voorraad op de plaat en streep over een kwadrant van de plaat.
  4. Draai de plaat 90 ° en, met behulp van een nieuwe steriele entnaald, blijven streep over het tweede kwadrant.
  5. Herhaal voor het derde en vierde kwadrant voor isolatie van afzonderlijke kolonies garanderen.
  6. Verwijder direct de bevroren glycerol voorraad bij de anaërobe kamer en terug te keren naar de -80 ° C.
  7. Incubeer de plaat anaëroob nacht bij 37 ° C. Individuele geïsoleerde kolonies worden waargenomen na een nacht kweken.

4. Zuiveren Sporen van C. difficile

Zoals sporulatie is vereist voor overleving in zuurstofrijke omgeving en efficiënte overdracht van ziektes 8, de bereiding van spore voorraden often noodzakelijk zijn voor verdere toepassingen niet beperkt tot microscopie en dierstudies. Het is belangrijk op te merken dat het opsommen van sporen vereist herhaling om reproduceerbaarheid van tellingen te garanderen. En neer te pipetteren meerdere malen tussen verdunningen vermindert ook het verlies sinds sporen zich aan plastic ook.

Sporulatie van C. difficile is niet zo snel of homogeen andere sporogenic soorten. Om spore productie en herstel te optimaliseren, ofwel sporulatie medium (SMC) 17,25 of 70:30 medium 26 wordt aanbevolen. Andere media gebruikte zijn BHIS, die 4-5 dagen van groei vereist voordat efficiënte sporulatie wordt gezien 27 en Clospore, een vloeibaar medium dat hoge titers van sporen produceert (10 juli-10 augustus sporen per milliliter) na 72 uur van de groei. Andere protocollen ijskoud water dan 1x PBS 20, maar kan het gebruik van een isotone oplossing sporen van aan elkaar plakken en kunststof oppervlakken verminderen. Als alternatief,sommige onderzoekers verder te zuiveren hun sporen met behulp van een sucrose gradiënt om de vegetatieve cellen en puin 29 volledig te verwijderen.

Voordat u begint, moet de volgende items in de anaërobe tank worden bevestigd:

  • Steriel entnaalden
  • BHIS, SMC en / of 70:30 platen (zie ook Materiaal)
  • BHIS bouillon (zie ook Materiaal)
  • 1x PBS, filter-gesteriliseerd (zie ook Materiaal)
  1. Cultuur stammen uit bevroren glycerol voorraad op pregereduceerde BHIS platen en incubeer anaëroob overnacht bij 37 ° C.
  2. Restreak op verscheidene voorgereduceerd SMC of 70:30 platen en incubeer anaëroob bij 37 ° C gedurende 24-48 uur. Spore vorming kan via fasecontrastmicroscopie worden gevolgd. Sporen verschijnt fase helder terwijl vegetatieve en moeder cellen fase donker lijken. * Als alternatief kunnen sporen worden gezuiverd 70:30 vloeibaar medium na 24-48 uur, waarbij 10 5 -10 6 sporen per ml, afhankelijk strai oplevertn gebruikt.
  3. Met behulp van een steriele entnaald, schraap borden en resuspendeer de cellen in 10 ml steriel 1x PBS.
  4. Gooi borden en verwijder sporesuspensie uit de anaërobe kamer. Pellet de cellen bij 3000 g gedurende 15 minuten. Was de cellen tweemaal in 1x PBS, volledig resuspenderen de celpellet elke keer.
  5. Incubeer overnacht bij 4 ° C om te helpen bij lysis van vegetatieve moedercellen.
  6. Incubeer bij 70 ° C gedurende 20 minuten om eventuele vegetatieve cellen te doden.
  7. Om kolonie bepalen eenheden (CFU) per milliliter, serieel vul telkens spore voorbereiding in 1x PBS en plaat op BHIS + 0,1% natriumtaurocholaat. Incubeer de platen gedurende minimaal 24 uur voor het opsommen kolonies.
  8. Sporen kunnen worden opgeslagen in 1x PBS bij hetzij kamertemperatuur of 4 ° C voor langdurige opslag. Indien opgeslagen bij 4 ° C, kan het nuttig zijn om de spore bereiding warmen bij 55 ° C gedurende 15 min efficiënte kieming herstellen.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

Een voorbeeld van C. difficile geteeld op BHIS en Columbia schapen anaërobe agar media kan worden gezien in figuur 2. C. difficile vormt onregelmatige kolonies die plat zijn en beschikken over ingeslepen verschijning die duidelijk op beide media. Hier, een erytromycine gevoelige klinisch isolaat van C. difficile, 630E 30, wordt gekweekt op agar BHIS een verrijkte, niet-selectief medium gedurende 24 uur bij 37 ° C (Figuur 2A). Kolonies op Columbia sc...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

De hier beschreven methoden is het mogelijk voor een eenvoudige en snel herstel van C. difficile uit verschillende fecale monsters, waaronder mensen, muizen en hamsters, alsmede de opslag van C. langdurige difficile glycerol of spore voorraden. C. difficile kan een moeilijke organisme te kweken, maar zorgvuldig onderhoud van een anaëroob milieu en de toepassing van aseptische technieken voor robuuste groei en een vermindering van verontreiniging.

Anaërobe kam...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

Geen belangenconflicten verklaard.

Dankbetuigingen

Wij willen Coy Laboratories bedanken voor vriendelijk verstrekken van foto's van de anaërobe kamer. Dit werk werd ondersteund door de National Institutes of Health subsidie ​​DK087763 (SMM) en een STEP / HHMI Leerplanontwikkeling Fellowship (ANE).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Proteose Peptone no. 2BD212120
Na2HPO4FisherS373
KH2PO4FisherBP362
NaClFisherS27
MgSO4 (anhydrous)FisherM65
á´…-FructoseFisherL96
Sodium taurocholateSigmaT4009
á´…-cycloserineSigmaC6880
CefoxitinFlukaC4786
Brain heart infusion mediumBD237300
Proteose PeptoneBD211684
(NH4)2SO4SigmaA5132
Tris baseFisherBP152
AgarBD214010
L-cysteineSigmaC7755
BactoPeptoneBD211684
Columbian sheep blood agarFisherL21928
NaClFisherS27
KClFisherP217
GlycerolFisherBP2291
Sterile inoculating loopsFisher22363596
Sterile swabsFisher1495990
Coy Vinyl Anaerobic Chamber and AccessoriesCoy Laboratory Products, IncKlantgespecificeerdDeze items worden per laboratoriumbehoeften op maat besteld
Materialen
TCCFA agar

Proteose pepton nr. 2 (Difco) 40 g
Na2HPO4 5 g
KH2PO4 1 g
NaCl 2 g
MgSO4 (anhydrous) 0,1 g
Fructose 6 g
Agar 20 g

Breng aan tot 1 L met gedeïoniseerd water en autoclaveer bij 121 °C gedurende 20 min om te steriliseren.

Na het autoclaveren, voeg toe:
10 ml van 10% (w/v) natriumtaurocholaat, filtergesteriliseerd (oplossen in water; eindconcentratie, 0,1%)
25 ml van 10 mg/ml á´…-cycloserine, filtergesteriliseerd (oplossen in water; eindconcentratie, 250 μg/ml)
1,6 ml van 10 mg/ml cefoxitine, filtergesteriliseerd (oplossen in water; eindconcentratie, 16 μg/ml)

BHIS-medium

Brain heart infusion 37 g
Gistextract 5 g

Voor platen, voeg 15 g agar toe. Breng aan tot 1 L met gedeïoniseerd water en autoclaveer bij 121 °C gedurende 20 min om te steriliseren.

Optioneel (voeg toe na het autoclaveren):

3 ml van 10% (w/v) L-cysteïne (oplossen in water; eindconcentratie, 0,03%)
10 ml van 10% (w/v) natriumtaurocholaat (oplossen in water; eindconcentratie, 0,1%)

SMC-sporulatiemedium

BactoPeptone 90 g
Protease peptone 5 g
(NH4)2SO4 1 g
Tris base 1,5 g
Agar 15 g

Breng aan tot 1 L met gedeïoniseerd water en autoclaveer bij 121 °C gedurende 20 min om te steriliseren.

Optioneel (voeg toe na het autoclaveren):
3 ml van 10% (w/v) L-cysteïne (oplossen in water; eindconcentratie, 0,03%)

70:30 Medium

BactoPeptone 63 g
Protease peptone 3,5 g
Brain heart infusion 11,1 g
Gistextract 1,5 g
(NH4)2SO4 0,7 g
Tris base 1,06 g

Voor platen, voeg 15 g agar toe. Breng aan tot 1 L met gedeïoniseerd water en autoclaveer bij 121 °C gedurende 20 min om te steriliseren. Na het autoclaveren, voeg 3 ml van 10% (w/v) L-cysteïne toe (eindconcentratie, 0,03%).

Bloedagar

Het gebruik van voorgemaakte Columbia anaerobe schapenbloedagarplaten (Fisher Scientific, L21928)35 wordt aanbevolen.

1X Fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS)

NaCl 8,01 g
KCl 0,2 g
Na2HPO4 1,44 g
KH2PO4 0,27 g

Breng aan tot 1 L met gedeïoniseerd water en pas de pH aan tot 7,4 met HCl. Filter steriliseer voor gebruik.

Referenties

  1. Hall, I. C., O'Toole, E. Intestinal flora in new-borin infants - With a description of a new pathogenic anaerobe, Bacillus difficilis. Am. J. Dis. Child. 49, 390-402 (1935).
  2. Tedesco, F. J., Barton, R. W., Alpers, D. H. Clindamycin-Associated Colitis - Prospective Study. Ann. Intern. Med. 81, 429-433 (1974).
  3. Gerding, D. N. Clostridium difficile 30 years on: what has, or has not, changed and why. Int. J. Antimicrob. Agents. 33, 2-8 (2009).
  4. Gerding, D. N., Muto, C. A., Owens, R. C. Treatment of Clostridium difficile infection. Clin. Infect. Dis. 46, Suppl 1. 32-42 (2008).
  5. Dubberke, E. R., Olsen, M. A. Burden of Clostridium difficile on the healthcare system. Clin. Infect. Dis. 55, 88-92 (2012).
  6. Bouza, E. Consequences of Clostridium difficile infection: understanding the healthcare burden. Clin. Microbiol. Infect. 18, 5-12 (2012).
  7. Peery, A. F., et al. Burden of gastrointestinal disease in the United States: 2012 update. Gastroenterology. 143, 1171-1173 (2012).
  8. Deakin, L. J., et al. The Clostridium difficile spo0A gene is a persistence and transmission factor. Infect. Immun. 80, 2704-2711 (2012).
  9. Drasar, B. S. Cultivation of anaerobic intestinal bacteria. J. Pathol. Bacteriol. 94, 417-427 (1967).
  10. Leach, P. A., Bullen, J. J., Grant, I. D. Anaerobic CO 2 cabinet for the cultivation of strict anerobes. Appl. Microbiol. 22, 824-827 (1971).
  11. Killgore, G. E., Starr, S. E., Del Bene,, Whaley, V. E., N, D., Dowell, V. R. Comparison of three anaerobic systems for the isolation of anaerobic bacteria from clinical specimens. Am. J. Clin. Pathol. 59, 552-559 (1973).
  12. Bacic, M. K., Smith, C. J. Laboratory maintenance and cultivation of bacteroides species. Curr. Protoc. Microbiol. Chapter 13, Unit 13C 11(2008).
  13. Doan, N., Contreras, A., Flynn, J., Morrison, J., Slots, J. Proficiencies of three anaerobic culture systems for recovering periodontal pathogenic bacteria. J. Clin. Microbiol. 37, 171-174 (1999).
  14. Socransky, S., Macdonald, J. B., Sawyer, S. The cultivation of Treponema microdentium as surface colonies. Arch. Oral. Biol. 1, 171-172 (1959).
  15. George, W. L., Sutter, V. L., Citron, D., Finegold, S. M. Selective and differential medium for isolation of Clostridium difficile. J. Clin. Microbiol. 9, 214-219 (1979).
  16. Wilson, K. H., Silva, J., Fekety, F. R. Suppression of Clostridium difficile by normal hamster cecal flora and prevention of antibiotic-associated cecitis. Infect. Immun. 34, 626-628 (1981).
  17. Wilson, K. H., Kennedy, M. J., Fekety, F. R. Use of sodium taurocholate to enhance spore recovery on a medium selective for Clostridium difficile. J. Clin. Microbiol. 15, 443-446 (1982).
  18. Bliss, D. Z., Johnson, S., Clabots, C. R., Savik, K., Gerding, D. N. Comparison of cycloserine-cefoxitin-fructose agar (CCFA) and taurocholate-CCFA for recovery of Clostridium difficile during surveillance of hospitalized patients. Diagn. Microbiol. Infect. Dis. 29, 1-4 (1997).
  19. Marler, L. M., et al. Comparison of five cultural procedures for isolation of Clostridium difficile from stools. J. Clin. Microbiol. 30, 514-516 (1992).
  20. Sorg, J. A., Dineen, S. S. Laboratory maintenance of Clostridium difficile. Curr. Protoc. Microbiol. Chapter 9, Unit 9A 1(2009).
  21. Bouillaut, L., McBride, S. M., Sorg, J. A. Genetic manipulation of Clostridium difficile. Curr. Protoc. Microbiol. Chapter 9, Unit 9A 2(2011).
  22. Lemee, L., Pons, J. L. Multilocus sequence typing for Clostridium difficile. Methods. Mol. Biol. 646, 77-90 (2010).
  23. Shanholtzer, C. J., Peterson, L. R., Olson, M. N., Gerding, D. N. Prospective study of gram-stained stool smears in diagnosis of Clostridium difficile colitis. J. Clin. Microbiol. 17, 906-908 (1983).
  24. Smith, C. J., Markowitz, S. M., Macrina, F. L. Transferable tetracycline resistance in Clostridium difficile. Antimicrob. Agents Chemother. 19, 997-1003 (1981).
  25. Permpoonpattana, P., et al. Surface layers of Clostridium difficile endospores. J. Bacteriol. 193, 6461-6470 (2011).
  26. Putnam, E. E., Nock, A. M., Lawley, T. D., Shen, A. SpoIVA and SipL are Clostridium difficile spore morphogenetic proteins. J. Bacteriol. , (2013).
  27. Burns, D. A., Minton, N. P. Sporulation studies in Clostridium difficile. J. Microbiol. Methods. 87, 133-138 (2011).
  28. Perez, J., Springthorpe, V. S., Sattar, S. A. Clospore: a liquid medium for producing high titers of semi-purified spores of Clostridium difficile. J. AOAC Int. 94, 618-626 (2011).
  29. Sorg, J. A., Sonenshein, A. L. Inhibiting the initiation of Clostridium difficile spore germination using analogs of chenodeoxycholic acid, a bile acid. J. Bacteriol. 192, 4983-4990 (2010).
  30. O'Connor, J. R., et al. Construction and analysis of chromosomal Clostridium difficile mutants. Mol. Microbiol. 61, 1335-1351 (2006).
  31. Buggy, B. P., Wilson, K. H., Fekety, R. Comparison of methods for recovery of Clostridium difficile from an environmental surface. J. Clin. Microbiol. 18, 348-352 (1983).
  32. Koch, C. J., Kruuv, J. The release of oxygen from polystyrene Petri dishes. Br. J. Radiol. 45, 787-788 (1972).
  33. Ethapa, T., et al. Multiple factors modulate biofilm formation by the anaerobic pathogen Clostridium difficile. J. Bacteriol. , (2012).
  34. Speers, A. M., Cologgi, D. L., Reguera, G. Anaerobic cell culture. Curr. Protoc. Microbiol. Appendix 4, Appendix 4F(2009).
  35. Lyras, D., et al. Toxin B is essential for virulence of Clostridium difficile. Nature. 458, 1176-1179 (2009).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Anaerobe kamerisolatie van fecesmonstersbereiding van glycerolstockssporenummeringuitplaten op selectieve mediaanaerobe incubatieCFU berekeningbiosafety level 2kweek van vegetatieve cellen

Gerelateerde artikelen