Meting van totale Calcium in Neuronen door Electron Probe X-stralen micro analyse

Samenvatting

Dit artikel beschrijft de toepassing van cryoanalytical elektronenmicroscopie aan de kwantitatieve meting van het totale gehalte aan calcium en distributie op subcellulaire resolutie in fysiologisch gedefinieerde biologische monsters.

Samenvatting

In dit artikel de tools, technieken en instrumenten die geschikt is voor kwantitatieve metingen van intracellulaire elementaire inhoud met behulp van de techniek die bekend staat als elektronen probe micro analyse (EPMA) worden beschreven. Intramitochondriale calcium is bijzondere aandacht vanwege de cruciale rol die mitochondriale calciumoverbelasting speelt in neurodegeneratieve aandoeningen. De methode is gebaseerd op de analyse van röntgenstralen opgewekt in een elektronenmicroscoop (EM) door interactie van een elektronenbundel het model. Om de natieve verdeling van diffundeerbare elementen elektronenmicroscopie specimens behouden EPMA vereist "Cryofixatie" weefsel gevolgd door de bereiding van ultradunne vriescoupes. Snel invriezen van gekweekte cellen of organotypische slice culturen wordt uitgevoerd door duik invriezen in vloeibaar ethaan of door slam bevriezing tegen een koude metalen blok, respectievelijk uitgevoerd. Cryosecties nominaal 80 nm dik zijn droog gesneden met een diamant mes op ca.. -16076, C, gemonteerd op koolstof /-pioloform gecoate koperen roosters, en cryotransferred in een cryo-EM behulp van een gespecialiseerde cryospecimen houder. Na visueel onderzoek en locatie mapping op ≤ -160 ° C en lage dosis elektronen, bevroren gehydrateerd vriescoupes gevriesdroogd bij -100 ° C voor ~ 30 minuten. Organel-niveau afbeeldingen gedroogde vriescoupes worden geregistreerd, zelfs bij lage doses, door een langzame scan CCD camera en subcellulaire regio's geselecteerd voor analyse belang. Röntgenstralen uitgezonden door ROI door een stationaire, gerichte hoge intensiteit elektronen probe worden verzameld door een energie-dispersieve röntgen (EDX) spectrometer, verwerkt door bijbehorende elektronica en gepresenteerd als een X-ray spectrum, dat wil zeggen een perceel van X-ray intensiteit versus energie. Extra software vergemakkelijkt: 1) identificatie van elementaire componenten door hun "kenmerkende" piek energieën en vingerafdrukken, en 2) kwantitatieve analyse door extractie van piekgebieden / achtergrond. Dit artikel sluit af met twee voorbeelden die typisch illustrerenEPMA toepassingen, een waarin mitochondriale calcium analyse die kritisch inzicht in mechanismen van excitotoxische letsel en een andere die de basis van ischemie weerstand onthuld.

Inleiding

Calciumionen zijn misschien wel de belangrijkste en meest veelzijdige cell signaling entiteit in de biologie, spelen een essentiële rol in normale processen zo divers als synaptische transmissie en genexpressie. Anderzijds, calcium is even belangrijk in celdood. In het bijzonder calcium deregulering is een belangrijke factor in neuronale schade beroerte, Parkinson, Alzheimer en andere neurodegeneratieve aandoeningen ^3,5. Het is dus uiterst belangrijk om kwantitatief te begrijpen hoe calcium is verdeeld in cellen en hoe dit verandert na fysiologische of pathofysiologische stimuli. Dit doel wordt gecompliceerd door het feit dat calcium dynamisch verdeeld tussen twee fysieke toestanden - vrij in oplossing of gebonden aan een substraat - en die cellulaire calciumconcentraties veranderen verscheidene orden van grootte als gevolg van stimulatie.

Hoewel er verschillende geavanceerde methoden beschikbaar voor de analyse van free intracellulair calcium, is het totale gehalte aan calcium concentraties in bepaalde intracellulaire compartimenten realistisch beperkt tot een benadering, namelijk elektronen probe microanalyse (EPMA). EPMA is een techniek die paren een röntgenspectrometer een transmissie-elektronenmicroscoop (TEM). De TEM elektronenkanon richt een stationaire, submicron elektronen probe op een subcellulaire gebied van belang en het element-specifieke röntgenstraling als gevolg van elektronen bombardement worden verzameld en geanalyseerd (zie referenties ^{7, 4} voor gedetailleerde technische beoordelingen). Voordelen van EPMA omvatten enkel organel-niveau resolutie en submillimolar gevoeligheid. In de praktijk echter, EPMA vereist gespecialiseerde cryotechniques en instrumentatie voor het prepareren en analyseren. Hier, de tools, technieken en instrumenten geschikt zijn voor metingen van intracellulair calcium gebruik EPMA worden beschreven. Intramitochondriële calcium is van speciale iBELANG vanwege de cruciale rol die mitochondriale calciumoverbelasting speelt in neurodegeneratieve ziekten.

Protocol

De hier beschreven aanpak is ontwikkeld met behulp van specifieke instrumenten, tools en software. Omdat labs niet zal worden met dezelfde experimentele opstelling de aanpak wordt gegeneraliseerd waar mogelijk.

1. Snel invriezen

De analytische methode beschreven is geheel afhankelijk cryogene benaderingen: 1) de "Cryofixatie" cellen of weefsels op een manier die kwantitatief behoudt de verdeling van diffundeerbare weefselcomponenten en chemische elementen zoals ze in levende cellen op het moment van bevriezen , en 2) de voorbereiding van ultradunne cryosecties geschikt voor beeldvorming en analyse in een TEM. Deze technieken worden hier kort beschreven, maar details die nodig zijn om deze procedures te reproduceren in andere laboratoria vallen buiten het bestek van dit artikel. Geïnteresseerde lezers worden verwezen naar een uitstekende recente artikelen ^9,14.

Let op: Dit hoofdstuk beschrijft het gebruik van vloeibare zeeefied ethaan, dat licht ontvlambaar is en potentieel explosief, passende voorzorgsmaatregelen moeten worden genomen. Operator moet ook vertrouwd zijn met vloeibare stikstof _(LN2) veiligheidsmaatregelen, waaronder beschermende laboratoriumjas, glazen, en cryoresistant handschoenen. Opmerking: Hier en overal, alle gereedschappen (tangen, etc.) voor het afhandelen van bevroren monsters moeten worden voorgekoeld in LN ₂ voor gebruik om onbedoeld ontdooien vermijden.

Gekweekte cellen op dekglaasjes

1. Bereid een duik bevriezing apparaat door condensatie gasvormig ethaan bij -160 ° C in de LN _2-gekoelde centrale putje. Vul het merk en bedek de put met de scharnierende aluminium deksel wanneer niet in gebruik.
2. Met behulp van filterpapier wiggen, vlek plastic dekglaasjes van gekweekte cellen onder experimenteel geschikte omstandigheden tot een dunne waterige film. Dep van de rand om te voorkomen dat het aanraken van het weefsel, de ideale overblijvende film, bepaald door trial-and-error, is zo dun mogelijk maar niet zo ein als verdampen en laat drogen van het weefseloppervlak.
3. Houd de dekglaasje door de rand met het vastklemmen tang, snel onderdompelen in vloeibare ethaan, handmatig of met behulp van de zwaartekracht aangedreven plunjer.
4. Plaats de bevroren dekglaasje in een nabijgelegen piepschuim bakje LN _2, groot genoeg om het gewenste aantal dekglaasjes manipuleren in de langdurige opslag van containers. Aluminium schroefdop blikjes die niet grijpen onder LN ₂ wordt aanbevolen.

Snel invriezen van gekweekte hersenenplakken

5. Onder een microscoop ontleden, uitzicht en oriënteren een organotypische hippocampus slice, ongestoord en nog steeds verbonden aan de cultuur membraan insert. Plaats de vaste merktekens op het membraan in de buurt van de rand van het schijfje met een zwarte Sharpie type pen en een foto.
6. Nog onder de microscoop, uitgesneden ca. 5 x 5 mm membraan pleinen met afzonderlijke segmenten gericht op de pleinen. Vermijd het aanraken van de slice of buigen van de membraane.
7. Monteer een membraan ondersteunde plak, opgevangen door een ¼ diameter agar pad, op maat ontworpen aluminium schijf aan een cryoultramicrotome (hieronder beschreven) passen. Het schijfje snel bevriezen door pneumatisch voortbewegen tegen een LN _2-gekoeld saffier blok door middel van een op maat gemaakte inrichting "slam bevriezen".
8. Ga naar opslag zoals beschreven voor gekweekte cellen.

2. Cryosectioning

CAVEAT: Succesvol produceren van droge gesneden linten van ultradunne secties, terwijl eenvoudig en logisch, vereist training, geduld en veel oefenen.

1. Bak een cryoultramicrotome uitgerust met een cryoattachment en afkoelen tot -135 ° C.
2. Snijd bevroren dekglaasjes in ca.. 3 x 3 mm vierkantjes met een scherp, voorgekoeld scalpel. Embed stukken met culturen naar boven in een viskeuze vloeistof "cryoglue" (een 01:06 mengsel van ethanol en 2-propanol ^11), op standaard 3mm diameter aluminium pinnen ontworpen om de microtoom specimen boorkop passen. Vermijd lekkende cryoglue op cultuur oppervlak. Stollen cryoglue door verlaging van de cryobox temperatuur tot ≤ -160 ° C.
   • Voor bevroren plakjes hersenen, veilig rechtstreeks op schijven om een ​​op maat gemaakt exemplaar boorkop door middel van een schroef kraag.
3. Trim geselecteerde gebieden van de bevroren exemplaren - bijvoorbeeld cel-rijke gebieden van dekglaasje stukken of bepaalde gebieden van schijfjes - om een ca.. 250 x 250 micrometer blok gezicht en ~ 100 micrometer diepte met behulp van een diamant trimmen tool.
4. Droog gesneden linten dunne secties bij ca.. -160 ° C met een 35 ° diamant cryoknife, grotendeels zoals bij referencs ^{4, 9.} Snijsnelheid en mes vrijloophoek worden empirisch bepaald, een goed startpunt is 0,4-0,6 mm / sec bij 9 °. De nominale dikte, dwz specimen tevoren gehydrateerd secties is typisch 80 nm, hoewel secties zijn eigenlijk 1.5-2.0x dikker, voornamelijk als gevolg van compressie. Voor bevredigende snijden, een antistatisch materiaal essentieel. Plaats de ioniserende punt van het apparaat 0,5-1 cm van de snede en stel uitgangsvermogen tot bevredigende linten secties worden geproduceerd.
5. Bereid wimper sondes door lijmen (met epoxy) wimpers hout applicator stokken. Met behulp van een dergelijke sonde, pick-up en transfer delen van de achterkant van het mes op glow-ontladen, koolstof beklede pioloform ondersteuning films gegoten over 100-mesh vouwen koperen roosters en rusten op een half gevouwen indium folie envelop op een werkende plank achter het mes. Vouw de bovenste helft van de grid en envelop, pers met een koude persing tool.
6. Transfer verpakt grids een handige rooster doos en op te slaan in een aluminium kan zoals beschreven in stap 1.4.

3. Cryotransfer van specimens aan de Electron Microscope

Het belangrijkste instrument voor EPMAin dit laboratorium is een analytisch elektronenmicroscoop bedreven bij 120 kV en uitgerust voor cryomicroscopy, dat wil zeggen, ontworpen met een schone vacuüm, specimen-gebied anticontaminator, een 2k x 2k hoge gevoeligheid digitale camera en cryotransfer monsterhouder. Controleer vooraf microscoop uitlijning en bedrijfsomstandigheden in zowel laag-en hoog-vergroter modes en bevestig een bevredigende vacuümkolom, ideaal ≤ 10 ^-7 Torr. Tune up als dat nodig is.

1. Bevestigen dat de vacuüm isolatie van de component Dewar van de cryoholder bevredigend is. Pomp nodig.
2. Koel de cryoholder op de minimale temperatuur, ten minste -160 ° C, terwijl onder hoog vacuüm binnen de microscoop podium, koppel de kabel waarmee de houder om zijn schakelkast. Kantel de goniometer 45 ° naar links, voordat het verwijderen van de houder LN ₂ minimaliseren morsen op operator en microscoop oppervlakken.
3. Bereid de stationaire cryoworkstation door het koelen van de integrale isolerend cup tot ≤ 160 ° C.
4. Transfer (quickly!) de afgekoelde cryoholder van microscoop tot werkstation cryo. Trek de houder vorst schild.
5. Ophalen onder LN ₂ een raster broodje uit de opslag en plaats op de werktafel van de cryoworkstation. Een borgring voor de houder monsterholte is ook geplaatst op de tafel.
6. Open het indium envelop en verplaats de bijgevoegde vouwen raster om het model goed van de cryoholder. Zet de rooster met borgring met de bijgeleverde sleutel gereedschap verstrekt en sluit de vorst schild.
7. Verwijder snel de cryoholder uit de cryoworkstation en invoegen in de luchtsluis van de microscoop en ga door de pompen volgorde zo snel mogelijk. Bij het inbrengen, moet er een minimale verstoring van de kolom vacuüm zijn.
8. Terug goniometer tot 0 ° kantelen. Sluit en reenergize de schakelkast en bevestigen dat het monster temperatuur is ≤ 150 ° C.
9. Vul het Dewar van dePreparaathouder en laat vacuüm en temperatuur om volledig te herstellen.

4. Visuele Survey van de afdelingen

1. Trek de vorst schild van de houder om specimen bloot en zet de elektronenbundel.
2. Visueel evalueren het monster bij een lage vergroting, meestal 250X, en slechte verlichting. Zoals getoond in figuur 1, moet gedeelten dun en glad, niet gevouwen of overlappende, vlak en aan de steun bevestigd film, en doorgaans niet verduisterd door spijlen.
3. Eventueel fotograferen geselecteerde secties. (NB: De blootstelling bundel, aangezien bevroren gehydrateerd gedeelten zijn zeer gevoelig voor lichtbundel geïnduceerde schade.) Gebruik de geautomatiseerde digitale goniometer stadium coördinaten van geselecteerde gedeelten slaan.

5. Vriesdrogen van de afdelingen

1. Vriesdrogen secties door het verhogen van de houder temperatuur tot ca. -100 ° C voor ~ 30 minuten.
2. Recool houder tot -160 ° C of lager.
3. voor de beeldvorming, schakelt cryoholder besturingseenheid en fysiek loskoppelen controller kabel om te voorkomen afbeelding drift als gevolg van thermische cycli en / of trillingen pickup.

6. Beeldvorming van cellen en Organellen

Structurele beelden van gevriesdroogde secties worden verkregen bij ca.. -160 ° C als een geringe hoeveelheid, zero-loss beelden digitaal opgenomen met een 2k x 2k slow-scan CCD-camera geregeld door geschikte software.

1. Activeer de EM in hi-mag-modus.
2. Kies en imago bij ~ 2000 X (zoals TIFF's, zie figuur 2) geselecteerde cellen en subcellulaire gebieden van belang in hoogwaardige secties waarvan de locatie werden eerder opgenomen en opgeslagen. (NB: De gedroogde delen zijn nu aanzienlijk minder kwetsbaar en minder gevoelig voor elektronenbundel schade.
3. Evalueer afbeeldingen om regio's van belang (ROI) te selecteren voor X-stralen analyse. Deze stap kan optioneel worden uitgevoerd off-lijn, waarbij de EM kan worden gedraaiduitgeschakeld en het monster opgewarmd tot kamertemperatuur.

7. Overname van X-ray Spectra

X-ray spectra kunnen worden opgenomen met een van meerdere commerciële of op maat ontworpen X-stralen analyse systemen minimaal bestaande uit een energie-dispersieve X-stralen (EDX) detector, bijbehorende puls-processor elektronica en compatibel acquisitie en weergave software. (Het systeem in dit laboratorium is beschreven in tabel 1.)

1. Configureer de EM voor de X-ray overname door het invoegen van de EDX detector in de kolom (indien nodig), het intrekken van de objectieve diafragma, en het plaatsen en centreren van elke verdwaalde straling openingen. Stel de cryoholder de laagste temperatuur waarbij vorst verontreiniging van het monster vermeden, maar ten minste onder -100 ° C.
2. Kantel de houder 20 ° in de richting van de detector.
3. Onder wide-field imaging omstandigheden en uitgaande van een plan om de matrix van een individuatie analyserenl mitochondriën, kies een mitochondrion voor analyse, verplaatsen naar het midden van het veld en de focus.
4. Ga naar spot-modus (op sommige microscopen gewoon convergeren de balk met behulp van tweede condensor focus) en verhoging van de straalstroom tot ca.. 3 nA (zoals gemeten met een Faraday-beker of iets dergelijks) in een 100 nm plek.
5. Start het spectrum acquisitie software en beginnen 100 sec overnames, die kunnen worden bekeken live-tijd op de monitor. Sparen opgenomen spectrum (figuur 2). De industrie standaard EMSA formaat heeft de voorkeur.
6. Schakel de EM en de overdracht van de multiple-spectra file (s) naar een (offline) analyse werkstation.

8. Analyse van de X-ray Spectra

Kwalitatieve analyse

Een EDX spectrum (figuur 2, inzet) is in wezen een xy plot van de X-ray intensiteit versus energie. Spectra bevatten kwalitatieve en kwantitatieve informatie over de elementaire samenstelling van de tHij analyseerde volume, dat de "karakteristieke" energie van een piek identificeert het element die aanleiding geven tot dat de piek, terwijl de intensiteit weerspiegelt de hoeveelheid van dat element. De kenmerkende pieken rijden op een langzaam variërende achtergrond, het "continuum". (De legenda van figuur 2 nader ingegaan saillante details EDX spectra.) De energie van de piek collector voor het gehele periodieke tabel worden gedefinieerd door de bekende elektronische structuur van elementen, waardoor alle EDX software koppelt een database die automatisch identificeert componenten een analyt. In een fysiologische context, elementen van algemeen belang die goed geschikt is voor EDX analyse zijn Na (K _α op 1,04 keV), P (2,01 keV), K (3,31 keV) en Ca (3,69 keV).

1. Profiteer van de beschikbare software-database en de piek matching routines om belangrijke elementen in de spectra te identificeren. In een biologisch monster verwachten pieken voor Na, Mg, P, S, Cl, K, Ca en vinden. (LET OP:De laatste twee elementen elkaar overlappen!)

Kwantitatieve analyse

Kwantitatieve analyse van EDX spectra bestaat onttrokken geïntegreerde gebied van geïdentificeerde pieken en omzetten van deze waarde tot een concentratie. Voor biologische analyse, de vastgestelde aanpak is de Hal piek / continuüm methode ^4,7,10, die profiteert van het feit dat de intensiteit van het continuüm (hierboven en in figuur 2 gedefinieerd) is evenredig met het drooggewicht van het geanalyseerde volume . Zo is de verhouding piekoppervlakte / continuüm gebied, vergeleken met dezelfde verhouding in spectra van standaarden met bekende samenstelling, bepaalt de concentratie in de beoogde cellulaire compartiment. Merk op dat deze aanpak voorziet concentraties in eenheden van mol per gewicht, meestal uitgedrukt in mmol / kg drooggewicht. Dit toestel is ongebruikelijk en vertolking kunnen extra conversie te eisen, bijvoorbeeld mmol / L natgewicht of mmol / mg eiwit, zoals beschreven elsewhere ^4,10.

2. Extract piekoppervlakken (en foutenschattingen) biologische elementen tussen Z = 10-20 (0,5-4,0 keV), dwz Na, Mg, P, S, Cl, K en Ca, via een van de fitting routines ingebouwd in analysesoftware (zie tabel 1, in het bijzonder voetnoot 4). Dit lab maakt gebruik van Simplex of meerdere kleinste kwadraten fitting. Merk op dat deze montage vereist een zorgvuldige aandacht voor het oplossen van de overlap tussen K en Ca pieken (zie figuur 2).
3. Integreer het continuüm tussen 1,45-1,61 keV. Alternative storingsvrije gebieden worden gebruikt.
4. Bereken piek / continuüm verhoudingen en vervolgens concentraties in vergelijking met normen. Propageren fouten in de hele analyse.
5. Gebruik standaard statistische software en formules om gemiddelden die biologische variabiliteit reflecteren schatten.

Resultaten

Hersencellen typisch ondersteunen excitotoxische schade als gevolg van de pathologische neurotransmitters die optreedt onder ischemische omstandigheden. EPMA was van cruciaal belang om te ontdekken hoe het vermogen van neuronale mitochondriën om enorme hoeveelheden calcium afzonderen ten grondslag ligt aan het mechanisme van de schade. De elektronenmicroscoop figuur 3 illustreert de verschijning van mitochondriën in gevriesdroogde cryosecties gekweekte hippocampale neuronen na 30 minuten blootstelling a...

Discussie

De elektronen microscoop gebaseerde analytische methode hier gepresenteerde maakt de detectie, identificatie en kwantificering van verscheidene elementen van biologisch belang, zoals Na, K, P, vooral Ca. Deze analyses kunnen op subcellulaire worden uitgevoerd, dat wil zeggen, intra-organel, resolutie als gevolg van de mogelijkheid om te lokaliseren en structuren van belang bij hoge-kwaliteit beelden van cryosecties bereid uit snel ingevroren monsters te identificeren. Merk op dat er geen kleuring nodig is om el...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
REAGENTS/MATERIALEN
Thermanox plastic dekglasjes	Thermo Fischer Scientific	72280
Cultuur inserten	BD Falcon	353090	Voor 6-well platen
Cryopins	Leica Microsystems	16701952	Gegroefd
Houten applicators	EM Sciences	72300
Vouwende EM rasters	Ted Pella	4GC100/100	100 maas
Indium folie	Alfa Aesar	13982	0.25 mm dik
APPARATUUR
Dompelvriesapparaat	Leica Microsystems	KF-80
Slamvriesapparaat	LifeCell	CF-100
Ultramicrotoom	Leica Microsystems	UC6
Cryoaanhechting voor microtoom	Leica Microsystems	FC6
Diamant cryotrimgereedschap	Diatome	Cryotrim 45
Diamant cryomes	Diatome	Cryo 35
Antistatisch apparaat	Diatome	Hauf Static Line
Cryo elektronenmicroscoop	Carl Zeiss Microscopy	EM912 Omega
EM cryo specimen houder	Gatan	CT3500
Slow-scan CCD camera, 2k x 2k	Troendle (TRS)	Sharpeye
Beeldverwervingssoftware	Olympus SIS	iTEM suite
ED x-ray detector	Oxford Instruments	Linksystem Pentafet
Pulse Processor	Oxford Instruments	XP-3
PCI backplane kaart	4pi Systems	Spectral Engine II
Desktop computer	Apple	Elk OS9-compatibel model
X-ray analysesoftware	NIST	DTSA, DTSA II
Spreadsheet software	Microsoft	Excel
De CF100 wordt niet langer commercieel verkocht, hoewel de machine beschikbaar is bij veel academische instellingen en complete machines of onderdelen online te vinden zijn. Een video-tutorial voor de CT3500 cryotransfer houder is beschikbaar op http://www.gatan.com/files/Movies/CT3500_Cryo_transfer_holder.mp4. De SEII is verouderd; de Universal Spectral Engine is een later, PC-compatibel product met vergelijkbare functionaliteit. 4pi is gestopt met productie en verkoop, maar biedt nog steeds technische klantenondersteuning. Gebruikte systemen zijn vaak online te vinden. De originele DTSA is nu verouderd. NIST biedt in het publieke domein een bijgewerkte opvolger, DTSA II 12 (http://www.nist.gov/mml/mmsd/software.cfm)