Deze methode beschrijft het gebruik van klikchemie op veranderingen in gastheercel transcriptie meten na infectie met het Rift Valley fever virus (RVFV) stam MP-12. De resultaten kunnen worden gevisualiseerd kwalitatief via fluorescentie microscopie of verkregen kwantitatief via flowcytometrie. Deze methode kan worden aangepast voor gebruik met andere virussen.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Met Click Chemie aan het effect van de virale infectie Meet op Host-cel RNA Synthese
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Veel RNA virussen zijn geëvolueerd de mogelijkheid gastheercel transcriptie remmen als middel om cellulaire afweer omzeilen. Voor de studie van dergelijke virussen, is het daarom belangrijk om een snelle en betrouwbare manier van meten transcriptionele activiteit in geïnfecteerde cellen. Traditioneel is transcriptie ofwel is gemeten door incorporatie van radioactieve nucleosiden zoals 3H-uridine gevolgd door detectie via autoradiografie of scintillatietelling, of opname van gehalogeneerde uridine analogen zoals 5-bromouridine (BRU) gevolgd door detectie door immunokleuring. Het gebruik van radioactieve isotopen, vereist echter speciale apparatuur en niet haalbaar in een aantal laboratoria instellingen waarbij de detectie van bru omslachtig kan zijn en lijden aan lage gevoeligheid.
De chemie recent ontwikkelde klik, dat een koper-gekatalyseerde triazool vorming van een azide en een alkyn gaat, biedt nu een snelle en highly gevoelig alternatief voor deze twee methoden. Klikchemie is een tweestaps werkwijze waarbij ontluikende RNA wordt eerst gemerkt door incorporatie van de analoge uridine 5-ethynyluridine (EU), gevolgd door detectie van de label een fluorescent azide. Deze aziden zijn beschikbaar als verschillende fluoroforen, waardoor een breed scala van opties voor visualisatie.
Dit protocol beschrijft een methode om transcriptionele onderdrukking te meten in cellen geïnfecteerd met het Rift Valley fever virus (RVFV) stam MP-12 met behulp van click chemie. Tegelijkertijd wordt de expressie van virale proteïnen in deze cellen bepaald door klassieke intracellulaire immunokleuring. Stappen 1 tot 4 detail van een methode om transcriptionele onderdrukking visualiseren via fluorescentie microscopie, terwijl stap 5 tot 8 detail van een methode om transcriptionele onderdrukking kwantificeren via flowcytometrie. Dit protocol is eenvoudig aanpasbaar voor gebruik met andere virussen.
Inleiding
Traditioneel is transcriptionele activiteit werd gemeten door incorporatie van zowel radioactieve (3H-uridine) 1 of gehalogeneerde (BRU) 2 nucleosiden in ontluikende RNA. Deze uridine analogen worden door cellen, omgezet in uridine-trifosfaat (UTP) via nucleoside salvage pathway, en vervolgens opgenomen in nieuw gesynthetiseerde RNA. 3H-uridine kan worden gedetecteerd door autoradiografie, die tijdrovend of scintillatie tellen, die gespecialiseerde apparatuur vereist. Bovendien kan het gebruik van radioactieve isotopen niet praktisch zijn in een aantal laboratoria instellingen, waaronder high containment biosafety laboratoria. B....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
Analyse van transcriptie bij fluorescentiemicroscopie
1. Infecteren cellen met MP-12 en Label ontluikende RNA met EU
- Plaats 12-mm round dekglaasjes in 12-well weefselkweek plaat, een dekglaasje per putje.
Opmerking: Als cellen hebben moeite zich te houden aan dekglaasjes, jas met poly-L-lysine (MW ≥ 70.000) voordat u het in putten. Hiertoe dompel dekglaasjes in een steriele 0,1 mg / ml oplossing in H2O van poly-L-lysine gedurende 5 minuten. Spoel coverslips met steriele H 2 O en de lucht drogen gedurende minstens 2 uur.
- Om zaad 293-cel....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
De NSS eiwit van RVFV (Bunyaviridae familie, genus Phlebovirus) 11 remt gastheercel algemene transcriptie via twee verschillende mechanismen: (i) door het sekwestreren p44 subeenheid van de basale transcriptiefactor TFIIH 11 en (ii) bevordering van de proteasomale afbraak van p62 subeenheid van TFIIH 6. De RVFV MP-12 vaccinspanning 13 is gebruikt voor de in dit protocol beschreven experimenten sinds MP-12 stam kan worden behandeld in een bioveiligheidsniveau .......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
De protocol beschrijft een methode om het effect van virale infecties aan gastheercel transcriptie gemeten via incorporatie van de uridine analoge EU in wording RNA. Deze werkwijze heeft verschillende voordelen ten opzichte van eerdere methoden: het is snel, gevoelig, en niet afhankelijk van het gebruik van radioactieve isotopen. Verder kan de werkwijze worden aangepast om kwalitatieve gegevens opleveren door fluorescentiemicroscopie of kwantitatieve gegevens via stroomcytometrie door toepassing van vrijwel dezelfde rea.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
Geen belangenconflicten verklaard.
Dankbetuigingen
Wij danken RB Tesh voor het verstrekken van de muis polyklonale anti-RVFV antiserum en M. Griffin van de UTMB flowcytometrie Core Facility voor hulp bij flowcytometrie. Dit werk werd ondersteund door 5 U54 AI057156 via de Western Regional Center of Excellence, NIH-subsidie R01 AI08764301, en de financiering van de Sealy Center for Vaccine Development bij UTMB.BK werd gesteund door de James W. McLaughlin Fellowship Fund op UTMB.OL werd ondersteund door een Maurice R. Hilleman Early-Stage Career Investigator Award.
....Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| 5-ethynyl-uridine | Berry Associates | PY 7563 | oplossen in DMSO voor 100 mM stock |
| 12-mm ronde dekglasjes | Fisherbrand | 12-545-82 | |
| 5 ml polystyreen buisjes | BD Biosciences | 352058 | |
| Actinomycine D (ActD) | Sigma | 9415 | oplossen in DMSO voor 10 mM stock |
| Alexa Fluor 488 geit anti-muis IgG | Invitrogen | A-11029 | |
| Rund Serum Albumine (BSA) | Santa Cruz | sc-2323 | |
| CuSO4 | Sigma | C-8027 | oplossen in H2O voor 100 mM stock |
| DAPI | Sigma | D-9542 | oplossen in H2O voor 5 mg/ml stock |
| DMEM | Invitrogen | 11965092 | |
| FBS | Invitrogen | 16000044 | |
| fluorescent azide (Alexa Fluor 594-gekoppeld) | Invitrogen | A10270 | |
| fluorescent azide (Alexa Fluor 657-gekoppeld) | Invitrogen | A10277 | |
| Fluoromount-G | Southern Biotech | 0100-01 | |
| L-ascorbinezuur | Sigma | A-5960 | oplossen in H2O voor 500 mM |
| papierfilter | VWRbrand | 28333-087 | |
| paraformaldehyde | Sigma | 158127 | |
| Penicilline-Streptomycine | Invitrogen | 15140122 | |
| poly-L-lysine (MW ≥ 70000) | Sigma | P1274 | |
| Triton X-100 | Sigma | T-8787 | |
| Trizma base | Sigma | T-1503 | oplossen in H2O voor 1.5 M stock, pH 8.5 |
| Trypsin-EDTA | Invitrogen | 25200056 | |
| Fluorescentiemicroscoop | bijv. Olympus IX71 | ||
| Flow Cytometer | bijv. BD Biosciences LSRII Fortessa |
Referenties
- Fakan, S. Structural support for RNA synthesis in the cell nucleus. Methods Achiev. Exp. Pathol. 12, 105-140 (1986).
- Jensen, P. O., Larsen, J., Christiansen, J., Larsen, J. K. Flow cytometric measurement of RNA synthesis using bromouridine lab....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
