Methodenartikel

Confocale beeldvorming van Single mitochondriaal superoxide Knippert Intact Heart of In Vivo

DOI:

10.3791/50818

⸱

5 november 2013

 , 
1Mitochondria and Metabolism Center, Department of Anesthesiology and Pain Medicine, University of Washington

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Confocale scanning microscopie wordt toegepast voor beeldvorming enkele mitochondriale gebeurtenissen in doorbloed hart of skeletspieren in levende dieren. Real-time monitoring van enkele mitochondriale processen zoals superoxide flitsen en membraanpotentiaal schommelingen kan de evaluatie van de mitochondriale functie in een fysiologisch relevante context en tijdens pathologische verstoringen.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Mitochondrion is een kritische intracellulaire organellen verantwoordelijk voor de productie van energie en intracellulaire signalering in eukaryote systemen. Mitochondriale dysfunctie vergezelt vaak en draagt ​​bij menselijke ziekte. De meerderheid van de benaderingen die zijn ontwikkeld om mitochondriale functie en dysfunctie evalueren op basis van in vitro of ex vivo metingen. Resultaten van deze experimenten beperkt vermogen bepalen mitochondriale functie in vivo. Hier beschrijven we een nieuwe benadering die confocale scanning microscopie gebruikt voor de beeldvorming van intacte weefsels in levende aminals, die de evaluatie van een mitochondriale functie kan in een real-time wijze in vivo. Ten eerste, genereren we transgene muizen die het mitochondriale gerichte superoxide indicator, circulair gepermuteerde geel fluorescerend eiwit (mt-cpYFP). Verdoofde mt-cpYFP muis wordt op een op maat gemaakte stadium adapter en time-lapse beelden worden genomen fROM De blootgestelde skeletspieren van het achterbeen. De muis wordt vervolgens opgeofferd en het hart is ingesteld voor Langendorff perfusie met fysiologische oplossingen bij 37 ° C. De doorbloed hart is gepositioneerd in een speciale kamer op de confocale microscoop podium en zachte druk wordt uitgeoefend op het hart te immobiliseren en te onderdrukken hartslag veroorzaakte bewegingen artefact. Superoxide flitsen worden gedetecteerd door real-time 2D confocale beelden met een frequentie van een frame per seconde. De perfusie oplossing kan worden aangepast aan verschillende substraten ademhaling of andere fluorescente indicatoren bevatten. De perfusie kan ook worden aangepast aan ziektemodellen zoals ischemie en reperfusie produceren. Deze techniek is een unieke benadering voor het bepalen van de functie van enkele mitochondriën in intacte weefsels en in vivo.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Mitochondriën spelen een centrale rol in de cel bio-energetica, vrije radicalen signalering, redox homeostase, ionenregulatie en cellot vastberadenheid 1,2. Mitochondriën dysfunctie vergezelt vaak en ten grondslag aan de pathogenese van ziekten 3-6. Vooral in de spier systemen zoals het hart en de skeletspieren, mitochondriale ademhaling levert de meeste ATP tijdig regulatie van intracellulair calcium en robuuste krachtontwikkeling 7,8 ondersteunen. Deze spieren hebben een groot aantal mitochondria die vaak innemen tot 20-40% van het totale celvolume en worden "vaste" tussen myofilamenten 2.

Ondanks talrijke studies, ons begrip van de mitochondriale functie, met name bedoeld in vivo en onder fysiologisch relevante omstandigheden, is beperkt. Een van de redenen is dat de meerderheid van de ontwikkeld voor evaluatie mitochondriale werkwijzen vertrouwen in Vitro of ex vivo technieken, zoals het toezicht het zuurstofverbruik van geïsoleerde mitochondria aangevuld met kunstmatige substraten en de indirecte bepaling van de mitochondriale functie door morfologie (bv. elektronenmicroscopie), enzymactiviteit (zoals aconitase activiteit) of intracellulaire ATP 9-11 .

Onlangs hebben kleine molecule fluorescente indicatoren relatieve mitochondriaal verrijking toegepast op een blik van de mitochondriale signalen, waaronder membraanpotentiaal, calcium en reactieve zuurstof species (ROS), in intacte cellen 11-13 verschaffen. Bovendien hebben diverse groen fluorescerend eiwit (GFP) gebaseerd redox en ROS indicatoren ontwikkeld om meer specifieke evaluatie van de gecompartimenteerde intracellulaire redox of ROS aangeeft 14-16 bereiken. Onder deze, ontwikkelden we een genetisch gecodeerd superoxide indicator, de cirkelvormige gepermuteerde geel fluorescerend eiwit, en targeted het in de mitochondriën (mt-cpYFP) 17. mt-cpYFP kan worden opgewekt bij 405 of 488 nm met beide emissie pieken op 515 nm. De emissie bij 488 nm excitatie specifiek reageert superoxide zoals door eerdere in vitro en in vivo kalibraties 17,18. De emissie bij 405 nm excitatie wordt gebruikt als interne controle (zie figuur 1 van Ref 17 voor gedetailleerde informatie over de emissie en excitatie spectra van mt-cpYFP onder verschillende omstandigheden). Met time-lapse confocale imaging, detecteert deze indicator barsten superoxide productie gebeurtenissen, genoemd superoxide flitsen, in enkele mitochondriën van intacte cellen. Superoxide flitser dient als een samengestelde functie van mitochondriale ademhaling, begeleidende voorbijgaande mitochondriale membraandepolarisatie en ROS productie 17-20. Onlangs hebben we de pan-weefsel mt-cpYFP transgene muizen met behulp van de pUC-CAGGS-mt-cpYFP vector 17,19 op C57/BL6 achtergrond gegenereerd en gecontroleerd de sterke expresning van deze indicator in het hart, de skeletspieren en andere weefsels (figuur 2). De transgene muizen zal beschikbaar zijn voor geïnteresseerde academische onderzoekers zijn op aanvraag en MTA goedkeuring door de Universiteit van Washington.

In deze studie beschrijven we in situ beeldvorming van superoxide knippert in Langendorff doorbloed hart als in vivo beeldvorming van flash gebeurtenissen in skeletspieren van verdoofde mt-cpYFP transgene muizen 17,19. Deze technologie maakt real-time monitoring van enkele mitochondriale ROS productie gebeurtenissen in een fysiologisch relevante voorwaarde of in vivo 21,22. Het is ook mogelijk om het systeem te gebruiken om andere afzonderlijke parameters zoals mitochondriale membraanpotentiaal en calcium met geschikte fluorescente indicatoren controleert. Verder, gelijktijdig en parallel evaluatie van de mitochondriale functie met intracellulaire gebeurtenissen (bijvoorbeeld calcium transiënten) of hartfunctie (bijv.. Ejectiefractie) worden bereikt. Pathologische storingen, zoals ischemie en reperfusie, kunnen worden toegepast op geperfundeerde hart om het effect van stress op enkele mitochondriale functie in de intacte myocardium beoordelen.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Experiment Voorbereiding

  1. Bereid de isotone gebalanceerde zoutoplossing (50 ml) bevattende: 140 mM NaCl, 5 mM KCl, 2,5 mM CaCl2, 2 mM MgCl2 en 10 mM HEPES (pH 7,2) voor in vivo beeldvorming skeletspieren.
  2. Bereid 1 L van Krebs-Henseleit buffer (KHB) bevattende: 118 mM NaCl, 5,3 mM KCl, 1,2 mM MgSO4, 0,5 mM EDTA en 25 mM NaHCO 3.
  3. Bel de KHB gas bevattende 95% O 2/5% CO2 gedurende 10-15 minuten voorafgaand aan de toevoeging van 2 mM CaCl2. Voeg metabole substraten (bijv. 10 mM glucose en 0,5 mM pyruvaat).
  4. Bereid de chirurgische instrumenten door steriliseren van de klem, schaar en forceps in 70% ethanol en vervolgens spoelen in gesteriliseerd DDH 2 O.
  5. Zet het hart perfusie systeem, stel de temperatuur op het waterbad en circulatiepomp, de snelheid van de peristaltische pomp tot 6 ml / min.
  6. Bubble de KHB met 95% O 2/ 5% CO2 gas en bewaken de stroomsnelheid en temperatuur (37 ° C, door een vezeloptische sonde) van het effluent. Het systeem moet ongeveer 20 min voor gas en temperatuurequilibratie.

2. Confocale beeldvorming van skeletspieren In Vivo

  1. Verdoven muis met pentobarbital (80 mg / kg, ip). Het dier zal chirurgische anesthesie (geen reactie op teen knijpen) bereiken binnen 10-15 minuten en in deze status 1-1,5 uur, voldoende voor de in vivo beeldvorming van skeletspieren.
  2. Borstel op een van de achterpoten en steriliseer de huid met 70% ethanol.
  3. Een insnijding op de huid langs de buitenzijde van het been aan de gastrocnemius spieren bloot.
  4. Pak de epimysium voorzichtig met een scherpe tang en maak een insnijding door het met een schaar. Verder ontleden om het epimysium te verwijderen en de spiervezels bloot eronder.
  5. Voor in vivo laden van TMRM in het skeletspier, omvatten TMRM (500 nM) in de isotone gebalanceerde zoutoplossing om spieren te dompelen gedurende 30 minuten en daarna wassen door-indicator oplossing.
  6. Plaats de muis op zijn kant op de confocale microscoop (Zeiss LSM 510) fase en beperken het achterste deel in een positie die de blootgestelde skeletspier is gericht tegen het dekglaasje dat de bodem van de kamer vormt. Het dekglaasje ligt tussen het spierweefsel en het omgekeerde objectief (40x olie).
  7. Druk op de been zachtjes te nauw contact tussen het weefsel en het dekglaasje te maken. Dompel de blootliggende spieren in isotone gebalanceerde zoutoplossing.
  8. Record tweedimensionale (2D, xy) confocale beelden met een sampling rate van een seconde per frame. De intensiteit van elke pixel wordt gedigitaliseerd 8-bits diepte. Meestal een seriële scan bevat 100 frames.
  9. Verzamel opeenvolgende beelden door eerst spannend bij 405 nm en het verzamelen bij> 505 nm dan bij 488 nm, terwijl het verzamelen van> 505 nm voor dubbele golflengte excitation beeldvorming van mt-cpYFP. Gebruik sequentiële excitatie bij 405, 488 en 543 nm, en het verzamelen van emissie bij 505-545, 505-545 en> 560 nm, respectievelijk voor triple golflengte excitatie beeldvorming van mt-cpYFP en TMRM.

3. Confocale beeldvorming van geperfuseerde Mouse Hart

  1. Onmiddellijk na de in vivo beeldvorming van skeletspieren, injecteer de muis met 200 eenheden heparine (ip). Tien minuten later, euthanaseren de muis door thoracotomie en snel te verwijderen van het hart met de longen en de thymus die eraan verbonden zijn.
  2. Verwijder snel de long in ijskoude buffer. Identificeer de lobben van de thymus en voorzichtig afpellen terug naar de opgaande aorta bloot.
  3. Verwijder de thymus en isoleer de aorta door het zorgvuldig verwijderen van het omringende weefsel.
  4. Voeg een snede aan de bovenkant van de aorta ascendens voordat het eerste onderdeel van de aortaboog.
  5. Houd de wand van de aorta zachtjes met twee micro hechten tang om het lumen bloot te leggen en zorgvuldig plaats de aorta op de cannula (PE50 buis). De aorta wordt op zijn plaats gehouden met een micro schip klem terwijl hechtingen snel zijn gebonden rond de aorta.
  6. Verwijder de klem, zorgvuldig de canule met een tang om te controleren of het uiteinde van de canule is boven aortawortel. Extra banden worden toegevoegd als nodig is om het hart zijn plaats te houden.
  7. Schakel de peristaltische pomp en perfuseren het hart bij 1 ml / min. Het hart wordt hervat kloppen bij perfusie.
  8. Pas de positie van de perfusie-systeem en zet het hart op de microscoop podium. Het podium heeft een adapter die verwarming van de kamer die het hart houdt toelaat.
  9. Voeg 1 ml van KHB perfusie-oplossing in de kamer gedeeltelijk onder water het hart. Monitor temperatuur van de kamer bij 37 ° C. Verwijder effluent uit de kamer door een peristaltische pomp.
  10. Verhoog de snelheid van de peristaltische pomp geleidelijk een debiet (ongeveer 2 ml / min) leveren aan het hart.
  11. Na 10 min van stabilisatie, perfuseren de heart met 10 uM blebbistatin en 100-500 nM TMRM. Hartslag zal vertragen na 10 minuten.
  12. Pas lichte druk op het hart om nauw contact van het hart te waarborgen met het dekglaasje op de bodem van de kamer en hartslag verder onderdrukken.
  13. Volg dezelfde procedure voor confocale beeldvorming van intacte myocard zoals beschreven in stap 2.8 hierboven. Zorgvuldig aanpassen van de focal plane naar de duidelijkste mogelijke beeld te onthullen.

4. Beeldverwerking en data-analyse

  1. Gebruik tools die door de "fysiologische analyse" module van de confocale software om enkele mitochondriale flitsen en membraanpotentiaal veranderingen te analyseren. Deze module wordt vaak opgenomen in het beeld verwerven van software van de confocale systeem en maakt de bepaling van bepaalde gebieden in het beeld als output van fluorescentie-intensiteit met de tijd labels.
  2. Open de database en vervolgens de seriële 2D image-bestand te analyseren.
  3. Klik op de "Regioof Interest (ROI) betekenen "om over te schakelen naar de" gemiddelde van ROI "-modus. Klik op de 'Region of Interest (ROI) betekenen" om over te schakelen naar de "gemiddelde van ROI"-modus.
  4. Schakel de weergave van andere kanalen, behalve het kanaal van cpYFP 488 nm voor het selecteren van de flitsen.
  5. Zoom in het beeld en handmatig verplaatsen schuifbalk naar de seriële 2D-beelden af ​​te spelen.
  6. Identificeer enkele mitochondriale superoxide flitsen door het lokaliseren van de site waar fluorescerend signaal toeneemt kortstondig. Gebruik de juiste ROI tool om de flitsen te markeren. Het trace met tijdsafhankelijke fluorescentie verandering van elk ROI zal verschijnen naast het beeld.
  7. Na het selecteren van alle knippert, zet de weergave van andere kanalen. Selecteer een ROI op de afbeelding buiten de cel achtergrondsignaal aftrekken. Output de gemiddelde fluorescentie van elke ROI met de tijd labels.
  8. Noteer het aantal flitsen in elk van de seriële scanning beeldbestand met de scantijd en gebiedde cel. Excel gebruiken om flash frequentie berekenen aantal flitsen per 100 sec / 1000 um 2 cel gebied.
  9. Gebruik een op maat ontwikkelde programma geschreven in Interactive Data Language (IDL, ResearchSystems) om de parameters van elke flash (amplitude, tijd tot piek en verval tijd) te berekenen. IDL software is commercieel beschikbaar en de op maat ontwikkelde programma voor flitsparameter analyse kan worden verkregen van de auteur op verzoek.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Volgens dit protocol, kan in vivo beeldvorming van enkele mitochondriale gebeurtenissen worden gedaan in skeletspieren van verdoofde muizen gevolgd door in situ beeldvorming in doorbloed hart (figuur 1). De optimale instelling van de beeldvorming voorwaarden zullen zorgen voor duidelijke beelden van de intacte spierweefsel en met enkele mitochondrion resolutie (figuur 2). TMRM wordt vaak gebruikt om de locatie van mt-cpYFP verifiëren en moet een volledige overlapping p...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Beeldvorming enkele mitochondriale gebeurtenissen in levende dieren of perfusie organen heeft belangrijk voordeel ten opzichte van traditionele methoden voor de mitochondriale functie evaluatie 17,19,21,22,24,25. De hier beschreven techniek kan real-time te bereiken in situ bepaling van de mitochondriale functie in een echte fysiologische toestand op de subcellulaire resolutie. Dit is bijzonder nuttig in combinatie met andere metingen, systemisch analyse van de rol van mitochondriën in de normale fun...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs verklaren dat zij geen concurrerende financiële belangen.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs willen graag Drs bedanken. Heping Cheng, Huiliang Zhang en Stephen Kolwicz voor hun waardevolle commentaar en technische ondersteuning bij de ontwikkeling van deze methode. Deze studie werd ondersteund door NIH subsidies en de Scientist Development Grant van American Heart Association om WW.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
REAGENTS
BlebbistatinToronto Research ChemicalsB592500
CaCl2Acros OrganicsAC34961-5000
EDTAFisher ScientificBP120-500
D-GlucoseSigma-AldrichG8270-1
HEPESSigma-AldrichH7006-500
KClSigma-AldrichP9541-1
MgCl2•6H2OFisher ScientificBP214-500
MgSO4•7H2OSigma-AldrichM1880-1
NaClFisher ScientificBP358-212
NaH2PO4Sigma-AldrichS8282-500
NaHCO3Sigma-AldrichS6014-1
PyruvateSigma-AldrichP2256-25
TMRMInvitrogenT-668
EQUIPMENT
Confocal Line Scanning Microscope (LSM 510 Meta, Zeiss), software versie 4.2 SP1 inclusief "Physiological Analysis" module.

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Brookes, P. S., Yoon, Y., Robotham, J. L., Anders, M. W., Calcium Sheu, S. S. Calcium, ATP, and ROS: a mitochondrial love-hate triangle. Am. J. Physiol. Cell Physiol. 287, 817-833 (2004).
  2. Scheffler, I. E. Mitochondria. , 2nd, J. Wiley and Sons, Inc. (2008).
  3. Rosca, M. G., Hoppel, C. L. Mitochondria in heart failure. Cardiovasc. Res. 88, 40-50 (2010).
  4. Griffiths, E. J. Mitochondria and heart disease. Adv. Exp. Med. Biol. 942, 249-267 (2012).
  5. Winklhofer, K. F., Haass, C. Mitochondrial dysfunction in Parkinson's disease. Biochim. Biophys. Acta. 1802, 29-44 (2010).
  6. Pieczenik, S. R., Neustadt, J. Mitochondrial dysfunction and molecular pathways of disease. Exp. Mol. Pathol. 83, 84-92 (2007).
  7. Szentesi, P., Zaremba, R., van Mechelen, W., Stienen, G. J. M. ATP utilization for calcium uptake and force production in different types of human skeletal muscle fibres. J. Physiol. 531, 393-403 (2001).
  8. Lemieux, H., Hoppel, C. L. Mitochondria in the human heart. J. Bioenerg. Biomembr. 41, 99-106 (2009).
  9. Chance, B., Williams, G. R. Respiratory enzymes in oxidative phosphorylation. III. The steady state. J. Biol. Chem. 217, 409-427 (1955).
  10. Lambert, A. J., Brand, M. D. Reactive oxygen species production by mitochondria. Methods Mol Biol. 554, 165-181 (2009).
  11. Brand, M. D., Nicholls, D. G. Assessing mitochondrial dysfunction in cells. Biochem. J. 435, 297-312 (2011).
  12. Robinson, K. M., et al. Selective fluorescent imaging of superoxide in vivo using ethidium-based probes. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 103, 15038-15043 (2006).
  13. Dickinson, B. C., Srikun, D., Chang, C. J. Mitochondrial-targeted fluorescent probes for reactive oxygen species. Curr. Opin. Chem. Biol. 14, 50-56 (2010).
  14. Dooley, C. T., et al. Imaging dynamic redox changes in mammalian cells with green fluorescent protein indicators. J. Biol. Chem. 279, 22284-22293 (2004).
  15. Hanson, G. T., et al. Investigating mitochondrial redox potential with redox-sensitive green fluorescent protein indicators. J. Biol. Chem. 279, 13044-13053 (2004).
  16. Belousov, V. V., et al. Genetically encoded fluorescent indicator for intracellular hydrogen peroxide. Nat. Methods. 3, 281-286 (2006).
  17. Wang, W., et al. Superoxide Flashes in Single Mitochondria. Cell. 134, 279-290 (2008).
  18. Wei-Lapierre, L., et al. Respective Contribution of Mitochondrial Superoxide and pH to Mitochondria-targeted Circularly Permuted Yellow Fluorescent Protein (mt-cpYFP) Flash Activity. J. Biol. Chem. 288, 10567-10577 (2013).
  19. Fang, H., et al. Imaging superoxide flash and metabolism-coupled mitochondrial permeability transition in living animals. Cell Res. 21, 1295-1304 (2011).
  20. Wei, L., et al. Mitochondrial superoxide flashes: metabolic biomarkers of skeletal muscle activity and disease. FASEB J. 25, 3068-3078 (2011).
  21. Sheu, S. S., Wang, W., Cheng, H., Dirksen, R. T. Superoxide flashes: illuminating new insights into cardiac ischemia/reperfusion injury. Future Cardiol. 4, 551-554 (2008).
  22. Wei, L., Dirksen, R. T. Perspectives on: SGP symposium on mitochondrial physiology and medicine: mitochondrial superoxide flashes: from discovery to new controversies. J. Gen. Physiol. 139, 425-434 (2012).
  23. Johnson, I., Spence, M. T. Z. Ch. 12.2. The Molecular Probes Handbook, A Guide to Fluorescent Probes and Labeling Technologies. , Life Technologies Corp. 510-511 (2013).
  24. Wang, X., et al. Superoxide flashes: elemental events of mitochondrial ROS signaling in the heart. J. Mol. Cell Cardiol. 52, 940-948 (2012).
  25. Li, K., et al. Superoxide flashes reveal novel properties of mitochondrial reactive oxygen species excitability in cardiomyocytes. Biophys. J. 102, 1011-1021 (2012).
  26. Bell, R. M., Mocanu, M. M., Yellon, D. M. Retrograde heart perfusion: The Langendorff technique of isolated heart perfusion. J. Mol. Cell. Cardiol. 50, 940-950 (2011).
  27. Pasdois, P., et al. Effect of diazoxide on flavoprotein oxidation and reactive oxygen species generation during ischemia-reperfusion: a study on Langendorff-perfused rat hearts using optic fibers. Am. J. Physiol. 294, H2088-H2097 (2008).
  28. Granville, D. J., et al. Reduction of ischemia and reperfusion-induced myocardial damage by cytochrome P450 inhibitors. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101, 1321-1326 (2004).
  29. Davidson, S. M., Yellon, D. M., Murphy, M. P., Duchen, M. R. Slow calcium waves and redox changes precede mitochondrial permeability transition pore opening in the intact heart during hypoxia and reoxygenation. Cardiovasc. Res. 93, 445-453 (2012).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

In vivo beeldvormingindividuele mitochondri ntime lapse beeldvormingTMRM loadinggeperfuseerd hartskeletspierfluorescentieanalysemitochondriale functie

Gerelateerde artikelen