Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

In vitro Coculture Assay om pathogene geïnduceerde neutrofiele trans-epitheliale migratie te beoordelen

17.6K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/50823

⸱

6 januari 2014

 ,  ,  , 
1Department of Pediatrics, Harvard Medical School, 2Department of Pediatric Gastroenterology, MGH for Children, 3Mucosal Immunology and Biology Research Center, Massachusetts General Hospital

In dit artikel

Samenvatting

Neutrofiele trans-epitheliale migratie als reactie op mucosale bacteriële infectie draagt bij aan epitheelletsel en klinische ziekte. Er is een in vitro model ontwikkeld dat pathogene, menselijke neutrofielen en gepolariseerde menselijke epitheelcellagen combineert die op transwellfilters zijn gekweekt om onderzoeken naar het ontrafelen van de moleculaire mechanismen die dit fenomeen orkestreren te vergemakkelijken.

Samenvatting

Mucosale oppervlakken dienen als beschermende barrières tegen pathogene organismen. Aangeboren immuunreacties worden geactiveerd bij het detecteren van pathogenen die leiden tot de infiltratie van weefsels met migrerende ontstekingscellen, voornamelijk neutrofielen. Dit proces heeft het potentieel om destructief te zijn voor weefsels als het overmatig is of in een onopgeloste toestand wordt gehouden.  Gecocultureerde in vitro modellen kunnen worden gebruikt om de unieke moleculaire mechanismen te bestuderen die betrokken zijn bij pathogene geïnduceerde neutrofiele trans-epitheliale migratie. Dit type model biedt veelzijdigheid in experimenteel ontwerp met de mogelijkheid voor gecontroleerde manipulatie van de ziekteverwekker, epitheelbarrière of neutrofiel. Pathogene infectie van het apicale oppervlak van gepolariseerde epitheliale monolagen gekweekt op permeabele transwellfilters veroorzaakt fysiologisch relevante basolaterale tot apicale transepitheelmigratie van neutrofielen die op het basolaterale oppervlak worden toegepast. Het hierin beschreven in vitro model toont de vele stappen aan die nodig zijn om neutrofiele migratie aan te tonen over een gepolariseerde longepitheelmonolayer die is geïnfecteerd met pathogene P. aeruginosa (PAO1). Zaaien en cultiveren van doorlatende transwells met menselijke afgeleide longepitheelcellen wordt beschreven, samen met isolatie van neutrofielen uit volledig menselijk bloed en cultivering van PAO1 en nietpathogene K12 E. coli (MC1000).  Het emigratieproces en de kwantitatieve analyse van met succes gemigreerde neutrofielen die zijn gemobiliseerd als reactie op pathogene infectie, worden aangetoond met representatieve gegevens, waaronder positieve en negatieve controles. Dit in vitro modelsysteem kan worden gemanipuleerd en toegepast op andere mucosale oppervlakken. Ontstekingsreacties waarbij overmatige neutrofiele infiltratie betrokken is, kunnen destructief zijn voor gastheerweefsels en kunnen optreden bij afwezigheid van pathogene infecties. Een beter begrip van de moleculaire mechanismen die neutrofiele transepitheelmigratie bevorderen door experimentele manipulatie van het in vitro coculture assay-systeem dat hierin wordt beschreven, heeft een aanzienlijk potentieel om nieuwe therapeutische doelen te identificeren voor een reeks mucosale infectieuze en inflammatoire ziekten.

Inleiding

Mucosale oppervlakken dienen als fysieke en immunologische barrières die bescherming bieden tegen externe bedreigingen die alomtegenwoordig zijn in het milieu1,2. Deze beschermende epitheelbarrière kan worden aangetast wanneer pathogene organismen binnendringen2. In het geval van een bacteriële ziekteverwekker veroorzaakt deze ontmoeting vaak een ontstekingsproces door het aangeboren immuunsysteem te activeren en een snelle mobilisatie van eerstehulpgranulocyten bekend als neutrofielen2-4te activeren . Chemotactische middelen die neutrofiele rekrutering vergemakkelijken, worden gedeeltelijk geproduceerd door de mucosale epitheelcellen die de gastheer van de beledigende ziekteverwekker2-4willen bevrijden. Overmatige of onopgeloste neutrofiele infiltratie van het mucosale epitheeloppervlak kan significante pathologie veroorzaken1,5. Dit is een gevolg van niet-specifieke weefselschade veroorzaakt door het antibacteriële neutrofielenarsenaal5-7. In dergelijke gevallen wordt de bacteriële klaringscapaciteit van neutrofielen overschaduwd door vernietiging van gastheerweefsel tijdens een infectieuze belediging.  Verstoring van de beschermende epitheliale barrièrefunctie kan leiden tot een verhoogde blootstelling van onderliggend weefsel aan micro-organismen en/of toxines, waardoor de ziektepathologie verder wordt verergerd8,9. Deze gevolgen kunnen worden waargenomen in meerdere orgaansystemen, waaronder de longen en het spijsverteringskanaal1,5. Bovendien worden niet-infectieuze ontstekingsaandoeningen zoals ernstige aanvallen van astma, chronische obstructieve longziekte (COPD), acuut respiratoir distress syndroom (ARDS) en inflammatoire darmziekte (IBD) gekenmerkt door de pathologische breuk van de mucosale epitheelbarrière door een overmatige neutrofiele respons4,5,10-12.

Het complexe proces van neutrofiele rekrutering na mucosale infectie omvat verschillende gecompartimenteerde stappen1,5,13,14. Ten eerste moeten neutrofielen uit de circulatie vertrekken via een reeks cel-naar-celinteracties die trans-endotheelmigratie vergemakkelijken1,13. Neutrofielen navigeren vervolgens door bestaande interstitiële ruimte met extracellulaire matrix1,14. Om het lumen van het geïnfecteerde slijmvlies te bereiken, moeten neutrofielen vervolgens migreren over de epitheelbarrière1,4,5. Dit ingewikkelde multistep-fenomeen wordt vaak in geaggregeerde zin onderzocht met behulp van in vivo diermodellen van infectie15. Dergelijke modellen zijn nuttig om de noodzaak vast te stellen van specifieke factoren, zoals chemokinen, adhesiemoleculen of signaleringsroutes die deelnemen aan het algehele proces, maar zijn grotendeels ontoereikend voor het oplossen van moleculaire bijdragen die van cruciaal belang zijn voor elke afzonderlijke gecompartimenteerde stap16. Coculturele in vitro systemen die trans-endotheel-, transmatrix- of transepitheelmigratie van neutrofielen modelleren, zijn in dit opzicht bijzonder nuttig geweest1,14,16,17.

Er is een robuust coculture-assaysysteem ontwikkeld voor het ontcijferen van mechanismen die verantwoordelijk zijn voor neutrofiele transepitheelmigratie als reactie op pathogene infectie18-22. Dit model omvat het infecteren van het apicale oppervlak van gepolariseerde menselijke epitheelcellagen met een bacteriële ziekteverwekker gevolgd door toepassing van vers geïsoleerde menselijke neutrofielen op het basolaterale oppervlak18-22. Neutrofielen migreren over de epitheelbarrière als reactie op epitheliale chemotactische producten die zijn uitgescheiden na pathogene infectie18,21-23. Dit modelsysteem is gebruikt met behulp van intestinale en longepitheelculturen die zijn blootgesteld aan geschikte weefselspecifieke bacteriële pathogenen en heeft nieuwe moleculaire mechanismen onthuld die waarschijnlijk belangrijk zijn voor het wervingsproces van neutrofielen tijdens mucosale infectie3,8,19,24-28. De kracht van dit in vitro coculture model is dat een reductionistische benadering de onderzoeker in staat stelt om de ziekteverwekker, epitheelbarrière en/of neutrofiel experimenteel te manipuleren in een goed gecontroleerd, zeer reproduceerbaar, vrij goedkoop systeem. Inzicht verkregen uit deze aanpak kan effectief worden gebruikt om gerichte analyse uit te voeren van gecompartimenteerde gebeurtenissen tijdens neutrofiele rekrutering met behulp van in vivo infectiemodellen22,29,30.

Dit artikel demonstreert de meerdere stappen die nodig zijn voor de succesvolle vaststelling van dit reproduceerbare model om pathogene geïnduceerde neutrofiele trans-epitheelmigratie te onderzoeken. Longepitheelbarrières geïnfecteerd met de ziekteverwekker Pseudomonas aeruginosa komen in dit artikel voor; andere weefselepithlia en pathogenen kunnen echter worden vervangen door kleine wijzigingen. Zaaien en cultiveren van gepolariseerde longepitheelcellagen op omgekeerde collageen gecoate permeabele transwellfilters wordt hierin beschreven, net als de groei van pathogene P. aeruginosa en de isolatie van neutrofielen uit volbloed. Hoe deze componenten worden gecombineerd om door pathogenen geïnduceerde neutrofiele transepitheelmigratie te observeren, wordt gepresenteerd, samen met passende positieve en negatieve controles om een reproduceerbare test vast te stellen. De veelzijdigheid van deze benadering om verschillende aspecten van pathogene geïnduceerde neutrofiele transepitheelmigratie te onderzoeken, wordt besproken met betrekking tot specifieke studies in de literatuur.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

Stappen (1-3) moeten worden uitgevoerd in een steriele omgeving onder een laminaire stromingskap.

1. Collageen coating transwells

  1. Maak een collageenoplossing van 30 μg/ml. Verdun 3 mg/ml collageenbouillon 1:100 in 60% ethanol die door een filtereenheid van 0,2 μm is gegaan.
  2. Vortex verdunde oplossing van 30 μg/ml. Opmerking: Het is niet nodig om de 3 mg/ml collageenbouillonoplossing te vortexen, omdat deze oplossing vrij stroperig is en luchtbellen kunnen worden geïntroduceerd, waardoor de nauwkeurigheid bij pipetten mogelijk afneemt.
  3. Verwijder 0,33 cm2 groeigebiedtranswells met een poriegrootte van 3 μm van de buitenverpakking en plaats de 24-putplaat met 12 transwells ondersteboven in de kap.
  4. Til de bodemplaat op en plaats opzij. Opmerking: Transwells zal nu ondersteboven rusten bovenop het deksel van de 24-put plaat
  5. Zet bunsenbrander aan. Vlamhemostase voor steriliteit en laat afkoelen.
  6. Breng met steriele hemostase transwells over naar een Petrischaal van 150 mm x 25 mm, zodat ze in de omgekeerde positie blijven. Opmerking: Zorg ervoor dat u de steriliteit van de lege 24-put plaat plus deksel behoudt om transwells te huisvesten zodra ze zijn gezaaid met epitheelcellen.
  7. Pipet 70 μl van de collageenoplossing van 30 μg/ml op het filtermembraan van elke omgekeerde transwell. Opmerking: Oppervlaktespanning moet dit volume oplossing op zijn plaats houden, omdat er geen wanden rond het filtermembraan zijn bij het openen van het oppervlak van de onderkant. Zorg ervoor dat de collageenoplossing niet langs de zijkant van de transwell druppelt en vermijd bewegende transwells tijdens de coatingprocedure.
  8. Laat het deksel van de Petrischaal minimaal 4 uur staan om ethanoloplossing te laten verdampen. Om de steriliteit tijdens dit proces te behouden, houdt u de ventilator van de kap en het ultraviolette licht aan.
  9. Nadat de transwells zijn opgedroogd, kunnen ze onmiddellijk worden gebruikt of tot een week bij kamertemperatuur worden bewaard, op voorwaarde dat de petrischaalafdekking op zijn plaats is en de steriliteit behouden blijft.

2. Passagekolf van epitheelcellen voor het zaaien van transwells

(Dit protocol beschrijft specifiek de behandeling van de longepitheelcellijn H292 voor het genereren van epitheelbarrières die op transwells worden gekweekt. Andere epitheliale cellijnen kunnen worden gebruikt met kleine aanpassingen.)

  1. Bereid het kweekmedium voor door 10% warmtegeïnactiveerd Foetale Runderserum (HI-FBS) en 1x Penicilline/Streptomycine toe te voegen aan RPMI 1640.
  2. Warme media, trypsine-EDTA (T-EDTA) en D-PBS in 37 ºC waterbad.
  3. Verwijder de T-75 kolf met cellen uit de incubator en beoordeel de samenvloeiing visueel met een omgekeerde microscoop. Opmerking: Bij gebruik van H292-cellen moeten kolven dicht bij of volledig samenvloeien.
  4. Aspireer media uit kolf. Verminder de tijd dat cellen droog zijn door de volgende oplossing in de kap met losgemaakte dop te hebben.
  5. Voeg 5 ml D-PBS toe aan de T-75 kolf en wervel. Vermijd het maken van bubbels. Verwijder PBS door aspiratie.
  6. Voeg 3 ml T-EDTA toe aan de T-75 kolf en wervel om de bodem te bedekken.
  7. Verwijder het grootste deel van de T-EDTA en laat ongeveer 0,3 ml in de T-75 kolf.
  8. Verdeel het kleine resterende volume T-EDTA over het oppervlak van de cellen en plaats het in een bevochtigde incubator onder standaard kweekomstandigheden (37 ºC, 5% CO2).
  9. Verwijder na een bepaalde tijd de kolf uit de incubator. Opmerking: Cellen moeten gemakkelijk loskomen van het oppervlak van de kolf door zachtjes op de kolf op de zijkant te tikken. Cellen moeten nu worden afgerond en zwevend wanneer ze onder de microscoop worden gevisualiseerd. De gemiddelde tijd die dit kost voor H292-cellen is 5-10 minuten.
  10. Voeg 10 ml kweekmedia toe aan de kolf om T-EDTA en resuspend cellen te neutraliseren. Trek de celoplossing in pipetpunt en werp ongeveer vijf keer uit op het oppervlak van de kolf met cellen om alle cellen opnieuw te suspenden.
  11. Breng geresuspendeerde cellen over in een buis van 15 ml voor het zaaien van transwells. Opmerking: De concentratie van op deze wijze bereide geresuspendeerde H292-cellen moet variëren tussen ongeveer 1 x 106-1,8 x 106 cellen/ml.

3. Zaaien collageen gecoate transwells met epitheelcellen

  1. Voeg 70 μl geresuspendeerde celoplossing uit de buis van 15 ml toe aan elke omgekeerde collageen gecoate transwell. Opmerking: H292-celoplossingen met een concentratiebereik tussen 1 x 106-1,8 x 106 cellen/ml leveren ongeveer 70.000-120.000 cellen/transwell op.
  2. Meng de celsuspensie door de buis regelmatig voorzichtig om te keren om te voorkomen dat cellen zich op de bodem van de buis van 15 ml nestelen terwijl ze de transwells zaaien. Opmerking: Draai cellen niet om en wees voorzichtig dat pipetpunt niet in direct contact komt met met collageen bedekt membraanfilter.
  3. Zodra alle omgekeerde transwells zijn gezaaid met epitheelcellen, vervang petrischaaldeksel en plaats voorzichtig in de weefselkweekincubator, bevochtigd, 37 ºC, 5% CO2. Zorg ervoor dat u de celsuspensie die aan het met collageen bedekte filtermembraan is toegevoegd, niet verstoort.
  4. Behoud omgekeerde transwells in de weefselkweek incubator, bevochtigd, 37 ºC, 5% CO2 's nachts. Opmerking: De vloeistofbel die cellen bevat, moet gedurende de nacht incubatie geassocieerd blijven met het doorlatende filtermembraan van de transwell. Als het filtermembraan droog wordt door verdamping van vloeistof of omdat de vloeistof langs de zijkant van de transwells druppelt, kunnen de epitheellagen niet goed groeien.
  5. Voeg de volgende dag 1 ml media toe aan de originele steriele 24-well plaat en draai elke omgekeerde transwell met behulp van een gesteriliseerde hemostase in elke put met 1 ml media.
  6. Voeg 0,2 ml media toe aan de bovenste kamer van elke transwell en keer terug naar weefselkweek incubator, bevochtigd, 37   ºC, 5% CO2.
  7. H292 omgekeerde transwells kunnen worden gebruikt vanaf 8 dagen tot 1 maand na het zaaien. Opmerking: We raden aan om minimaal 8 dagen na het zaaien van transwells te wachten om ervoor te zorgen dat de epitheliale monolagen zich volledig hebben gevormd en een functionele barrière vertonen. Men kan de H292-epitheelbarrière testen door te bepalen of de monolaag in staat is om de trans-epitheelstroom van het eiwit paardenradijsperoxidase (HRP) te beperken na toevoeging aan het basolaterale oppervlak18.

4. Voorbereiding van bacteriën voor infectie van epitheliale lagen op transwells

  1. Haal een dag voor het experiment één kolonie P. aeruginosa PAO1 uit een Pseudomonas Isolation Agar-plaat en één kolonie K12 E. coli MC1000 uit een Luria-Bertani (LB) Agar-plaat en plaats deze in afzonderlijke buizen met 3 ml LB-bouillon. LET OP: P. aeruginosa is een menselijke ziekteverwekker, bij de behandeling van dit organisme moeten standaard BSL2-veiligheidsmaatregelen worden genomen.
  2. Schud 's nachts bij 225 tpm in een omgeving van 37 ºC.
  3. Verwijder de volgende dag 1 ml uit de dichte bacterieculturen en plaats deze in 1,5 ml Eppendorf-tubes.
  4. Draai 5 minuten in microfuge op 15.800 x g en verwijder vervolgens supernatant.
  5. Bereid hanks' balanced salt solution met calcium en magnesium (HBSS+) van tevoren. Voeg 23,8 g HEPES en 97,5 g HBSS+ poeder toe aan 9,5 L gedestilleerd water. Voeg kleine hoeveelheden van 10 M NaOH toe aan de oplossing, terwijl de pH wordt gecontroleerd totdat een stabiele pH van 7,4 is bereikt. Breng het volume op tot 10 L en bewaar op 4 ºC.
  6. Resuspend elke bacteriële pellet met 1 ml HBSS+. Vortex om er zeker van te zijn dat een gelijkmatige bacteriële suspensie wordt bereikt.
  7. Draai opnieuw op 15.800 x g gedurende 5 minuten en verwijder supernatant.
  8. Resuspend de PAO1 pellet met 0,6 ml HBSS+ en de MC1000 pellet met 0,5 ml HBSS+. Vortex de bacteriële suspensus.
  9. Verdun de PAO1 en MC1000 resuspended pellets 1:100 verder in HBSS+. Voeg bijvoorbeeld 50 μl van de 0,6 ml PAO1 geresuspendeerde pellet toe aan 5 ml HBSS+. Opmerking: Met behulp van optische dichtheidsmetingen (OD) om de kweekdichtheid te bepalen, evenals de standaardkolonievormende eenheid (CFU) verdunningsplatingsmethodologie, leveren PAO1- en MC1000-oplossingen die op deze manier zijn bereid consequent tussen 3 x 107-6 x10 7 KVE/ml op. De dichtheid van een bacteriecultuur is positief gecorreleerd met de OD-meting van de cultuur bij 600 nm en deze correlatie kan worden gebruikt om de concentratie van bacteriële cellen te schatten. Om de concentratie van bacteriële cellen te bevestigen, kan de cultuur worden verdund tot een zeer lage geschatte concentratie en op een agarplaat worden geplateerd, zodat men zou verwachten dat er tussen de 30-200 bacteriële cellen op de plaat aanwezig zouden zijn. De cellen worden verspreid over de plaat en 's nachts geïncubeerd bij 37 ºC, zodat elke cel een individuele kolonie cellen vormt die groot genoeg is om zichtbaar te zijn en kolonies vervolgens kunnen worden geteld.

5. Isolatie van neutrofielen uit volbloed

  1. Zure citraat dextrose oplossing (ACD) wordt gebruikt als een antistollingsmiddel en bereid door toevoeging van 6,9 g citroenzuur, 12,5 g natriumcitraat en 10 g dextrose aan 500 ml gedestilleerd water. Zodra alle componenten zijn opgelost, wordt de ACD-oplossing gesteriliseerd door een filtereenheid van 0,2 μm te passeren. Bewaar acd-oplossing bij 4 ºC.
  2. Voeg voorafgaand aan het afnemen van bloed 5 ml ACD toe aan de spuit van 50 ml en bevestig 21 x 3/4 G vlindernaald met 12 in slang.
  3. Breng tourniquet aan, veeg de ader af met alcohol en steek de naald in. Opmerking: Elk onderzoeksprotocol met betrekking tot menselijke proefpersonen moet worden goedgekeurd door een institutionele beoordelingscommissie en schriftelijke geïnformeerde toestemming moet worden gegeven van elke bloeddonor. Experimenten uitgevoerd met behulp van dit protocol werden bijvoorbeeld goedgekeurd door de Massachusetts General Hospital Institutional Review Board en toegewezen protocol #1999-P-007782.
  4. Neem langzaam 45 ml bloed af, zodat het bloed eenmaal in de spuit met ACD wordt vermengd.
  5. Wanneer 45 ml is getrokken (50 ml totaal volume), maak dan het tourniquet los voordat u de naald verwijdert. Oefen onmiddellijk druk uit op de wond met steriel gaas wanneer de naald wordt verwijderd.
  6. Breng het bloed langzaam over langs de zijkant van een buis van 50 ml gedurende ongeveer 5-10 sec.
  7. Draai in de centrifuge op 1.000 x g met de rem 20 minuten gedeactiveerd bij kamertemperatuur. Opmerking: Een extra stap met verdunning van volbloed in PBS- en zorgvuldige overlay van verdund bloed op Ficoll-Paque voorafgaand aan centrifugeren kan worden gebruikt om een iets hoger niveau van neutrofiele zuiverheid te bereiken door de buffy coat efficiënter te scheiden van de granulocyten8. Het weglaten van deze stap dient om tijd te besparen zonder de opbrengst of zuiverheid drastisch te beïnvloeden voor deze test, en daarom geven we er de voorkeur aan om de bloedoverlay niet op ficoll-Paque-stap op te slaan.
  8. Terwijl het bloed draait, voeg je heel langzaam 1 g gelatine toe aan 50 ml verwarmde Hanks' Balanced Salt Solution zonder calcium en magnesium (HBSS(-)) om 2% gelatineoplossing te bereiden. Houd de oplossing op 37 ºC.
  9. Aspireer en gooi plasma weg uit de buis van 50 ml bloed met behulp van een glazen pipettip die is behandeld met Sigmacote.
  10. Blijf zeer voorzichtig aspireren om de buffy coat te verwijderen, die witte bloedcellen bevat, waaronder lymfocyten.
  11. Als de buffy coat langzaam wordt verwijderd, zal het witgele troebele materiaal boven de rode bloedcellaag (RBC) verdwijnen. Stop de aspiratie zodra buffy coat is verwijderd en RBC-laag kan duidelijk worden gevisualiseerd bij het bekijken van boven de buis.
  12. Probeer de RBC-laag niet te verstoren, omdat granulocyten, meestal neutrofielen, zich in de buurt van het oppervlak van de RBC-laag bevinden, maar niet zichtbaar zijn.
  13. Voeg aan een volume van 15 ml RBC-laag 30 ml warme 2% gelatineoplossing (2x volume van de RBC-laag) toe.
  14. Keer de buis voorzichtig om om te mengen en zorg ervoor dat de vorming van bubbels wordt geminimaliseerd.
  15. Incubeer   gedurende 25 minuten bij 37 ºC. Opmerking: RBC's moeten aggregeren en tot de bodem bezinken. Als alternatief voor gelatine kan dextrans met een groot molecuulgewicht worden gebruikt voor sediment-RBC's8.
  16. Breng na incubatie de lichte roodachtige oplossing van de bovenste laag die granulocyten bevat over in een nieuwe tube van 50 ml met pipet, waarbij u erop moet letten dat de vaste donkere RBC-laag tijdens de overdracht niet wordt verstoord. Eenmaal gescheiden, gooi donkere RBC-laag weg.
  17. Spin overgebracht licht roodachtige oplossing met granulocyten en sommige RBCs in centrifuge op 1.000 x g met rem geactiveerd voor 10 minuten bij kamertemperatuur om pelletcellen.
  18. Giet het supernatant voorzichtig af of aspireer het, omdat de roodachtige celkorrel die zich na centrifugeren zal vormen over het algemeen los zit.
  19. Bereid de RBC-lysisbuffer van tevoren voor en bewaar bij 4 ºC door 8,29 g ammoniumchloride (NH4Cl), 1 g natriumbicarbonaat (NaHCO3)en 0,038 g EDTA toe te voegen aan 1 L gedestilleerd water in een bekerglas. Bewaar de RBC-lysisbuffer bij 4 ºC.
  20. Resuspend en breek roodachtige celkorrel met een klein volume koude RBC-lysisbuffer. Zodra de celkorrel in oplossing is, vult u de buis tot 50 ml met RBC-lysisbuffer. Opmerking: Houd de cellen op dit punt en in de toekomst op ijs of op 4 ºC.
  21. Draai in centrifuge op 300 x g gedurende 10 minuten bij 4   ºC en giet het supernatant af of aspireer het. Opmerking: De supernatant zal enigszins roodachtig zijn en lysed RBCs bevatten. De pellet moet op dit punt geelachtig wit zijn. Als er significante RBC's in de pellet achterblijven, zoals aangegeven door een roodachtige pellet, kan stap 5.20-5.21 worden herhaald. Significante RBC's blijven in de celpellet als de roodachtige pellet uit stap 5.20 niet voldoende wordt afgebroken.
  22. Resuspend en breek witachtige pellet met een klein volume HBSS(-) en vul de buis tot 50 ml met HBSS(-). Opmerking: HBSS(-) en niet HBSS+ moeten worden gebruikt om de witachtige celkorrel te resuspenden. HBSS(-) heeft een tekort aan calcium en magnesium.
  23. Draai opnieuw in centrifuge op 300 x g gedurende 10 min bij 4   ºC.
  24. Giet het supernatant af en resuspend de pellet tot een eindvolume van 1 ml HBSS(-).
  25. Voeg 5 μl van de 1 ml celsuspensie toe aan 250 μl HBSS(-) in een Eppendorf-buis van 1,5 ml en meng voorzichtig op en neer met een pipet.
  26. Voeg 25 μl verdunde celsuspensie toe aan 25 μl 0,4% Trypan blauw.
  27. Voeg 12 μl mengsel toe aan elke kant van een standaard hemocytometer.
  28. Tel het aantal levende cellen dat de Trypan blauwe kleurstof heeft uitgesloten en aanwezig zijn in het middelste vierkant van beide zijden van de hemocytometer.
  29. Om de celconcentratie te berekenen, vermenigvuldigt u het gemiddelde van de 2 kwadraten met 100 (verdunningsfactor) en vermenigvuldigt u zich vervolgens met10 4 om het aantal cellen/ml te geven.
  30. Stel de eindconcentratie in op 5 x 107 cellen/ml. Indien groter dan 5 x 107 cellen/ml, moet u deze aanpassen door HBSS(-) toe te voegen. Als dat minder is, pellet de cellen en resuspend naar het juiste volume.
  31. Houd cellen op ijs tot ze klaar zijn voor migratietest. Opmerking: Deze cellen vertegenwoordigen de granulocytpopulatie van witte bloedcellen. De meerderheid van de granulocyten geïsoleerd uit volledig menselijk bloed zijn neutrofielen. Cellen worden op ijs gesuspendeerd in HBSS(-) gehouden tot aanvulling op de migratietest om cellen in een rustgevende toestand te houden.

6. Voorbereiding van epitheliale cellagen voor migratietest

(Deze stappen hoeven niet te worden uitgevoerd in een steriele kap.)

  1. Verwijder uit incubator 24-put plaat ondersteunende epitheellagen die zijn gekweekt aan de onderkant van transwell filter membranen voor ten minste acht dagen.
  2. Pak de rand van elke transwell vast met een hemostase, til uit de 24-put plaat en keer de transwell om over een afvalemmer om cultuurmedia uit de binnenkamer van de transwell te gooien. Dompel elke transwell in een wasbeker met HBSS+ om de binnenkamer van de transwell te vullen met HBSS+. Gooi vloeistof uit de binnenkamer in een afvalemmer.
  3. Herhaal stap 6.2 voor een tweede wasbeurt in HBSS+. Plaats na twee wasbeurten transwells in een nieuwe 24-well plaat met 1 ml HBSS+ in elke put. Opmerking: Alle wasbeurten moeten worden uitgevoerd met HBSS+ dat is opgewarmd tot 37 ºC.
  4. Observeer de bovenste kamer van elke transwell om de integriteit van de epitheelcellaag te beoordelen. Opmerking: HBSS+ mag niet in de bovenste kamer van de transwell lekken en vullen wanneer deze in de put van een 24-putplaat met 1 ml HBSS+ wordt geplaatst.
  5. Voeg na zorgvuldige observatie van elke transwell 0,2 ml HBSS+ toe aan de bovenste kamer.
  6. Plaats in incubator bij 37   ºC, 5% CO2 in een bevochtigde kamer gedurende 30-60 minuten om epitheelcellagen te equilibreren.

7. Neutrofiele trans-epitheliale migratietest

  1. Haal uit incubator 24-well plaat van gewassen transwells equilibreren in HBSS +.
  2. Pak elke transwell met een hemostase vast en gooi vloeistof er bovenop tot ver in een afvalemmer.
  3. Plaats elke transwell ondersteboven in een Petrischaal van 150 mm x 25 mm.
  4. Voeg aan zes van de omgekeerde Transwells 25 μl HBSS+ toe. Infecteer aan drie van de omgekeerde transwells met 25 μl P. aeruginosa (PAO1) verdund in HBSS+ bereid zoals beschreven in stap 4. Infecteer tot de laatste drie omgekeerde transwells met 25 μl E. coli K12 (MC1000) verdund in HBSS+ bereid zoals beschreven in stap 4. Dit is ongeveer 0,8 x 106-1,5 x 106 CFUs/epitheellaag voor elke bacteriesoort, aangezien de concentratie van de bacteriële oplossingen bereid in stap 4 ongeveer 3 x 107-6 x 107 KVE/ml is.
  5. Incubeer bij 37   ºC, 5% CO2 in een bevochtigde kamer gedurende 60 min.
  6. Bereid fMLP voor als een positieve controle op neutrofiele migratie door 5 μl 10 mM fMLP-voorraad toe te voegen aan 5 ml HBSS+ met een oplossing van 10 μM.
  7. Was transwells door te grijpen met een hemostase en terug te draaien in een 24-well wasplaat die 1 ml HBSS + in de onderste kamers bevat. Voeg 0,2 ml HBSS+ toe aan de bovenste kamers.
  8. Pak transwell vast met een hemostase en verwijder van de eerste wasplaat. Voordat u transwells in een tweede 24-well wasplaat met 1 ml HBSS+ plaatst, gooit u vloeistof uit de bovenste kamer in een afvalemmer. Voeg 0,2 ml HBSS+ toe aan de bovenkamer.
  9. Herhaal stap 7.8 nog één keer voor in totaal 3 wasbeurten. Opmerking: Alle transwells moeten worden onderworpen aan hetzelfde behandelings- en wasregime, ongeacht of ze al dan niet met bacteriën zijn geïnfecteerd, om ervoor te zorgen dat alle transwells die worden onderzocht op dezelfde manier zijn gemanipuleerd. Een infectie van 60 minuten met PAO1 of MC1000 vermindert de levensvatbaarheid niet en verandert de barrière-eigenschappen van de H292-monolaag niet, zoals beoordeeld door een toxicologische test op basis van lactaatdehydrogenase en de HRP-fluxtest, respectievelijk18,22.
  10. Bereid 24-well migratieplaat door 1 ml HBSS+ toe te voegen aan 12 putten van de 24-well plaat. Opmerking: Deze plaat kan van tevoren worden voorbereid.
  11. Gooi na de derde wasbeurt vloeistof uit de bovenste kamers van transwells in een afvalemmer met behulp van een hemostase en plaats drie van de niet-geïnfecteerde transwells in drie putten van de 24-put migratieplaat met 1 ml HBSS +, wat de negatieve controle vertegenwoordigt.
  12. Pipet 10 μl van een 10 μM oplossing van fMLP in elk van de drie putten van de 24-put migratieplaat met 1 ml HBSS+ (100 nM).
  13. Plaats drie van de niet-geïnfecteerde transwells in drie putten van de 24-put migratieplaat met 100 nM fMLP, wat een positieve controle is voor het vermogen van geïsoleerde neutrofielen om te migreren.
  14. Plaats drie met PAO1 geïnfecteerde transwells en drie met MC1000 geïnfecteerde transwells in drie putten van respectievelijk de 24-put migratieplaat met 1 ml HBSS+. Voeg 0,1 ml HBSS+ toe aan de bovenste kamer van elke transwell.
  15. Voeg bovenop de 0,1 ml HBSS+ in elke transwell voorzichtig 20 μl neutrofiele suspensie (5 x 107 cellen/ml) toe, bereid zoals beschreven in stap 5. Opmerking: Dit vertegenwoordigt ongeveer 1 x 106 neutrofielen/transwell.
  16. Incubeer bij 37 ºC, 5% CO2 in een bevochtigde kamer gedurende 2 uur om trans-epitheliale migratie van neutrofielen mogelijk te maken.
  17. Bereid een standaardcurve voor voor het bepalen van het aantal neutrofielen dat na 2 uur is gemigreerd. Voeg 40 μl neutrofielensuspensie (5 x 107 cellen/ml) toe aan 2 ml HBSS(+) en breng 1 ml over in 1 ml HBSS(+) en voer 8 keer seriële 2-voudige verdunningen uit voor in totaal 10 standaarden, variërend van ongeveer 2.000 cel/ml tot 1 x 106 cellen/ml. Voeg 1 ml HBSS(+) toe voor blanco.
  18. Til na 2 uur migratie de transwells op door met een hemostase te grijpen en tik zachtjes tegen de binnenwanden van de 24-put migratieplaat. Gooi transwells weg.
  19. Beoordeel de migratie van neutrofielen grof in de putten door putten van de 24-putmigratieplaat onder een omgekeerde microscoop te bekijken met behulp van de 10X-doelstelling (zie figuur 1 voor afbeeldingen van gemigreerde neutrofielen in elke toestand).
  20. Voeg 50 μl 10% triton X-100 toe aan elke put die wordt gebruikt in de 24-put migratieplaat, elke standaard en de blanco.
  21. Draai de 24-put migratieplaat, standaarden en blanco bij lage snelheid gedurende 20 minuten bij 4   ºC.
  22. Bereid vooraf een 1 M citraatbuffer voor. Voeg 52,5 g citroenzuur en 73,5 g natriumcitraat toe aan 400 ml gedestilleerd water in een bekerglas. Breng de pH op 4,2. Voeg gedestilleerd water toe voor de uiteindelijke oplossing van 500 ml. Bewaar de oplossing bij 4 ºC.
  23. Bereid abts substraatoplossing vers die dag. Voeg 3 ABTS tabletten (elk 10 mg) en 5 ml 1 M citraatbuffer toe aan 45 ml gedestilleerd water. Laat tabletten volledig oplossen in de oplossing. Onthoud toevoeging van 50 μl 30% waterstofperoxide totdat de ABTS-substraatoplossing nodig is (zie stap 7.27).
  24. Voeg 50 μl citraatbuffer toe aan elke put die wordt gebruikt in de 24-put migratieplaat, elke standaard en de blanco.
  25. Breng 100 μl van elk monster goed in tweevoud over op een plaat met 96 putten. Opmerking: Het is erg belangrijk om de inhoud in elk monster goed te mengen voordat u naar de 96-put plaat gaat. Pipetteer de oplossing minstens vijf keer op en neer voordat u de oplossing overzet.
  26. Breng 100 μl van elke norm en de blanco na het mengen (blanco in tweevoud) over op de 96-well plaat.
  27. Voeg 50 μl 30% waterstofperoxide toe aan de ABTS-oplossing en vortex.
  28. Voeg 100 μl ABTS-substraatoplossing toe aan elk monster op de 96-putplaat.
  29. Laat de plaat zich 5-10 minuten ontwikkelen in het donker. Opmerking: Een groene kleur moet zich ontwikkelen in bepaalde putten, correlerend met het aantal neutrofielen in elke put.
  30. Lees op golflengte van 405 nm met behulp van een microplate reader.
  31. Bereken het aantal neutrofielen dat over de epitheellaag is gemigreerd met behulp van de normen waarbij een lineaire positieve correlatie bestaat tussen het bekende aantal neutrofielen dat als norm is opgesteld en de hoeveelheid peroxidaseactiviteit gemeten door optische dichtheid bij 405 nm (zie figuren 2 en 3 voor representatieve gegevens). Opmerking: Deze methode van neutrofiele kwantificering maakt gebruik van de grote hoeveelheid peroxidaseactiviteit die neutrofielen vertonen als gevolg van myeloperoxidase-expressie. Alternatieve benaderingen voor het kwantificeren van neutrofielen kunnen worden overwogen, zoals methoden waarbij neutrofielen met radioactiviteit of fluorescentieverbindingen vooraf worden gelabeld.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

Verschillende studies hebben aangetoond dat met ziekteverwekkers geïnfecteerde epitheellagen neutrofiele transepitheelmigratie vergemakkelijken3,8,19,24-28,31,32. Dit gebeurt via een pathogene-specifieke inductie van een epitheelcel-afgeleide neutrofiele chemotactische gradiënt3,23. Bijvoorbeeld, pathogene P. aeruginosa interactie met het apicale oppervlak van longepitheelcellen zorgt ervoor dat een aanzienlijk aantal neutrofielen migreren over de epitheellaag18,22,25,26,33,34. D...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

Neutrofiele migratie over mucosale epitheeloppervlakken is een veel voorkomend kenmerk in ziektepathologie na infectie met bacteriële pathogenen3. De hierin beschreven methodologie biedt een snelle, eenvoudige aanpak om deze discrete gebeurtenis experimenteel te isoleren met behulp van een in vitro coculture assay-systeem dat een kenmerk modelleert van het ontstekingsproces dat wordt veroorzaakt door bacteriële infecties. Dit systeem werd oorspronkelijk ontwikkeld met behulp van gepolariseerde intesti...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs verklaren dat ze geen concurrerende financiële belangen hebben.

Dankbetuigingen

Dit werk werd financieel ondersteund door NIH (1 R01 AI095338-01A1).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
NCl-H292 cellenATCCCRL-1848
RPMI-1640 mediumATCC30-2001
Pseudomonas aeruginosa PAO1ATCC#47085
Escherichia coli MC1000ATCC#39531
D-PBS (1x) vloeistofInvitrogen14190-144zonder calcium en magnesium
Heat Inactivated Fetal bovien serumInvitrogen10082-14710% toegevoegd aan het kweekmedium
Penicilline-StreptomycineInvitrogen15140-122100x: 10.000 eenheden penicilline en 10.000 µg streptomycine per ml.
Trypsine-EDTA (0,05%)Invitrogen25300-06250 ml aliquoten worden bevroren bewaard bij -20 ºC.  Aliquot in gebruik kan op korte termijn worden bewaard bij 4 ºC.  
Hank's Balanced Salt Solution - HBSS(-)Invitrogen14175-079Steriele, zonder calcium en magnesium
Trypan Blauw oplossingInvitrogen15250-061.Stock = 0,4%
Collagene, RattenstaartInvitrogenA10483-01Kan ook in het laboratorium direct van de staarten van ratten worden geïsoleerd met behulp van standaardprotocollen
CitroenzuurSigma-AldrichC1909-500GComponent van 1 M citraatbuffer en zure citraat dextrose (ACD) oplossing
NatriumcitraatSigma-AldrichS4641-500GComponent van 1 M citraatbuffer
Dextrose anhydrousSigma-AldrichD8066-250GComponent van zure citraat dextrose (ACD) oplossing
AmmoniumchlorideSigma-Aldrich213330-500GComponent van rode bloedcel (RBC) lyse buffer
NatriumbicarbonaatSigma-AldrichS6014-500GComponent van rode bloedcel (RBC) lyse buffer
EDTASigma-AldrichED-100GComponent van rode bloedcel (RBC) lyse buffer
HBSS(+) poederSigma-AldrichH1387-10LBelangrijkste component van HBSS+
HEPESSigma-AldrichH3375-500GComponent van HBSS+
SigmacoteSigma-AldrichSL2-25MLVolg de instructies van de leverancier om glazen pipettenpunten te coaten
Triton X-100Sigma-AldrichT-9284
2,2'-Azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonzuur) diammoniumzout (ABTS)Sigma-AldrichA9941-50TABBelangrijkste component van ABTS substraat oplossing
30% Waterstofperoxide oplossingSigma-AldrichH1009-100MLComponent van ABTS substraat oplossing
N-Formyl-Met-Leu-Phe (fMLP of fMLF)Sigma-AldrichF-3506Een stockoplossing van 10 mM in DMSO moet worden bereid en aliquoten worden bewaard bij -20 ºC.
Gelatine Type BFisher ScientificM-12026
Pseudomonas isolatie agar Fisher ScientificDF0927-17-1Volg de instructies van de fabrikant om PIA platen te maken
Ficoll-Paque PLUS Fisher Scientific45-001-749Optioneel, kan de zuiverheid van neutrofielen verbeteren
24-well migratie plaatCorning Incorporated#3524
24-well wasplaatFalcon35-1147Kan worden hergebruikt als het in 70% ethanol wordt gedrenkt en grondig wordt gewassen voordat het opnieuw wordt gebruikt
96-well plaatFisher Scientific#12565501
Transwell Permeable Supports Corning Incorporated#3415Polycarbonaat; Diameter: 6,5 mm; Groeigebied: 0,33 cm2; Dish stijl: 24-well plaat; Poriegrootte: 3,0 µm
Petri schaalFalcon35-1013Elke Petri schaal bevat 24 omgekeerde 0,33 cm2 Transwells.  
500 ml 0,2 μm filter / kolfFisher Scientific09-740-25AOm zure citraat dextrose (ACD) oplossing te steriliseren
5-3/4 inch glas Pasteur pipetFisher Scientific13-678-20ACoat punten met Sigmacote voor gebruik
HemostatFisher Scientific13-812-14Gebogen, Gekarteld
Invertoskop Omgekeerde MicroscoopZeiss#342222
Versa-Max Microplate ReaderMolecular Devices#432789

Referenties

  1. Burns, A. R., Smith, C. W., Walker, D. C. Unique structural features that influence neutrophil emigration into the lung. Physiol. Rev. 83, 309-336 (2003).
  2. Hurley, B. P., McCormick, B. A. Intestinal epithelial defense systems protect against bacterial threats. Curr. Gastroenterol. Rep. 6, 355-361 (2004).
  3. McCormick, B. A. Bacterial-induced hepoxilin A3 secretion as a pro-inflammatory mediator. FEBS J. 274, 3513-3518 (2007).
  4. Mumy, K. L., McCormick, B. A. The role of neutrophils in the event of intestinal inflammation. Curr. Opin. Pharmacol. 9, 697-701 (2009).
  5. Chin, A. C., Parkos, C. A. Pathobiology of neutrophil transepithelial migration: implications in mediating epithelial injury. Annu. Rev. Pathol. 2, 111-143 (2007).
  6. Segel, G. B., Halterman, M. W., Lichtman, M. A. The paradox of the neutrophil's role in tissue injury. J. Leukoc. Biol. 89, 359-372 (2011).
  7. Weiss, S. J. Tissue destruction by neutrophils. N. Engl. J. Med. 320, 365-376 (1989).
  8. Hurley, B. P., Thorpe, C. M., Acheson, D. W. Shiga toxin translocation across intestinal epithelial cells is enhanced by neutrophil transmigration. Infect. Immun. 69, 6148-6155 (2001).
  9. Kohler, H., et al. Salmonella enterica serovar Typhimurium regulates intercellular junction proteins and facilitates transepithelial neutrophil and bacterial passage. Am. J. Physiol. Gastrointest. Liver Physiol. 293, 178-187 (2007).
  10. Gane, J., Stockley, R. Mechanisms of neutrophil transmigration across the vascular endothelium in COPD. Thorax. 67, 553-561 (2012).
  11. Grommes, J., Soehnlein, O. Contribution of neutrophils to acute lung injury. Mol. Med. 17, 293-307 (2011).
  12. Nakagome, K., Matsushita, S., Nagata, M. Neutrophilic inflammation in severe asthma. Int. Arch. Allergy Immunol.. 158 Suppl 1, 96-102 (2012).
  13. Choi, E. Y., Santoso, S., Chavakis, T. Mechanisms of neutrophil transendothelial migration. Front. Biosci. 14, 1596-1605 (2009).
  14. Louis, N. A., Campbell, E., Colgan, S. P. Model systems to investigate neutrophil adhesion and chemotaxis. Methods Mol. Biol. 412, 257-270 (2007).
  15. Craig, A., Mai, J., Cai, S., Jeyaseelan, S. Neutrophil recruitment to the lungs during bacterial pneumonia. Infect. Immun. 77, 568-575 (2009).
  16. Hurley, B. P., McCormick, B. A. Translating tissue culture results into animal models: the case of Salmonella typhimurium. Trends Microbiol. 11, 562-569 (2003).
  17. Lee, W. Y., Chin, A. C., Voss, S., Parkos, C. A. In vitro neutrophil transepithelial migration. Methods Mol. Biol. 341, 205-215 (2006).
  18. Hurley, B. P., Siccardi, D., Mrsny, R. J., McCormick, B. A. Polymorphonuclear cell transmigration induced by Pseudomonas aeruginosa requires the eicosanoid hepoxilin A3. J. Immunol. 173, 5712-5720 (2004).
  19. McCormick, B. A., Colgan, S. P., Delp-Archer, C., Miller, S. I., Madara, J. L. Salmonella typhimurium attachment to human intestinal epithelial monolayers: transcellular signalling to subepithelial neutrophils. J. Cell Biol. 123, 895-907 (1993).
  20. McCormick, B. A., et al. Surface attachment of Salmonella typhimurium to intestinal epithelia imprints the subepithelial matrix with gradients chemotactic for neutrophils. J. Cell Biol. 131, 1599-1608 (1995).
  21. Mrsny, R. J., et al. Identification of hepoxilin A3 in inflammatory events: a required role in neutrophil migration across intestinal epithelia. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101, 7421-7426 (2004).
  22. Tamang, D. L., et al. Hepoxilin A(3) facilitates neutrophilic breach of lipoxygenase-expressing airway epithelial barriers. J. Immunol. 189, 4960-4969 (2012).
  23. McCormick, B. A., Parkos, C. A., Colgan, S. P., Carnes, D. K., Madara, J. L. Apical secretion of a pathogen-elicited epithelial chemoattractant activity in response to surface colonization of intestinal epithelia by Salmonella typhimurium. J. Immunol. 160, 455-466 (1998).
  24. Boll, E. J., et al. Enteroaggregative Escherichia coli promotes transepithelial migration of neutrophils through a conserved 12-lipoxygenase pathway. Cell Microbiol. 14, 120-132 (2012).
  25. Hurley, B. P., et al. The two-component sensor response regulator RoxS/RoxR plays a role in Pseudomonas aeruginosa interactions with airway epithelial cells. Microbes Infect. 12, 190-198 (2010).
  26. Hurley, B. P., Williams, N. L., McCormick, B. A. Involvement of phospholipase A2 in Pseudomonas aeruginosa-mediated PMN transepithelial migration. Am. J. Physiol. Lung Cell Mol. Physiol. 290, L703-L709 (2006).
  27. McCormick, B. A., Siber, A. M., Maurelli, A. T. Requirement of the Shigella flexneri virulence plasmid in the ability to induce trafficking of neutrophils across polarized monolayers of the intestinal epithelium. Infect. Immun. 66, 4237-4243 (1998).
  28. Savkovic, S. D., Koutsouris, A., Hecht, G. Attachment of a noninvasive enteric pathogen, enteropathogenic Escherichia coli, to cultured human intestinal epithelial monolayers induces transmigration of neutrophils. Infect. Immun. 64, 4480-4487 (1996).
  29. Agbor, T. A., Demma, Z. C., Mumy, K. L., Bien, J. D., McCormick, B. A. The ERM protein, ezrin, regulates neutrophil transmigration by modulating the apical localization of MRP2 in response to the SipA effector protein during Salmonella typhimurium infection. Cell Microbiol. 13, 2007-2021 (2011).
  30. Pazos, M., et al. Multidrug resistance-associated transporter 2 regulates mucosal inflammation by facilitating the synthesis of hepoxilin A3. J. Immunol. 181, 8044-8052 (2008).
  31. Agace, W. W., Patarroyo, M., Svensson, M., Carlemalm, E., Svanborg, C. Escherichia coli induces transuroepithelial neutrophil migration by an intercellular adhesion molecule-1-dependent mechanism. Infect. Immun. 63, 4054-4062 (1995).
  32. Bhowmick, R., et al. Systemic Disease during Streptococcus pneumoniae Acute Lung Infection Requires 12-Lipoxygenase-Dependent Inflammation. J. Immunol. , (2013).
  33. Hurley, B. P., Pirzai, W., Mumy, K. L., Gronert, K., McCormick, B. A. Selective eicosanoid-generating capacity of cytoplasmic phospholipase A2 in Pseudomonas aeruginosa-infected epithelial cells. Am. J. Physiol. Lung Cell Mol. Physiol. 300, 286-294 (2011).
  34. Hurley, B. P., Sin, A., McCormick, B. A. Adhesion molecules involved in hepoxilin A3-mediated neutrophil transepithelial migration. Clin. Exp. Immunol. 151, 297-305 (2008).
  35. Frank, D. W. Research Topic on Pseudomonas aeruginosa, Biology, Genetics, and Host-Pathogen Interactions. Front. Microbiol. 3, 20 (2012).
  36. Lyczak, J. B., Cannon, C. L., Pier, G. B. Lung infections associated with cystic fibrosis. Clin. Microbiol. Rev. 15, 194-222 (2002).
  37. Bucior, I., Mostov, K., Engel, J. N. Pseudomonas aeruginosa-mediated damage requires distinct receptors at the apical and basolateral surfaces of the polarized epithelium. Infect. Immun. 78, 939-953 (2010).
  38. Kierbel, A., et al. Pseudomonas aeruginosa exploits a PIP3-dependent pathway to transform apical into basolateral membrane. J. Cell Biol. 177, 21-27 (2007).
  39. Lee, C. A., et al. A secreted Salmonella protein induces a proinflammatory response in epithelial cells, which promotes neutrophil migration. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 97, 12283-12288 (2000).
  40. Zurawski, D. V., Mumy, K. L., Faherty, C. S., McCormick, B. A., Maurelli, A. T. Shigella flexneri type III secretion system effectors OspB and OspF target the nucleus to downregulate the host inflammatory response via interactions with retinoblastoma protein. Mol. Microbiol. 71, 350-368 (2009).
  41. Brazil, J. C., et al. Neutrophil migration across intestinal epithelium: evidence for a role of CD44 in regulating detachment of migrating cells from the luminal surface. J. Immunol. 185, 7026-7036 (2010).
  42. Lawrence, D. W., et al. Antiadhesive role of apical decay-accelerating factor (CD55) in human neutrophil transmigration across mucosal epithelia. J. Exp. Med. 198, 999-1010 (2003).
  43. Hodges, K., Hecht, G. Interspecies communication in the gut, from bacterial delivery to host-cell response. J. Physiol. 590, 433-440 (2012).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Tags

Pathogeen-geïnduceerde migratieinfectie van epitheliale monolaagTranswell-filtersysteemisolatie van neutrofielenPseudomonas aeruginosa PAO1myeloperoxidase-activiteitcollageen-coatingsprocedureHank's Plus-buffer
In vitro Coculture Assay om pathogene geïnduceerde neutrofiele trans-epitheliale migratie te beoordelen
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan de bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleidsoverzicht

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.