De Slice kweekmethode voor Na Ontwikkeling van Tooth Germs In explantaatkweek

Samenvatting

Hier hebben we detail een methode om cultuur tand ziektekiemen in onderkaak plakjes met een tissue chopper. Deze methode maakt het mogelijk unieke toegang tot de tand tijdens de ontwikkeling, het verstrekken van uitstekende gelegenheid voor manipulatie en lineage tracing, niet beschikbaar gebruik van meer traditionele kweekmethoden.

Samenvatting

Explantaatkweek staat manipulatie van het ontwikkelen van organen op specifieke tijdstippen en is daarom een ​​belangrijke methode voor het ontwikkelings bioloog. Voor veel organen is moeilijk toegankelijk ontwikkeling weefsel controle tijdens het ex vivo kweken mogelijk. De slice cultuur methode maakt het mogelijk de toegang tot weefsel zodat morfogenetische bewegingen kunnen worden gevolgd en specifieke celpopulaties kan worden gericht voor manipulatie of lineage tracing.

In dit artikel beschrijven we een methode slice cultuur die zeer succesvol voor de cultuur van de tand ziektekiemen in een aantal soorten is geweest. De methode biedt een uitstekende toegang tot de tand kiemen, die zich ontwikkelen met een vergelijkbaar percentage met dat waargenomen in vivo, omringd door de andere kaak weefsels. Dit maakt weefsel interacties tussen de tand en het omringende weefsel te controleren. Hoewel dit document richt zich op de tanden kiemen kan hetzelfde protocol worden toegepast om de ontwikkeling van een doorlooptandere organen, zoals speekselklieren, Meckel's kraakbeen, nasale klieren, tong en oren.

Inleiding

Bij een aantal experimenten is het belangrijk om te kunnen cultuur weefsel ex vivo ontwikkeling te volgen. Cultuur ontwikkelen weefsel worden bereikt in bepaalde perioden van ontwikkeling en staat manipulatie van genen door de toevoeging van elementen aan het kweekmedium, of beladen kralen, en door middel van transfectie en elektroporatie ^1. Voor veel experimenten is het belangrijk om het weefsel te visualiseren als het groeit, bijvoorbeeld om het lot van afstammings gemerkte cellen volgen het weefsel ondergaat morfogenese. Dit kan bijzonder problematisch zijn voor weefsels die diep in het embryo ontwikkelt, die niet duidelijk wanneer een blok van weefsel van het embryo gekweekt. Tanden zijn goede voorbeelden van deze, als ze zich ontwikkelen in de onderkaak, bovenkaak en frontaal nasale proces. Wanneer de gehele onderkaak wordt gekweekt de oppervlakkige structuren van de tand kan worden bekeken, maar veranderingen in morfologie kunnen alleen worden geanalyseerd na het snijden van vaste weefsels ^{2. We hebben een live-slice cultuur techniek waardoor we tandkiem ontwikkeling te volgen en het verschaffen van toegang tot de verschillende delen van de tand tijdens de ontwikkeling aangepast. De techniek culturen de tandkiem plakjes op de gas-vloeistof-interface, met behulp van een gemodificeerde Trowell methode 3. Deze slice culturen zijn zeer nuttig direct na morfogenese van de tand, en waarbij geslacht traceren van afzonderlijke onderdelen, zoals het glazuur knoop en dentale papil en follikel 1,4-7. De techniek is niet beperkt tot muizenembryo's en met succes gebruikt om levende cultuur plakjes varkens en slang tandweefsel 8,9. Naast het voordeel van de mogelijkheid om tandontwikkeling visualiseren, de plak werkwijze heeft ook het voordeel dat de dunne plakjes weefsel van het medium en lucht uit de incubator toegang tot voedingsstoffen toegenomen. Dit resulteert in een betere groei van de tand kiemen, die de ontwikkeling passen in vivo, en tonen Invasion van endotheelcellen in de papil 7. Daarentegen tand kiemen geheel onderkaak culturen ontwikkelen langzamer dan in vivo en het midden van de kweek vaak necrotisch langdurige culturen. In slice cultuur, de tand ontwikkelt in een deel van de kaak, en zijn interactie met de omringende ontwikkelen bot en ander weefsel kunnen worden bewaakt. In onze werkwijze het weefsel gesneden meteen na dissectie zonder de noodzaak voor inbedding in een dragermedium 10,11 en geen behoefte aan een systeem om het weefsel hechten aan het hakblok. De methode is daarom niet-invasieve en snel, waardoor vele onderkaken worden doorgesneden in een sessie.}

Protocol

1. Instellen

1. Slijp de dissectie-instrumenten (met behulp van een slijpsteen gesmeerd met minerale olie) en steriliseren vóór gebruik op orgelcultuur met behulp van een 70% ethanol spray en droge warmte sterilisatie. Slijp de dissectie naalden met behulp van elektrolyse in 2 M natriumhydroxide met een 12 V voeding.
2. Bereid het kweekmedium voor de dissectie en kweek van embryonale organen, bestaande uit geavanceerde Dulbecco's Modified Eagle Medium F12 (DMEM F12) aangevuld met 1% GlutaMAX en 1% penicilline-streptomycine.

2. Embryo Dissection

1. Cull een getimede gepaard zwangere vrouw met behulp van een schema een methode goedgekeurd door het ministerie van Binnenlandse Zaken of ander bestuursorgaan. Ontleden weg de huid rond de onderbuik, en opengesneden de buik met een schaar. Zoek de twee baarmoederhoorns, die met elkaar te verbinden op de lagere middellijn.
2. Ontleden de baarmoeder en in een buis gevuld met medium op ijs. When op het ijs, kan het weefsel worden gelaten voor meerdere uren.
3. Verwijder de baarmoeder en in een petrischaal in medium onder de microscoop. Waar mogelijk embryo dissecties in een laminaire stroming kap worden uitgevoerd om besmetting te minimaliseren.
4. Ontleden de embryo's uit de baarmoeder en hen bevrijden van hun extra-embryonale weefsels.
5. Onthoofden de embryo's met behulp van een wolfraam naald en breng de hoofden in een verse schotel van medium.
6. Isoleer de kaken van de koppen door een naald in de mondholte en doorsnijden naar de achterkant van het hoofd (Figuren 1A en 1B). Geïsoleerde kaken kan tijdelijk worden opgeslagen in medium op ijs tijdens het wachten voor het hakken.
7. Voor gehele onderkaak plakjes stadia E11.5-E15.5 zijn ideaal voor tandkiem cultuur. Na E15.5 de ontwikkelende bot in de onderkaak is te hard voor het hakken. Tand plakken kan nog steeds worden gemaakt, maar het bot (dentary en de vorming van alveolaire bot) moet eerst worden verwijderd metdissectie voordat hakken ^9. Verwijder bot voorzichtig met wolfraam naalden en pincet.

3. Embryo Snijden

1. Bereid de onderkaak weefsel plakjes met behulp van een standaard tafel weefsel chopper (figuur 1C). Gebruik een nieuw blad na ongeveer 200 onderkaken, en zorg ervoor dat het gelijk ligt met de montageschijf bij het vallen.
2. Maak de montageschijf en dozerblad met 70% ethanol voor gebruik. Voorzichtigheid is geboden bij gebruik van de machine, zoals het blad is zeer scherp.
3. Stel de chopper op een snij meetbereik van 200-400 micrometer overeenkomstig de leeftijd van het monster, en afhankelijk of het geheel tandkiem vereist. Zet het mes werking op maximum.
4. Transfer van een onderkaak om de plastic montage schijf met behulp van een pipet of tang. Schik de onderkaak op de schijf maken het zeker de oriëntatie is nog steeds duidelijk. De ontwikkeling tong kan worden gebruikt als een nuttige landmark voor het bepalen oriëntatie. Voor kiezen gebruik afRontal / dwarsrichting (zie vlak van het hakken in Figuur 1B), terwijl voor snijtanden gebruik een sagittale slice door de onderkaak naar de verschillende oriëntatie van deze tanden reflecteren als ze groeien (zie vlak van het hakken in figuur 2A).
5. Verwijder het overtollige medium uit de hele weefsel met behulp van filtreerpapier om enigszins droog de onderkaak op de montageschijf.
6. Direct na het drogen, plaats de schijf op de ronde roestvrijstalen tafel van de chopper. Zet het apparaat aan en druk op start. De tabel doorloopt automatisch van links naar rechts terwijl tegelijkertijd de snij arm die het blad omhoog en zette op tot 200 slagen / min.
7. Schakel de machine uit zodra het weefsel volledig is gesneden. Zorg ervoor dat het mes arm is in de hoogste stand en verwijder de disc. Steek geen vingers onder het mes arm of laat de machine onbeheerd achter als het hakken.
8. Neem de montageschijf en voeg onmiddellijk medium to de plakjes op de schijf, om uitdroging te voorkomen. Voorzichtig los gesneden weefsel van de bodem van de schijf met een wolfraam naald en vervolgens pipet in een kleine petrischaal drager (figuur 2A).
9. Scheid de plakjes met behulp van een naald en selecteer vervolgens het weefsel plakjes met het weefsel van belang onder een stereomicroscoop (figuren 1D, 1E, en 2B). Plaats geselecteerde segmenten in verse cultuur gerechten met medium.

4. Slice Cultuur

1. Bereid centrale putjes orgaan kweekschalen vinden die cultuur door toevoeging van ongeveer 2 ml geautoclaveerd water om de buitenste goed om uitdroging te voorkomen, en het positioneren van een metalen rooster in het midden van de schaal (Figuren 3A en 3B).
2. Bereid metalen roosters door te snijden stroken ongeveer 4 cm x 1,5 cm van platen van roestvrij staal gaas. Gebruik een perforator om een ​​gat in het midden maken en buigde zijkanten om een ​​gespreid einde te maken. Het rooster moet vlak sluiten in de centrale put, die evenwijdig is aan de bodem van de schaal (Figuren 3A en 3B). Autoclaaf de roosters te steriliseren voor gebruik.
3. Snijd een stuk transparante polyethyleentereftalaat (PET) membraan (poriegrootte 0,4 pm) groot genoeg is om de opening in het rooster bestrijken. Leg de gesneden membraan in de schaal met de geselecteerde slice.
4. Plaats de slice op de top van het membraan en dan til het membraan uit het medium, met slice afgevlakt in het centrum.
5. Plaats het filter op het rooster over het cirkelvormige gat in het midden en voeg ongeveer 1 ml kweekmedium de put, tot het niveau van het membraan.
6. Voor manipulaties eiwitten of kleine molecule inhibitoren toevoegen aan het medium (bijvoorbeeld ^8).
7. Fotografeer de slice voor een record van morfologie op dag 0 van de cultuur.
8. Leg de schalen in een vochtige atmosfeer van 5% CO _{2 bij 37 ° C in een incubator.}
9. Fotografeer de culturen regelmatig voor gemiddeld 7 dagen. Verander het kweekmedium elke 48-72 uur. Voor fotografie van de plakjes met een lichtbron van onderaf (Figuren 2C-E).

5. Lineage Tracing

Als lineage tracing nodig is, kan lipofiele kleurstoffen zoals DII of DiO worden geïnjecteerd in de tandkiem vóór stap 4, slice cultuur.

1. Trek glazen capillair naalden met behulp van een naald trekker.
2. Breek de punt van de naald met behulp van pincet en plaats punt naar beneden in de kleurstof oplossing. Laat enkele minuten terwijl de kleurstof vult de tip door capillaire werking.
3. Plaats de gevulde naald in een houder en bevestig via slang aan een injector of mond afzuiger.
4. Plaats de punt van de naald in het kweekmedium het gebied van het segment zal worden geëtiketteerd raken. Solliciteer luchtdruk om een ​​kleine hoeveelheid kleurstof verdringen uit de naald eend op het weefsel.
5. Verwijder de naald en controleer etikettering onder fluorescentie.
6. Succes bestempeld plakjes kan worden overgedragen aan filters en gekweekt zoals beschreven in stap 4.

Resultaten

Om de beweging van de eerste molaire tand follikel volgen, werden 250 urn frontale plakjes genomen via een onderkaak met de hierboven beschreven werkwijze. De tandheelkundige follikel is de laag van mesenchym dat de buitenste glazuur epitheel (OEE) van de ontwikkelende tand omringt, en is eerder getoond deelnemen aan de vorming van weefsel van het parodontium ^6. Onderkaken werden ontleed op E14.5, de dop stadium van tandontwikkeling. In het segment was de omtrek van de dentale epitheel helder en condensatie d...

Discussie

Deze methode van tand cultuur heeft het voordeel dat de toegang tot de tandkiem uitstekend, waardoor nauwkeurige lineage tracing en plaatsing van parels in het epitheel of de mesenchym. Gedefinieerde gebieden van de ontwikkeling van tandkiem kan dus specifiek worden gericht. Tijdens kweek de veranderende morfologie van de tandkiem te volgen, en het effect van manipulaties snel beoordeeld.

De werkwijze is echter alleen geschikt voor kleine tand kiemen voor aanzienlijke vorming van harde weefs...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Ethanol	VWR	101077Y	100% ethanol werd verdund in gedestilleerd H2O tot 70%.
DMEM F12	Gibco	12634-010	Advanced Dulbecco's Modified Eagle Medium F12
GlutaMAX	Gibco	35050-061
Penicillin-streptomycin	Sigma	P0781
DiI (Molecular probes)	Vybrant	V-22885	Cel-labeling oplossing
	Invitrogen		Cel tracker CM-DiI, C-7000
DiO (Molecular probes)	Vybrant	V22886
Geminator 500	Thomas	Thomas No. 3885A20	Droogte-warmte sterilisatie
McIlwain weefselsnijder	Ted Pella, Inc.	10180	Standaard tafel
Orgaancultuurschaal (Center-Well Orgaan Cultuur Schaal)	Falcon	353037
Membrans (Cel Cultuur Inserts, 0.4 μm poriegrootte)	BD Falcon	353090	PET track-etched membraan, 6-well formaat
Metalen roosters (Roestvrij staal - AISI 304 - Mesh)	Goodfellow	FE228710	(Fe/Cr18/Ni10)
AutoFlow Direct Heat CO2 Incubator	Nuaire	NU-5500
Picospritzer III	Intracel Ltd	051-0500-900 0-100 psi	Single channel picospritzer III
Glas capillair met filament 1 mm	WPI	TW100F-4
Wolfraamdraad 0.1 mm	Goodfellow	W005138
Wolfraamdraad 0.38 mm	Goodfellow	W005155
Aspiratorbuizen	Sigma	A5177	Gebruikt voor mond aspiratie lijntracers