Decellularisatie van hele organen produceert natuurlijke biologische scaffolds die kunnen worden gebruikt voor regeneratieve geneeskunde. Er wordt een beschrijving gepresenteerd van een niet-menselijke primaatmodel van longregeneratie waarbij hele longen worden gedecellulariseerd en vervolgens worden gezaaid met volwassen stamcellen en endotheelcellen in een bioreactor die vasculaire circulatie en vloeibare media-ventilatie vergemakkelijkt.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Niet-menselijke primaat longdecellurisatie en recellerisatie met behulp van een gespecialiseerde bioreactor voor grote organen
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Er zijn onvoldoende longen beschikbaar om te voldoen aan de huidige en toekomstige behoeften voor orgaantransplantatie. Biokunstmatige weefselregeneratie is een aantrekkelijke alternatief voor klassieke orgaantransplantatie. Deze technologie gebruikt de natuurlijke biologische extracellulaire matrix (ECM) van een orgaan als een schaal waarop autologe of stam-/voorlopercellen kunnen worden gezaaid en gekweekt op een manier die regeneratie van het oorspronkelijke weefsel vergemakkelijkt. De natuurlijke ECM wordt geïsoleerd door een proces dat decellularisatie wordt genoemd. Decellularisatie wordt bereikt door weefsels te behandelen met een reeks detergenten, zouten en enzymen om effectieve verwijdering van cellulair materiaal te bereiken terwijl de ECM intact blijft. Studies die gebruik maken van decellularisatie en daaropvolgende recellering van knaagdierlongen toonden marginale successen in het genereren van longachtig weefsel dat in staat is tot gasuitwisseling in vivo. Hoewel ze essentieel bewijs van concept bieden, zijn knaagdiermodellen niet direct toepasbaar voor gebruik bij mensen. Niet-menselijke primaten (NHP) bieden een geschikter model om het gebruik van biokunstmatige orgaanproductie voor eventueel klinisch gebruik te onderzoeken.
De protocollen voor het bereiken van volledige decellularisatie van longen verkregen van de NHP rhesus-makake worden gepresenteerd. De resulterende acellulaire longen kunnen worden gezaaid met een verscheidenheid aan cellen, waaronder mesenchymale stamcellen en endotheelcellen. Het manuscript beschrijft ook de ontwikkeling van een bioreactorsysteem waarin celgezaaide makakenlongen kunnen worden gekweekt onder omstandigheden van mechanische rek en spanning die worden geboden door negatieve drukventilatie, evenals pulsatiele perfusie door de bloedvaten; deze krachten zijn bekend om differentiatie langs respectievelijk de pulmonaire en endotheel lijnen te leiden. Representatieve resultaten van decellularisatie en celzaaien worden verstrekt.
Inleiding
Bio-engineeren van weefsels en organen is een aantrekkelijke aanvulling op het gebied van regeneratieve geneeskunde. Het creëren van 'in het laboratorium gekweekte' organen die geschikt zijn voor transplantatie bij patiënten om de functionaliteit van zieke organen te vervangen, is zeer wenselijk om te voldoen aan de huidige en toekomstige vraag naar transplantatiebehoeften. De principes van weefsel engineering draaien om het zaaien van gewenste celtypen, of voorlopers daarvan, in een scaffold die de vorm van het geëngineerde weefsel ondersteunt, terwijl de geschikte groeifactoren en kweekcondities worden geleverd die nodig zijn om ontwikkelings- of regeneratieve processen na te bootsen. Hoewel synthetische scaffolds zijn gebruikt voor weefsel engineering, kan de natuurlijke extracellulaire matrix (ECM) de beste bron zijn van orgaanspecifieke scaffolds voor dit doel. Hele-orgaan decellularisatie is een proces dat het verwijderen van cellen mogelijk maakt terwijl de chemische en structurele aspecten van de natieve ECM intact blijven. De resulterende acellulaire matrix scaffold kan worden gebruikt als een platform waarop regeneratieve cellen kunnen worden gezaaid en gekweekt in vitro1,2.
Er zijn verschillende knaagdiermodellen van longdecellularisatie en daaropvolgende recellularisatie ontwikkeld om de haalbaarheid van deze technologie te bestuderen3-6. Hoewel ze essentieel bewijs van concept bieden, zijn knaagdiermodellen niet direct toepasbaar op menselijke klinische behoeften. Een recente studie wees erop dat genomische reacties op traumatische verwondingen (en gerelateerde ontstekingen) niet goed correleren tussen muizen en mensen; deze bevindingen roepen vragen op over de geldigheid van het gebruik van muizen als modellen voor dergelijke complexe biochemische processen bij mensen7. Non-menselijke primaten (NHP) modellen bieden het voordeel dat ze de biologie van de mens op genomisch, anatomisch en fysiologisch niveau nauwgezet lijken en flexibelere manipulatie toestaan voor betere extrapolatie naar menselijk gebruik. De rhesus makaak is gebruikt in een verscheidenheid aan preklinische toepassingen en is een uitstekend model om weefsel engineering te bestuderen8-11. We beschreven onlangs de succesvolle decellularisatie van rhesus makaak (Macacca mulatta) longen met behulp van een procedure die minimale impact heeft op de long ECM12. Longdecellularisatie wordt bereikt door het weefsel opeenvolgend te behandelen met vier decellularisatie oplossingen bestaande uit detergenten, zouten en enzymen met tussenliggende wassingen met gedeïoniseerd water (dH2O) en PBS. We hebben deze procedure geoptimaliseerd door een protocol te wijzigen dat oorspronkelijk werd beschreven door Price et al.4 Een verscheidenheid aan histologische en eiwit-analytische technieken werden gebruikt om de componenten van de resulterende acellulaire matrices te karakteriseren in verhouding tot inheemse makaak longen.
In dit rapport demonstreren we een gedetailleerd protocol voor de decellularisatie van non-menselijke primaten longen en de recellularisatie van de resulterende acellulaire long scaffolds in een groot-orgaan bioreactor die oorspronkelijk werd gedemonstreerd door Calle et al.13 in JoVE. Door hun oorspronkelijke protocol aan te passen om te voldoen aan de grootte, ventilatie en perfusievereisten voor longen van grote dieren, werd de technologie met succes verplaatst van het knaagdiermodel naar het rhesus makaak model. Alle studies gepresenteerd in dit rapport werden uitgevoerd in overeenstemming met de beleidsregels van het Institutioneel Bioveiligheidscomité (IBC) die op het Tulane National Primate Research Center van kracht zijn. Demonstratie van deze techniek is essentieel omdat identificatie van anatomische structuren en fysieke manipulatie van grotere organen soms moeilijk is zonder de stappen van het protocol te visualiseren. De studies die mogelijk zijn gemaakt door deze methoden, vormen een basis voor essentiële preklinische studies in gedecellulariseerde rhesus makaak longen waarin recellularisatie met rhesus mesenchymale lijn stamcellen en rhesus microvasculaire endotheelcellen kan worden beoordeeld. Onze versie van deze bioreactor simuleert de ontwikkelingsomgeving en past krachten van mechanische stretch en strain toe in longen van grote dieren en maakt de onderzoek naar longrecellularisatie mogelijk onder omstandigheden die bekend staan om de long- en endotheelontwikkeling te vergemakkelijken13-15.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
1. Decellularisatie van het hele longorgaan van de makaak
- Bereiding van oplossingen
- Autoclaveer 10-15 L gedeïoniseerd water (dH2O) in flessen van 1-2 L.
- Bereid "Triton-oplossing" (0,1% Triton X-100 in dH2O) door 1 ml Triton X-100 te mengen in 999 ml dH2O terwijl u roert op een magnetische roerder. Filter de oplossing door een 0,22 µm filterapparaat. Bewaar bij kamertemperatuur.
- Bereid "SDC-oplossing" (2% SDC in dH2O) door langzaam 20 g natriumdeoxycholaat (SDC) toe te voegen aan ~900 ml dH2O terwijl u roert. Zodra SDC is opgelost, breng de oplossing over naar een gemeten cilinder en breng het volume aan tot 1 ml met dH2O. Filter de oplossing door een 0,22 µm filterapparaat. Bewaar bij kamertemperatuur.
- Bereid "NaCl-oplossing" door 58 g NaCl toe te voegen aan ~900 ml dH2O en te roeren tot volledige oplossing. Voeg dH2O toe tot een eindvolume van 1 L, filter en bewaar bij kamertemperatuur.
- Organvoorbereiding
- Er moet uiterst voorzichtig worden gehandeld om besmettelijke blootstellingsincidenten te voorkomen bij het werken met makaaktissues. Draag de volgende persoonlijke beschermingsmiddelen (PBM's) voordat u tijdens het hanteren van niet-menselijke primatentissues: chirurgisch masker, gezichtsschild, chirurgische handschoenen, wegwerpjas en een tweede laag chirurgische handschoenen.
- Verzamel intacte hart-longblokken van dierlijke necropsie in PBS met 50 U/ml heparine om coagulatie van extern bloed te voorkomen.
- Met de longen plat in een dissectief schotel, canuleer de pulmonale slagader met behulp van een vrouwelijk Luer-connector met een geschikte barb. Zet de canule vast met een met alcohol gesteriliseerde kabelbinder.
- Schuif een steriele kabelbinder om de luchtpijp, voer een vrouwelijke Luer-connector van 0,250 inch in de tracheale opening in en zet de kabelbinder vast om de barb van de connector om de luchtpijp op zijn plaats te houden rond de barb.
- Verwijder opgesloten lucht uit de longen door PBS met 30 U/ml heparine en 5 µg/ml natriumnitroprusside (SNP) toe te dienen. Laat de oplossing door natuurlijke terugtrekking worden weggeslingerd en herhaal de instillatie twee keer. Na de derde instillatie, dek de tracheale Luer-canule af met een Luer-plug om de oplossing in de longen vast te houden.
- Snijd de apex van het hart af en irrigeer de interne ventrikels met PBS-heparine-SNP om restbloed te verwijderen. Laceraat beide atria om drainage van de pulmonaire circuit tijdens perfusie te vergemakkelijken.
- Dompel het hart-longblok onder in dH2O. Vul een 60 ml spuit met de PBS-heparine-SNP-oplossing. Dompel de arteriële canule onder met behulp van een pincet zodat alle luchtbellen ontsnappen uit de vasculaire opening. Bevestig de spuit en verwijder voorzichtig de plunjer en laat de vloeistof in de vaten stromen.
- Verwijder de plug van de tracheale canule en laat de vloeistof in de luchtwegen door natuurlijke terugtrekking worden weggeslingerd. Blijf PBS-heparine-SNP-oplossing toevoegen aan de spuit die is verbonden met de vasculaire canule om ~15-20 cm H2O-druk boven de slagader te handhaven. Continueer de perfusie totdat zo veel mogelijk bloed is verwijderd uit het pulmonaire vaatstelsel.
- Decellularisatie
- Dag 1: Dompel het hart-longblok onder in dH2O. Inflateer en perfuseer de long met dH2O met behulp van 60 ml spuiten die zijn bevestigd aan de ondergedompelde trachea- en arteriële canule. Herhaal de wasbeurten van de luchtwegen en vaten met dH2O nog 4x voor een totaal van vijf spoelingen.
- Verwijder de longen uit water en dompel de blok onder in Triton-oplossing. Inflateer en perfuseer de longen met Triton-oplossing zoals eerder. Herhaal de instillatie een tweede keer en incubeer de ondergedompelde organen overnacht bij 4 °C in Triton-oplossing.
- DAG 2: Na overnachtelijke incubatie, verwijder de longblok uit Triton-oplossing, was extern met dH2O en dompel de blok vervolgens onder in verse dH2O. Herhaal de dH2O-wasbeurten 5x zoals in stap 1.3.1.
- Verwijder de longen uit dH2O en dompel ze onder in SDC-oplossing. Inflateer en perfuseer met SDC-oplossing op dezelfde manier als in stap 1.3.2. Incubeer ondergedompeld in SDC-oplossing overnacht bij 4 °C.
- DAG 3: Was het weefsel opnieuw met dH2O zoals in 1.3.1.
- Verwijder het weefsel uit dH2O en dompel het onder in NaCl-oplossing. Inflateer en perfuseer met NaCl-oplossing op dezelfde manier als in stap 1.3.2. Incubeer ondergedompeld in NaCl-oplossing gedurende 1 uur bij kamertemperatuur.
- Was de longen schoon van NaCl-oplossing met dH2O zoals in stap 1.3.1.
- Bereid verse "DNase-
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
De hieronder weergegeven resultaten zijn afkomstig van afzonderlijke experimenten waarbij respectievelijk de luchtweg- of vasculaire compartimenten werden gezaaid met mesenchymale stamcellen afkomstig uit het beenmerg van rhesusmacaquen of microvasculaire endotheelcellen afkomstig uit de long van rhesusmacaquen, die werden geïsoleerd en gekarakteriseerd zoals eerder beschreven16-18.
Gedurende het decellularisatieproces vertoonden de longen van de makaak een progressieve witverkleuri...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
Weefsels kunnen efficiënt en effectief gedecellulariseerd worden door middel van een aantal methoden die fysische, chemische en enzymatische agentia gebruiken12,20. De uitdagingen van het produceren van 3D biologische matrices van grote organen omvatten de behoefte aan grote volumes aan gedecellularisatie-oplossingen, dure commercieel beschikbare apparatuur (i.e. bioreactoren) en een duizelingwekkende hoeveelheid methodologische verstoringen die nodig zijn om het uiteindelijke weefsel-afgeleide produc...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
We hebben niets te onthullen.
Dankbetuigingen
De auteurs willen de redactie van Tissue Engineering bedanken voor het toestaan van het gebruik van afbeeldingen uit een eerdere publicatie in dit rapport.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| Sodium nitroprusside | Sigma-Aldrich | 71778-25G | |
| Heparin sodium salt | Fisher | BP2425 | |
| Triton X-100 | Fisher | BP151-100 | |
| Sodium deoxycholate | Fisher | BP349-100 | |
| Sodium chloride | Fisher | 7647-14-5 | |
| Bovine pancreatic DNase | Sigma-Aldrich | DN25 | Prepare stock, aliquot, and freeze |
| Magnesium sulfate | Fisher | 10034-99-8 | |
| Calcium chloride | Fisher | C614-500 | |
| PBS (no Ca/Mg) | Gibco, Life Technologies | 10010-031 | |
| Antibiotic-Antimycotic | Gibco Life Technologies | 15240062 | |
| Cell Culture Media | |||
| Alpha MEM | Gibco Life Technologies | 12561-072 | |
| Medium 199 | Gibco Life Technologies | 11150067 | |
| Premium Fetal Bovine Serum | Atlanta Biologicals | S11150 | |
| L-Glutamine 100x | Gibco Life Technologies | 25030-081 | |
| Endothelial Cell Growth Supplement (ECGS) | ScienCell | 1052 | |
| Antibiotic-Antimycotic | Gibco Life Technologies | 15240062 | |
| Cell Seeding and Bioreactor Culture | |||
| Check valves | Cole-Parmer | EW-98553-20 | |
| Y-connectors | Cole-Parmer | ED-30614-08 | |
| 3-Way stopcocks | Harvard Apparatus | 721664 | |
| MasterFlex L/S 14 tubing | Cole-Parmer | 96420-14 | |
| MasterFlex L/S 16 tubing | Cole-Parmer | 96420-16 | |
| Male lock Luer 1/8 in | Cole-Parmer | EW-45505-04 | |
| Female Luer 1/8 in | Cole-Parmer | SI-45502-04 | |
| Male Luer lock plug | Cole-Parmer | EW-45505-56 | |
| Injection ports | Medi-Dose EPS | IV2004 | |
| Latex tubing | St. Louis Medical Supply | HN10910 | |
| Hose clamp | Cole-Parmer | EW-06832-02 | |
| 2 L Wide-mouth jar | Fisher | 05-719-276 | |
| 60 ml Syringes | Fisher | NC9035364 |
Referenties
- Ott, H. C., et al. Perfusion-decellularized matrix: using nature's platform to engineer a bioartificial heart. Nat. Med. 14, 213-221 (2008).
- Badylak, S. F., Taylor, D., Uygun, K. Whole-organ tissue engineering: decellularization and recellularization of three-dimensional matrix scaffolds. Annu. Rev. Biomed. Eng. 13, 27-53 (2011).
- Ott, H. C., et al. Regeneration and orthotopic transplantation of a bioartificial lung. Nat. Med. 16, 927-933 (2010).
- Price, A. P., England, K. A., Matson, A. M., Blazar, B. R., Panoskaltsis-Mortari, A. Development of a decellularized lung bioreactor system for bioengineering the lung: the matrix reloaded. Tissue Eng. Part A. 16, 2581-2591 (2010).
- Petersen, T. H., et al. Tissue-engineered lungs for in vivo implantation. Science. 329, 538-541 (2010).
- Song, J. J., et al. Enhanced in vivo function of bioartificial lungs in rats. Ann. Thorac. Surg. 92, 998-1005 (2011).
- Seok, J., et al. Genomic responses in mouse models poorly mimic human inflammatory diseases. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. , (2013).
- Joag, S. V. Primate models of AIDS. Microbes Infect. 2, 223-229 (2000).
- Hu, S. L. Non-human primate models for AIDS vaccine research. Curr. Drug. Targets Infect. Disord. 5, 193-201 (2005).
- Borda, J. T., et al. Clinical and immunopathologic alterations in rhesus macaques affected with globoid cell leukodystrophy. Am. J. Pathol. 172, 98-111 (2008).
- Fabbrini, E., et al. Metabolic response to high-carbohydrate and low-carbohydrate meals in a non-human primate model. Am. J. Physiol. Endocrinol. Metab. , (2012).
- Crapo, P. M., Gilbert, T. W., Badylak, S. F. An overview of tissue and whole organ decellularization processes. Biomaterials. 32, 3233-3243 (2011).
- Calle, E. A., Petersen, T. H., Niklason, L. E. Procedure for Lung Engineering. J. Vis. Exp. (49), e2651(2011).
- Arold, S. P., Wong, J. Y., Suki, B. Design of a new stretching apparatus and the effects of cyclic strain and substratum on mouse lung epithelial-12 cells. Ann. Biomed. Eng. 35, 1156-1164 (2007).
- Huang, H., et al. Differentiation from embryonic stem cells to vascular wall cells under in vitro pulsatile flow loading. J. Artif. Organs. 8, 110-118 (2005).
- Izadpanah, R., et al. Characterization of multipotent mesenchymal stem cells from the bone marrow of rhesus macaques. Stem Cells Dev. 14, 440-451 (2005).
- Craig, L. E., Nealen, M. L., Strandberg, J. D., Zink, M. C. Differential replication of ovine lentivirus in endothelial cells cultured from different tissues. Virology. 238, 316-326 (1006).
- Craig, L. E., Spelman, J. P., Strandberg, J. D., Zink, M. C. Endothelial cells from diverse tissues exhibit differences in growth and morphology. Microvasc. Res. 55, 65-76 (1998).
- Bonvillain, R. W., et al. A Nonhuman Primate Model of Lung Regeneration: Detergent-Mediated Decellularization and Initial In Vitro Recellularization with Mesenchymal Stem Cells. Tissue Eng. Part A. 18, 2437-2452 (2012).
- Badylak, S. F., Taylor, D., Uygun, K. Whole-Organ Tissue Engineering: Decellularization and Recellularization of Three-Dimensional Matrix Scaffolds. Annu. Rev. Biomed. Eng. , (2010).
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
