Decellularisatie van hele organen produceert natuurlijke biologische scaffolds die kunnen worden gebruikt voor regeneratieve geneeskunde. Er wordt een beschrijving gepresenteerd van een niet-menselijke primaatmodel van longregeneratie waarbij hele longen worden gedecellulariseerd en vervolgens worden gezaaid met volwassen stamcellen en endotheelcellen in een bioreactor die vasculaire circulatie en vloeibare media-ventilatie vergemakkelijkt.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Niet-menselijke primaat longdecellurisatie en recellerisatie met behulp van een gespecialiseerde bioreactor voor grote organen
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Er zijn onvoldoende longen beschikbaar om te voldoen aan de huidige en toekomstige behoeften voor orgaantransplantatie. Biokunstmatige weefselregeneratie is een aantrekkelijke alternatief voor klassieke orgaantransplantatie. Deze technologie gebruikt de natuurlijke biologische extracellulaire matrix (ECM) van een orgaan als een schaal waarop autologe of stam-/voorlopercellen kunnen worden gezaaid en gekweekt op een manier die regeneratie van het oorspronkelijke weefsel vergemakkelijkt. De natuurlijke ECM wordt geïsoleerd door een proces dat decellularisatie wordt genoemd. Decellularisatie wordt bereikt door weefsels te behandelen met een reeks detergenten, zouten en enzymen om effectieve verwijdering van cellulair materiaal te bereiken terwijl de ECM intact blijft. Studies die gebruik maken van decellularisatie en daaropvolgende recellering van knaagdierlongen toonden marginale successen in het genereren van longachtig weefsel dat in staat is tot gasuitwisseling in vivo. Hoewel ze essentieel bewijs van concept bieden, zijn knaagdiermodellen niet direct toepasbaar voor gebruik bij mensen. Niet-menselijke primaten (NHP) bieden een geschikter model om het gebruik van biokunstmatige orgaanproductie voor eventueel klinisch gebruik te onderzoeken.
De protocollen voor het bereiken van volledige decellularisatie van longen verkregen van de NHP rhesus-makake worden gepresenteerd. De resulterende acellulaire longen kunnen worden gezaaid met een verscheidenheid aan cellen, waaronder mesenchymale stamcellen en endotheelcellen. Het manuscript beschrijft ook de ontwikkeling van een bioreactorsysteem waarin celgezaaide makakenlongen kunnen worden gekweekt onder omstandigheden van mechanische rek en spanning die worden geboden door negatieve drukventilatie, evenals pulsatiele perfusie door de bloedvaten; deze krachten zijn bekend om differentiatie langs respectievelijk de pulmonaire en endotheel lijnen te leiden. Representatieve resultaten van decellularisatie en celzaaien worden verstrekt.
Inleiding
Bio-engineeren van weefsels en organen is een aantrekkelijke aanvulling op het gebied van regeneratieve geneeskunde. Het creëren van 'in het laboratorium gekweekte' organen die geschikt zijn voor transplantatie bij patiënten om de functionaliteit van zieke organen te vervangen, is zeer wenselijk om te voldoen aan de huidige en toekomstige vraag naar transplantatiebehoeften. De principes van weefsel engineering draaien om het zaaien van gewenste celtypen, of voorlopers daarvan, in een scaffold die de vorm van het geëngineerde weefsel ondersteunt, terwijl de geschikte groeifactoren en kweekcondities worden geleverd die nodig zijn om ontwikkelings- of regeneratieve proce....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
1. Decellularisatie van het hele longorgaan van de makaak
- Bereiding van oplossingen
- Autoclaveer 10-15 L gedeïoniseerd water (dH2O) in flessen van 1-2 L.
- Bereid "Triton-oplossing" (0,1% Triton X-100 in dH2O) door 1 ml Triton X-100 te mengen in 999 ml dH2O terwijl u roert op een magnetische roerder. Filter de oplossing door een 0,22 µm filterapparaat. Bewaar bij kamertemperatuur.
- Bereid "SDC-oplossing" (2% SDC in dH2O) door langzaam 20 g natriumdeoxycholaat (SDC) toe te voegen aan ~900 ml dH2O terwijl u roert. Zodra SDC is opgelost, breng de oplossing over naar ....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
De hieronder weergegeven resultaten zijn afkomstig van afzonderlijke experimenten waarbij respectievelijk de luchtweg- of vasculaire compartimenten werden gezaaid met mesenchymale stamcellen afkomstig uit het beenmerg van rhesusmacaquen of microvasculaire endotheelcellen afkomstig uit de long van rhesusmacaquen, die werden geïsoleerd en gekarakteriseerd zoals eerder beschreven16-18.
Gedurende het decellularisatieproces vertoonden de longen van de makaak een progressieve witverkleuri.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
Weefsels kunnen efficiënt en effectief gedecellulariseerd worden door middel van een aantal methoden die fysische, chemische en enzymatische agentia gebruiken12,20. De uitdagingen van het produceren van 3D biologische matrices van grote organen omvatten de behoefte aan grote volumes aan gedecellularisatie-oplossingen, dure commercieel beschikbare apparatuur (i.e. bioreactoren) en een duizelingwekkende hoeveelheid methodologische verstoringen die nodig zijn om het uiteindelijke weefsel-afgeleide produc.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
We hebben niets te onthullen.
Dankbetuigingen
De auteurs willen de redactie van Tissue Engineering bedanken voor het toestaan van het gebruik van afbeeldingen uit een eerdere publicatie in dit rapport.
....Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| Sodium nitroprusside | Sigma-Aldrich | 71778-25G | |
| Heparin sodium salt | Fisher | BP2425 | |
| Triton X-100 | Fisher | BP151-100 | |
| Sodium deoxycholate | Fisher | BP349-100 | |
| Sodium chloride | Fisher | 7647-14-5 | |
| Bovine pancreatic DNase | Sigma-Aldrich | DN25 | Prepare stock, aliquot, and freeze |
| Magnesium sulfate | Fisher | 10034-99-8 | |
| Calcium chloride | Fisher | C614-500 | |
| PBS (no Ca/Mg) | Gibco, Life Technologies | 10010-031 | |
| Antibiotic-Antimycotic | Gibco Life Technologies | 15240062 | |
| Cell Culture Media | |||
| Alpha MEM | Gibco Life Technologies | 12561-072 | |
| Medium 199 | Gibco Life Technologies | 11150067 | |
| Premium Fetal Bovine Serum | Atlanta Biologicals | S11150 | |
| L-Glutamine 100x | Gibco Life Technologies | 25030-081 | |
| Endothelial Cell Growth Supplement (ECGS) | ScienCell | 1052 | |
| Antibiotic-Antimycotic | Gibco Life Technologies | 15240062 | |
| Cell Seeding and Bioreactor Culture | |||
| Check valves | Cole-Parmer | EW-98553-20 | |
| Y-connectors | Cole-Parmer | ED-30614-08 | |
| 3-Way stopcocks | Harvard Apparatus | 721664 | |
| MasterFlex L/S 14 tubing | Cole-Parmer | 96420-14 | |
| MasterFlex L/S 16 tubing | Cole-Parmer | 96420-16 | |
| Male lock Luer 1/8 in | Cole-Parmer | EW-45505-04 | |
| Female Luer 1/8 in | Cole-Parmer | SI-45502-04 | |
| Male Luer lock plug | Cole-Parmer | EW-45505-56 | |
| Injection ports | Medi-Dose EPS | IV2004 | |
| Latex tubing | St. Louis Medical Supply | HN10910 | |
| Hose clamp | Cole-Parmer | EW-06832-02 | |
| 2 L Wide-mouth jar | Fisher | 05-719-276 | |
| 60 ml Syringes | Fisher | NC9035364 |
Referenties
- Ott, H. C., et al. Perfusion-decellularized matrix: using nature's platform to engineer a bioartificial heart. Nat. Med. 14, 213-221 (2008).
- Badylak, S. F., Taylor, D., Uygun, K. Whole-organ tissue....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
