We beschrijven een methode voor het implanteren en onderhouden van glazen ramen over de blootgestelde ruggenmerg van volwassen muizen voor het bestuderen van experimentele auto-immuun encefalomyelitis. Deze ramen bieden chronische optische toegang tot het ruggenmerg voor het monitoren van celdynamica op subcellulair niveau in levende dieren met behulp van twee-foton microscopie.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Implantatie van glazen ruggenmergvensters bij volwassen muizen met experimentele auto-immuun encefalomyelitis
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Experimentele autoimmuun encefalomyelitis (EAE) bij volwassen knaagdieren is het standaard experimentele model voor het bestuderen van autonoom demyeliniserende ziekten zoals multiple sclerose. Hier presenteren we een laagkost- en reproduceerbaar glasvenster-implantatieprotocol dat geschikt is voor intravitale microscopie en het bestuderen van de dynamica van de cytoarchitectuur van het ruggenmerg met subcellulaire resolutie bij levende volwassen muizen met EAE. In het kort, we leggen chirurgisch de wervels T12-L2 bloot en construeren een kamer rond de blootgestelde wervels met behulp van een combinatie van cyanoacrylaat en tandcement. Een laminectomie wordt uitgevoerd van T13 tot L1, en een dunne laag transparant siliconenelastomeer wordt aangebracht op het dorsale oppervlak van het blootgestelde ruggenmerg. Een gemodificeerd glazen deksel wordt geïmplanteerd over het blootgestelde ruggenmerg, waarbij erop wordt gelet dat het glas niet direct in contact komt met het ruggenmerg. Om de infiltratie van inflammatoire cellen tussen het venster en het ruggenmerg te verminderen, wordt elke 2 dagen (zoals aanbevolen door de ethische commissie) gedurende de eerste 10 dagen na implantatie een ontstekingsremmende behandeling toegediend. EAE wordt slechts 2-3 weken na het stoppen van de ontstekingsremmende behandeling geïnduceerd.
Met behulp van deze aanpak hebben we met succes EAE geïnduceerd bij 87% van de dieren met geïmplanteerde vensters en, met behulp van Thy1-CFP-23 muizen (blauwe axonen in het dorsale ruggenmerg), axonale verlies gekwantificeerd gedurende de progressie van EAE. Samengevat kan dit protocol nuttig zijn voor het bestuderen van de rekrutering van verschillende celpopulaties evenals hun interactiedynamiek, met subcellulaire resolutie en gedurende langere periodes. Deze intravitale beeldvormingsmodaliteit vertegenwoordigt een waardevol hulpmiddel voor het ontwikkelen van therapeutische strategieën voor de behandeling van autoimmuun demyeliniserende ziekten zoals EAE.
Inleiding
Multiple sclerose is een auto-immuunziekte van het centrale zenuwstelsel die progressieve myeline- en axonbeschadiging veroorzaakt. Het standaard onderzoeksmodel voor auto-immuun demyeliniserende ziekten van het centrale zenuwstelsel is EAE bij volwassen knaagdieren. De dynamische cellulaire gebeurtenissen die ten grondslag liggen aan de progressie van EAE blijven echter grotendeels onontgonnen. Een benadering is om intravitale twee-foton microscopie te gebruiken om cellulaire populaties met fluorescerende markers gedurende langere tijd te visualiseren in de ruggenmerg van volwassen muizen met EAE.
Intravitale twee-foton microscopie is een krachtige manier om cellulaire fysiologie, cellulaire interacties en de dynamische progressie van ziekte in levende dieren met subcellulaire resolutie te bestuderen1. Een groot obstakel voor de benadering is echter dat het optische toegang vereist tot het gebied van belang. Bijvoorbeeld, craniale glazen vensters zijn een goed gevestigde methodologie voor herhaaldelijk beeldvorming van dezelfde microstructuren in de hersenen gedurende meerdere weken2,3. Aanpassing van deze methodologie aan beeldvorming van het ruggenmerg is echter niet eenvoudig en vereist verschillende technische aanpassingen om het dorsale ruggenmergweefsel binnen de gearticuleerde wervels te immobiliseren.
Vóórheen vereiste optische toegang tot het ruggenmerg chirurgisch het ruggenmerg opnieuw blootleggen aan het begin van elke beeldvormingssessie en het sluiten van de huid met hechtingen aan het einde van elke sessie4-12. Deze herhaalde operaties zijn traumatisch voor het dier, beperken het aantal en de lengte van beeldvormingssessies en verhogen de kans op operatie-gerelateerde artefacten zoals ontsteking en schade aan het ruggenmerg door mechanische verstoring. Om deze nadelen te overwinnen, hebben we onlangs een protocol ontwikkeld om glazen vensters te implanteren over de blootgestelde ruggenmergen van volwassen fluorescente transgene muizen met traumatisch ruggenmerg letsel voor langetermijn in vivo twee-foton microscopie experimenten zonder herhaalde operaties13. Hier presenteren we een gedetailleerde aanpassing van het implantatieprotocol in de context van de toepassing ervan om de dynamische cellulaire gebeurtenissen die ten grondslag liggen aan de progressie van EAE in volwassen muizen te bestuderen.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
1. Voorbereiding van venster en ondersteuningsstructuur
- Venstervoorbereiding - bereid verschillende vensters van verschillende groottes (breedte = 1,8-2,2 mm; lengte = 4,5-5,2 mm) voor implantatie.
- Het maken van de gemodificeerde boorslijpsteen om het dekglas te snijden - gebruik een royale hoeveelheid tandheelkundig cement om een boorslijpsteen aan een as te bevestigen (in ons geval oude Bulldog-klemmen). Zorg ervoor dat de boorslijpsteen ~45° ten opzichte van de as staat voor gemakkelijker hantering.
Opmerking: diamantschrijvers werken ook goed voor het snijden van dekglas. - Het maken van diapositivie-A - gebruik een standaard microscoopdiapositivie, plak een kort stuk liniaalpapier (~2 cm) op de onderkant van de diapositivie zodat je de liniaal door het glas kunt zien. Plaats vervolgens een stuk plakband langs de rand van de 0 mm-markering van de liniaal om te dienen als bevestiging voor het dekglas in de volgende stap.
- Gebruik de gemodificeerde boorslijpsteen, diapositivie-A en een ongewijzigde microscoopdiapositivie (diapositivie-B), positioneer een stuk dekglas (nr. 1,5 dikte) op de 0 mm-markering op diapositivie-A. Gebruik diapositivie-B om het dekglas op zijn plaats te houden en als mal voor de beoogde sneelijn. Snijd het dekglas in een lange rechthoek van ongeveer 5 x 22 mm. Draai het gesneden glas 90° en snijd de rechthoek in een kleinere rechthoek van ~2 x 5 mm.
- Het maken van de gemodificeerde boorslijpsteen om het dekglas te snijden - gebruik een royale hoeveelheid tandheelkundig cement om een boorslijpsteen aan een as te bevestigen (in ons geval oude Bulldog-klemmen). Zorg ervoor dat de boorslijpsteen ~45° ten opzichte van de as staat voor gemakkelijker hantering.
- Speldbevochtigingen - twee gewijzigde spelden worden geïmplanteerd om de vensterkamer te ondersteunen en te bevestigen aan de wervels (zie sectie 2.7-8).
- Gebruik een standaard kleine speld (kroon = 8 mm; poot = 4 mm), buig het midden van de kroon ~90° zodat de uiteinden van de poten elkaar bijna raken.
- Buig de uiteinden van de poten ongeveer 45° naar buiten op het halve punt, zodat de distale helft van de poten evenwijdig is.
- Buig de distale helft van de poten ~30° omhoog ten opzichte van het vlak van de speld. Plaats de gewijzigde spelden voorafgaand aan de operatie in ethanol voor sterilisatie.
Opmerking: Spelden kunnen ook worden gesteriliseerd met ethyleenoxide of in een autoclaaf.
- Paperclip-aanpassingen - bereid een gewijzigde paperclip voor om te worden geïmplanteerd als onderdeel van de kamer (zie secties 2.9-10) en om te dienen als houdklip voor chirurgie en beeldvorming.
- Gebruik een standaard 25 mm-paperclip, verwijder de kleine bocht en laat een langwerpige U-vorm over.
- Gebruik tang of naaldtang om de diameter van de bocht te verkleinen tot ~2 mm terwijl de uiteinden evenwijdig blijven.
- Buig de uiteinden ongeveer 90° naar buiten op ongeveer 8-10 mm van de bocht. Maak eventuele aanpassingen die nodig zijn zodat het plat ligt.
2. Vensterimplantatie
Opmerking: Alle chirurgische en dierzorgprocedures werden uitgevoerd in overeenstemming met de Europese Gemeenschappenraadrichtlijn en werden goedgekeurd door het Nationale Dierstudiescomité van Frankrijk (autorisatie nr. 13.300).
- Verdoofd de muis (Ket/Xyl; inductiedosis: 120 mg/kg, 12 mg/kg; aanvullende dosis, 40 mg/kg, 4 mg/kg), breng oogzalf aan op de ogen.
- Scheer zijn rug ongeveer ~2 cm breed door ~5 cm lang, gecentreerd op de thoracale bult, en maak de blootgestelde huid schoon met jodiumzeep gevolgd door jodiumoplossing. Reinig handschoenen door ze te besproeien met 90% ethanol.
- Gebruik weefselschaar om de dorsale huid longitudinaal over de wervels T11 tot L1 (~2 cm) te snijden. Gebruik een scalpel om bilaterale longitudinale incisies te maken tussen de spinous- en transverse processen van T11 tot L1. Opmerking: Als handschoenen of instrumenten het haar of de huid van het dier raken, maak de handschoenen of het instrument opnieuw schoon met een koude sterilisator zoals 90% ethanol of Germ-X.
- Hengel de muis in de spinale vork stereotaxic - Begin door de bovenste rechter spinale vork in positie te klemmen. Grijp T11 met Adson-tang en positioneer het T11-transverse proces over de vaste spinale vork. Terwijl je de wervel op zijn plaats houdt, bevestig de contralaterale spinale vork onder het contralaterale transverse proces.
- Gebruik dezelfde procedure als in stap 2.4, positioneer L1 binnen de spinale vork.
- Gebruik een scalpel (nr. 23), schraap voorzichtig de spieren tussen de spinous- en transverse processen van T11 tot L1 weg, zodat de laminae duidelijk zichtbaar zijn. Voor een beter zicht op de pedicels van T11, snijd de pees die rostrale projecteert vanaf de punt van het transverse proces.
- Spui de gewijzigde spelden met PBS en plaats de uiteinden van de spelden lateraal ten opzichte van de vertebrale pedicels van T11 en L1, waarbij de afstand tussen de uiteinden wordt aangepast zodat ze de pedicels lichtjes raken.
Opmerking: Gebruik alleen PBS met dexamethason (0,1%), penicilline (1.000 U/ml) en streptomycine (1 mg/ml), om postoperatieve ontsteking te verminderen en de vensterhelderheid te verbeteren. - Lijmp de spelden op hun plaats met een kleine druppel cyanoacrylaat op elk inbrengpunt en verwijder de muis uit de spinale vorken.
- Breng een dunne laag cyanoacrylaat aan op de gesneden randen van de huid en blootgestelde spieren rond de geklaarde wervels, zorg ervoor dat je de wervels niet verlijmd. Buig de uiteinden van de gewijzigde paperclip
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
Het gebruik van chronisch geïmplanteerde glazen vensters in combinatie met intravitale tweefotonenmicroscopie en EAE-modellen kan een nuttig instrument zijn om de cellulaire mechanismen ten grondslag aan de pathologie van auto-immuun gedemyeliniserende ziekten te begrijpen. Met onze implantatiemethode stelden we vast dat de meeste vensters helder waren op het moment van EAE-inductie en helder bleven gedurende de progressie van EAE (Figuur 1c). Met deze aanpak stelden we vast dat de vensters gedurende de ...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
We beschreven een methode voor het implanteren en onderhouden van glazen vensters boven de blootgestelde ruggenmerg van volwassen muizen om de dynamische progressie van EAE in de loop van de tijd te bestuderen. Een soortgelijke aanpak voor het implanteren van glazen vensters is gebruikt om modellen van ruggenmergletsel te bestuderen13 en kan ook nuttig zijn voor het bestuderen van andere ruggenmergpathologieën zoals glioblastomas, meningitis of de cellulaire fysiologie van het normale ruggenmerg. Voor onze met...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs verklaren dat ze geen concurrerende financiële belangen hebben.
Dankbetuigingen
Wij danken C. Ricard, M-C. Amoureux, A. Jaouen en S. Meijia-Gervacio voor nuttige discussies; M. Hocine en C. Meunier, en het personeel van de dier- en PicSIL-beeldvormingsfaciliteiten van de IBDML voor technische ondersteuning. Dit werk werd ondersteund door een institutionele subsidie van het Centre National de la Recherche Scientifique, en door subsidies van de Association de Recherche sur la Sclérose en Plaque (ARSEP) (voor G.R. en K.K.F), Agence Nationale de la Recherche (ANR JCJC), Fédération de Recherche sur le Cerveau (FRC) Institut de Recherche sur la Moelle Épinière (IRME) (voor FD). K.K.F. werd ondersteund door een ARSEP-beurs. Beeldvorming werd uitgevoerd op de PIcSIL-beeldvormingsfaciliteit van de IBDML.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| Boteramedraai | World Precision Instruments | IDEAL MICRO-DRILL | Ook verkocht door Harvard Apparatus. Elke hoogwaardige chirurgische botboor is voldoende. |
| Boorbijl (#1/4 of 1/2 Carbide Ronde Bijl) | World Precision Instruments | 501860 (#1/4) 501860 (#1/2) | Ook verkocht door Harvard Apparatus |
| Speldprikkers | Lyreco | 5.002.567 | Kroon = 8 mm Voet = 4 mm |
| Paperclip | Elke standaard 25 mm paperclip | ||
| Naalddrivers | Fine Science Tools | 12003-15 | |
| Weefselschaar | Fine Science Tools | 14028-10 | |
| Adsontang | Fine Science Tools | 11027-12 | 1 x 2 tanden |
| Blunte pincet | Fine Science Tools | 11293-00 | |
| Spinale vorken | Harvard Apparatus | 724813 | |
| Tandcement | GACD | 12-565 & 12-568 | |
| Siliconen elastomeer | World Precision Instruments | KWIK-SIL | Ook verkrijgbaar via Coherent Scientific en Fisher Scientific |
| Cyanoacrylaat | Eleco-EFD | Cyanolit 201 | |
| Microscoop | Zeiss | 7MP | Onze microscoop is in een rechtopstaande configuratie en is uitgerust met 5 NDD-detectoren. |
| Objectieflens | Zeiss | W Plan-Apochromat 20x/1.0 DIC M27 75mm | Werkafstand = 1,8 mm |
Referenties
- Kim, J. V., Dustin, M. L. Innate response to focal necrotic injury inside the blood-brain barrier. J. Immunol. 177 (8), 5269-5277 (2006).
- Xu, H. -T., Pan, F., Yang, G., Gan, W. -B. Choice of cranial window type for in vivo imaging affects dendritic spine turnover in the cortex. Nat. Neurosci. 10 (5), 549-551 (2007).
- Holtmaat, A., Bonhoeffer, T., et al. Long-term, high-resolution imaging in the mouse neocortex through a chronic cranial window. Nat. Protoc. 4 (8), 1128-1144 (2009).
- Dray, C., Rougon, G., Debarbieux, F. Quantitative analysis by in vivo imaging of the dynamics of vascular and axonal networks in injured mouse spinal cord. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106 (23), 9459-9464 (2009).
- Kerschensteiner, M., Schwab, M. E., Lichtman, J. W., Misgeld, T. In vivo imaging of axonal degeneration and regeneration in the injured spinal. 11 (5), 572-577 (2005).
- Ylera, B., Ertürk, A., et al. Chronically CNS-injured adult sensory neurons gain regenerative competence upon a lesion of their peripheral axon. Curr. Biol. 19 (11), 930-936 (2009).
- Dibaj, P., Nadrigny, F., et al. NO mediates microglial response to acute spinal cord injury under ATP control in vivo. Glia. 58 (9), 1133-1144 (2010).
- Dibaj, P., Steffens, H., et al. In Vivo imaging reveals distinct inflammatory activity of CNS microglia versus PNS macrophages in a mouse model for ALS. PloS One. 6 (3), (2011).
- Johannssen, H. C., Helmchen, F. In vivo Ca2+ imaging of dorsal horn neuronal populations in mouse spinal cord. J. Physiol. 588 (18), 3397-3402 (2010).
- Nikić, I., Merkler, D., et al. A reversible form of axon damage in experimental autoimmune encephalomyelitis and multiple sclerosis). Nat. Med. 17 (4), 495-499 (2011).
- Di Maio, A., Skuba, A., et al. In vivo imaging of dorsal root regeneration: rapid immobilization and presynaptic differentiation at the CNS/PNS border. J. Neurosci. 31 (12), 4569-4582 (2011).
- Laffray, S., Pagès, S., Dufour, H., De Koninck, P., De Koninck, Y., Côté, D. Adaptive movement compensation for in vivo imaging of fast cellular dynamics within a moving tissue. PloS One. 6 (5), (2011).
- Fenrich, K. K., Weber, P., Hocine, M., Zalc, M., Rougon, G., Debarbieux, F. Long-term in vivo imaging of normal and pathological mouse spinal cord with subcellular resolution using implanted glass windows. J. Physiol. 590 (16), 3665-3675 (2012).
- Kuerten, S., Angelov, D. N. Comparing the CNS morphology and immunobiology of different EAE models in C57BL/6 mice - a step towards understanding the complexity of multiple sclerosis). Ann. Anat. 190 (1), 1-15 (2008).
- Mendel, I., Kerlero de Rosbo, N., Ben-Nun, A. A myelin oligodendrocyte glycoprotein peptide induces typical chronic experimental autoimmune encephalomyelitis in H-2b mice: fine specificity and T cell receptor V beta expression of encephalitogenic T cells. Eur. J. Immunol. 25 (7), 1951-1959 (1995).
- Farrar, M. J., Bernstein, I. M., Schlafer, D. H., Cleland, T. A., Fetcho, J. R., Schaffer, C. B. Chronic in vivo imaging in the mouse spinal cord using an implanted. Nat. Methods. , (2012).
- Moreno, B., Jukes, J. -P., et al. Systemic inflammation induces axon injury during brain inflammation. Ann. Neurol. 70 (6), 932-942 (2011).
- Lassmann, H., van Horssen, J. The molecular basis of neurodegeneration in multiple sclerosis. FEBS Lett. 585 (23), 3715-3723 (2011).
- Yenari, M. A., Han, H. S. Neuroprotective mechanisms of hypothermia in brain ischaemia. Nat. Rev. Neurosci. 13 (4), 267-278 (2012).
- Kalmbach, A. S., Waters, J. Brain surface temperature under a craniotomy. J. Neurophysiol. 108 (11), 3138-3146 (2012).
- Pérez-Nievas, B. G., García-Bueno, B., Madrigal, J. L. M., Leza, J. C. Chronic immobilisation stress ameliorates clinical score and neuroinflammation in a MOG-induced EAE in Dark Agouti rats: mechanisms implicated. J. Neuroinflammation. 7, 60 (2010).
- Bjartmar, C., Kidd, G., Mörk, S., Rudick, R., Trapp, B. D. Neurological disability correlates with spinal cord axonal loss and reduced N-acetyl aspartate in chronic multiple sclerosis patients. Ann. Neurol. 48 (6), 893-901 (2000).
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
