Een experimenteel model om te studeren Tuberculose-Malaria Coinfection op Natuurlijke Transmissie van Mycobacterium tuberculosis En Plasmodium berghei</i

Samenvatting

Tuberculose en malaria zijn twee van de meest voorkomende infecties bij mensen en de belangrijkste oorzaken van morbiditeit en mortaliteit in arme bevolking in de tropen. Wij vestigden een experimenteel model systeem om resultaten van malaria-tuberculose co-infectie te bestuderen in muizen na challenge met beide ziekteverwekkers via hun natuurlijke route van infectie.

Samenvatting

Co-infecties van nature door de geografische overlapping van verschillende soorten pathogene organismen. Gelijktijdige infecties waarschijnlijk moduleren de respectieve immuunrespons op elke afzonderlijke pathogeen en kunnen daardoor pathogenese en ziekte uitkomst beïnvloeden. Coinfected patiënten kunnen ook verschillend reageert op anti-infectieuze interventies. Coinfection tussen tuberculose veroorzaakt door mycobacteriën en de malariaparasiet Plasmodium, die beide zijn coendemic in vele delen van Afrika bezuiden de Sahara, is niet in detail bestudeerd. Met het oog op de uitdagende, maar wetenschappelijk en klinisch zeer relevante vraag hoe malaria-tuberculose co-infectie moduleren gastheer immuniteit en het verloop van elke ziekte, hebben we een experimenteel muismodel dat ons toelaat om de opgewekte immuunrespons op beide ziekteverwekkers ontleden in de coinfected gastheer benaderen . Van de nota, om zo precies na te bootsen natuurlijk verworven menselijke besmettingen, voeren we experimenteelinfecties van muizen met beide ziekteverwekkers door hun natuurlijke routes van infectie, dwz spuitbussen en muggen bijten, respectievelijk.

Inleiding

Bevolkingsgroepen worden zelden blootgesteld aan slechts een pathogeen. Met name in gebieden met een hoge incidentie van infecties zoals sub-Sahara Afrika, co-infecties vormen een eerste, maar zeer ondergewaardeerd probleem voor de volksgezondheid. Tuberculose en malaria zijn de meest voorkomende bacteriële en parasitaire infecties in mensen, respectievelijk blijven belangrijke oorzaken van morbiditeit en mortaliteit in arme bevolking in de tropen. Ondanks de brede geografische overlap tussen tuberculose en malaria en het groot aantal personen met een risico op co-infecties, zeer weinig bekend over de interacties tussen de verschillende en vaak tegengaan immuun regulatoren en effectoren gelijktijdig opgewekt tegen malaria parasieten en tuberkelbacteriën in coinfected individuen.

Knaagdier modellen van gemengde infecties laten karakteriseren differentieel immuunreacties tegen verschillende ziekteverwekkers in een gastheer, waardoor licht vergieten op de wederzijdse invloedlen moduleren pathologie en klinische verloop van de afzonderlijke ziekte, waardoor er ook nieuwe aanbevelingen voor therapie en preventie identificeren. We hebben een experimenteel muismodel die ons in staat stelt om de gevolgen veroorzaakt door een gelijktijdige infectie met Mycobacterium tuberculosis (MTB) en knaagdieren Plasmodium soorten binnen dezelfde host ¹ onderzoeken vastgesteld. Belangrijk is natuurlijk verworven humane infecties zo goed mogelijk emuleren ons model voert de natuurlijke routes van infectie door beide pathogenen. Tuberculose is een lucht infectie, die dus vooral manifesteert in de longen. De verwekker, Mtb wordt door mensen met een actieve ziekte via de aerosol route verzonden als ze verdrijven besmettelijke aërosoldruppeltjes tijdens het hoesten of niezen. Aldus aerosol infectie is het mogelijk om deze natuurlijke infectie na te bootsen. Generatie van de deeltjes die Mtb bevatten, kunnen worden bereikt door het gebruikvan een inhalatie-belichtingssysteem. Deze hele lichaam blootstelling kamer kan blootstellen proefdieren Mtb-bevattende infectieuze aërosoldruppeltjes (figuur 1) die ingeademd in de alveoli van de longen, waar infectie geïnitieerd ^2.

Malaria aan de andere kant is een vector overgedragen ziekte veroorzaakt door de protozoaire, apicomplexa parasiet Plasmodium die van nature wordt overgebracht door de beet van een vrouwelijke Anophelinen mug. Tijdens de bloedmeel, zijn besmettelijk sporozoïeten gedeponeerd onder de huid gastheer en vervolgens de lever bereiken via de bloedbaan. Binnen hepatocyten zij ontwikkelen en zich snel vermenigvuldigen in lever-fase schizonten. Uiteindelijk volwassen schizonten scheuren en loslaten duizenden pathogene eerste generatie merozoites in de bloedstroom waar begint een geleidelijke cyclus van rode celinvasie, replicatie, rode bloedcellen scheuren en reinvasion ^3. De Plasmodium levenscyclus Continwaarden zoals sommige merozoïeten ontwikkelen tot seksueel parasietstadia, de mannelijke en vrouwelijke gameten die door muggen worden genomen tijdens bloedmaaltijd. In de mug, Plasmodium sporozoïeten ontwikkelen binnen oöcysten die woonachtig zijn in de mug middendarm en uiteindelijk migreren naar de speekselklieren, die ze doorstuurt naar een andere host ^3,4.

Terwijl in experimentele diermodellen de levering van Mtb via de aerosol en dus meest relevante route is heel gebruikelijk, veel experimentele knaagdieren Plasmodium infectie studies met inbegrip van studies naar malaria-tuberculose co-infectie ^5-7 zijn uitgevoerd door het infecteren van muizen met geparasiteerde erytrocyten, die aanleiding uitgevoerd om bloed-stadium malaria-infectie met uitsluiting van de klinisch-stille lever-fase-fase. Echter, de lever fase is een verplichte stap tijdens de infectie en die relevant zijn voor anti-plasmodial immuniteit ^8-11. Wij vinden het daarom belangrijk om de lever ph omvattenase van malaria transmissie en onderhoud in studies van zowel malaria en malaria-tuberculose co-infectie, respectievelijk. Bovendien is aangetoond dat van nature overgedragen sporozoieten zijn besmettelijk dan die via de naald ¹² infecties, die ons gevraagd de malaria-infectie vast aan muggenbeet plaats van injecteren geïsoleerde speekselklier afgeleid sporozoieten. De enige manier om besmettelijke muggen voor natuurlijke transmissie van malaria parasieten te verkrijgen is om de hele levenscyclus van de parasiet in zowel de gewervelde gastheer (hier muis) en de mug vector handhaven. De toegang tot een insectary voor parasiet onderhoud onvermijdelijk is om de natuurlijke verzending uit te voeren door de beet.

Ons protocol hierin beschreven is ontwikkeld om te onderzoeken hoe de co-infectie met Plasmodium sporozoïeten effecten op chronische tuberculose ^1. Om dit te doen, zijn muizen aerosol besmet met M. tuberculose en 40 dagen later, toen M. tuberculose-infectie heeft de chronische fase bereikt, muizen worden blootgesteld aan malaria-besmettelijke muggen. Het resultaat van zowel malaria en tuberculose in het coinfected dieren kunnen worden gevolgd door monitoring bloed parasitemia en bacteriële verontreiniging in weefsel, respectievelijk. In ons protocol, zullen we in detail hoe muizen te infecteren met beide ziekteverwekkers beschrijven via hun natuurlijke infectie route en hoe succesvol ziekteverwekkertransmissie bevestigen. In onze handen, het gewoonlijk bereikt besmettingsgraad voor zowel experimentele infecties is 100%. Deze protocollen kunnen worden toegepast op zowel afzonderlijk of infecties, zoals wij, modelleren en bestuderen coinfection tussen twee van de meest uitdagende menselijke infectieziekten bestuderen. Dit model is van toepassing op andere Mycobacterium en knaagdieren Plasmodium soorten dan die in dit protocol beschreven.

Protocol

Veiligheidsmaatregelen en ethiek Verklaring

De gepresenteerde onderzoeken hierin te betrekken werken met de menselijke ziekteverwekker Mtb en het knaagdier malariaparasiet Plasmodium berghei (P. berghei). Experimenten met Mtb (stam H37Rv) en P. berghei moet onder de juiste bioveiligheid omstandigheden worden uitgevoerd. Biosafety level (BSL) 2 laboratoria zijn vereist voor knaagdieren malariaparasieten zoals P. berghei en BSL 3 voor Mtb en dus voor co-infecties studies hierin beschreven. OPMERKING: Muizen die besmet zijn met Mtb niet de infectie in de onmiddellijke omgeving verspreid naar andere muizen (eigen waarneming). Uitbreiden tot de experimentator kan dus worden uitgesloten, maar geschikte beschermende kleding te worden gedragen in de BSL 3 laboratorium te allen tijde. Volgens onze regels, onderzoekers gebruik chirurgische scrubs, haarnetjes, wegwerp maskers en twee paar handschoenen, waarvan de buitenste wordt verwijderd wanneer eenrms worden teruggetrokken uit de kast. Nieuwe worden op nogmaals in de kast gezet. Twee containers, een met 2% Buraton (NB: andere ontsmettingsmiddelen goedgekeurd inactiveren Mtb kan gebruikt worden bij de toegelaten concentratie) voor vloeibare en besmettelijk afval en een voor oppervlakte-decontaminatie, worden voorbereid voor het experiment en de binnenkant van de kast. Bovendien kunnen plastic zakken gebruikt voor vaste infectieuze afval. Volgens de Duitse regels, alle werkzaamheden met betrekking tot de behandeling en verwerking van Mtb culturen of weefsel afkomstig van Mtb geïnfecteerde muizen, moet in een klasse 2 bioveiligheid kast binnen een BSL3 lab worden uitgevoerd. Bij de omgang mycobacteriën, maatregelen worden genomen om de vorming van aërosolen te allen tijde voorkomen.

Vrouwelijke C57BL / 6 muizen (Charles River) tussen 6-8 weken oud werden gebruikt voor alle co-infectie experimenten en onder specifieke voorwaarden barrière in BSL 3 faciliteiten gehandhaafd. Verzorging van dieren en experimenten waren performed volgens protocollen door de ethische commissie goedgekeurd voor Dierproeven van het Ministerie van Landbouw, Milieu en Landelijk Gebied van de deelstaat Sleeswijk-Holstein

Voor het verkrijgen van malariamug stadia, werden NMRI muizen gekocht van Charles River Laboratory, Sulzfeld, Duitsland en onder specifieke pathogeen-vrije omstandigheden binnen de universiteit Heidelberg dierfaciliteit (IBF) gehouden. Alle dierproeven werden uitgevoerd volgens de Europese regelgeving en door de overheid van Baden-Württemberg (Regierungspräsidium Karlsruhe) goedgekeurd.

1. Aerosol Infectie van Muizen met Mtb met behulp van een Glas-Col Aerosol Chamber

De beste manier om aerosol infectie van proefdieren met Mtb standaardiseren is om mycobacteriën gebruiken van bevroren voorraden met bekende CFU titers. Ter voorbereiding voorraad culturen, cultuur Mtb in Middlebrook 7H9 bouillon aangevuld met OADC (oliezuurzuur, Albumine, dextrose, catalase) ophopingsmedium en 0,05% Tween 80, een koolstofbron voor mycobacteriën en meten bacteriële klonteren tegelijkertijd voorkomen. Cultures moet een OD ≤ 1 ten tijde van de oogst. Bij hogere OD, bacteriële samenklontering toeneemt en de levensvatbaarheid afneemt. WINKEL 1 ml porties bij -80 ° C. Bepaal het aantal levensvatbare kolonievormende eenheden (CFU) in bevroren voorraden door uitplaten een reeks van 10-voudige verdunningen van drie onafhankelijke flesjes op 7H11 agarplaten aangevuld met 0,5% glycerol, 1 g / l asparagine, en OADC en opsommen kolonies na 4 weken incubatie bij 37 ° C. Voer aerosol infectie zoals hieronder beschreven.

1. Dooi Mtb voorraden van bekende CFU titer en meng voorzichtig de opschorting vijf keer om bacteriële groepjes uiteen te drijven met behulp van een 1 ml injectiespuit voorzien van een 27 G naald. Vermijd de productie van aërosolen.
2. Afhankelijk van de gewenste infectiedosis Breng het vereiste volume van de bouillon in mycobacteriëleeen 50 ml buis met steriele PBS. Het uiteindelijke volume 6 ml. Opmerking: Door het variëren van het aantal micro-organismen in deze suspensie, het aantal bacteriën richting aerosoldruppeltjes gevarieerd. We meestal streven naar een opname van 100 levensvatbare bacillen per long (lage dosis infectie). In onze ervaring vereist dit ongeveer 1-2 x 10 ⁶ Mtb / ml in een totaal volume van 6 ml die 5,5 ml worden verneveld (zie hieronder). Het wordt aanbevolen om te doen een reeks van experimentele aerosol uitdagingen met verschillende concentraties van bacteriën aan de ideale omstandigheden voor de infectie te vinden. Dat hoge dosis infecties met tot 5000 mycobacteriën kan versnellen het infectieproces, zo weinig als 5 bacteriën kunnen worden gebruikt om met succes muizen infecteren door aerosol. De infectie is meestal 100%.
3. Verwijder voldoende volume (bereid dan uiteindelijk volume nodig) voor de beplating aan de entstof titer te bepalen; we meestal verwijderen 500 ul technische triplicaten plaat.
4. Plaats diereneen gecompartimenteerd gaasmand (een muis per mand) binnen de cirkelvormige aerosol kamer en sluit het deksel van de aerosol kamer. OPMERKING: Andere modellen zijn uitgerust met een taart-vormige mand bestaat uit vijf afzonderlijke compartimenten, die elk geschikt voor 20 muizen.
5. Bevestig de Venturi-vernevelaar eenheid om de drie roestvrijstalen socket gewrichten.
6. Verwijder de mycobacteriële schorsing van de 50 ml buis met een 10 ml injectiespuit voorzien van een 18 G stompe naald en dragen de spuit aan de aerosol kamer in een gesloten transportbox.
7. Verwijder de schroefdop van de vernevelaar unit en zorgvuldig injecteren de mycobacteriën suspensie in de vernevelaar. Vermijd het ontstaan ​​van aërosolen. Gooi de spuit in een naaldencontainer met 2% Buraton. Dicht de vernevelaar met de schroefdop.
8. Schakel de hoofdschakelaar en de UV-lamp. Het display op het bedieningspaneel toont "Glas-Col Apparatus Co".
9. Draai de programmaschakelaar op. Op het display verschijnttonen "Is de vernevelaar klaar?" "Is de korf?" Druk op Enter als u klaar bent. " Druk op enter.
10. Het display toont "Enter Verwarm Time 900", dit betekent dat het voorverwarmen tijd voor de verbrandingsoven (die de afvoerlucht saneert) is 900 sec. Druk op enter.
11. Op het display verschijnt "Enter vernevelen tijd 1800", dit betekent dat het verstuiven tijd is ingesteld op 1.800 sec als standaard. Om het verstuiven te verlengen, voert u "2400" en druk op enter. OPMERKING: Tijdens het verstuiven cyclus, lucht onder druk vernevelt de schorsing, waardoor kleine aërosoldruppeltjes met mycobacteriën genereren. Met de belangrijkste luchtstroom, worden deze druppels (ongeveer 2-5 micrometer groot) verricht naar de aerosol kamer.
12. Op het display verschijnt "Enter CD Time 1800", dit betekent dat het verval cyclus duurt 1.800 sec. Ingesteld op "2400" en druk op enter. OPMERKING: Tijdens deze cyclus, de wolk die is gebouwd up in de spuitbus kamer tijdens het verstuiven cyclus kan vervallen. De kleine druppeltjes worden ingeademd door de proefdieren.
13. Op het display verschijnt "Enter december Time 900", dit betekent dat het UV-licht decontaminatiecyclus 900 sec duurt. Druk op enter. De machine begint het fietsen door voorverwarmen, verstuiven, wolk verval en UV-ontsmetting.
    LET OP: Het vacuüm debietmeter moet aangeven 60 kubieke meter / uur (controleren wanneer voorverwarmingscyclus begint; vacuum regelklep aan te passen indien nodig) en de perslucht flow meter 10 kubieke meter / uur (controleren bij het vernevelen cyclus begint; lucht regelklep dienovereenkomstig aan te passen ).
14. Wanneer de cyclus is voltooid, zal het toetsenbord te tonen "-proces volledig - Verwijder Specimen". Schakel het programma, UV-en hoofdschakelaar.
15. Controleer of de mycobacteriële suspensie volledig is verneveld en zo niet, registreren de resterende hoeveelheid door zorgvuldig verwijderen van de suspensie met een geschikte injectiespuit voorzieneen 18 G stompe naald. De resterende hoeveelheid mag niet meer dan 1 ml.
16. Verwijder de verstuiver van de gewrichten en plaats deze in een pan met 2% Buraton minimaal 2 uur, meestal ontsmetting gebeurt O / N. Daarna dragen de vernevelaar om een ​​frisse pan en goed naspoelen met water. Verlaat vernevelaar aan de lucht drogen.
17. Open de aerosol kamer en dieren naar hun kooien. Zak de manden in autoclaafzakken en autoclaaf. Veeg de oppervlakken van de binnenkant van de aerosol kamer met 2% Buraton. OPMERKING: Om veiligheidsredenen, een aangedreven luchtzuiverend masker moet worden tijdens deze procedure gedragen.
18. De resterende 500 pl van de suspensie mycobacteriële (zie stap 1.3) plaat 10-voudige verdunningen van een technische drievoud (3 x 100 pi) op ​​7H11 agarplaten.

2. Controleer Opname van Gewenste CFU in Longen

Een dag na aerosol infectie van proefdieren bepalen de bacteriële loadvertentie in de longen van de aangewezen controle dieren om de opname van de gewenste CFU controleren. LET OP: We meestal wijzen een extra groep van 3-5 muizen voor dag 1 CFU vastberadenheid.

Om het verloop van Mtb infectie in de tijd te volgen, kan de mycobacteriële weefsel lasten worden onderzocht door platen seriële verdunningen van hele orgel homogenaten voor CFU vastberadenheid. De long is de primaire plaats voor ziekte manifestatie tuberculose echter milt, lever en lymfeknopen meestal dienovereenkomstig geanalyseerd. De verdunningen worden uitgeplaat afhankelijk van de verwachte mycobacteriële lading in de organen, die afhangen van de initiële inoculum (lage dosis versus hoge dosis), die aanleiding geeft tot verschillende bacteriële belasting in weefsel, en op het orgaan en tijdstip te geanalyseerd. Bij lage dosis infectie, de bacteriële verontreiniging van Mtb H37Rv in de longen bereikt meestal een plateau tussen dag 25-30.

1. Plaats gedood dieren (Euthanasie: CO ₂ stikken ofterminale anesthesie) op absorberend papier op een dissectie boord in een klasse II bioveiligheid kast en desinfecteren muizen met 70% ethanol. NB: 70% alcohol is alleen aan de oppervlakte ontsmetting en zal Mtb niet doden.
2. Maak een kleine incisie in het midden van de buik en trek de muis huid boven het hoofd.
3. Open de buik en de borstkas met chirurgische schaar en verwijder de thoraxwand, zodat de longen toegankelijk zijn.
4. Verwijder de longen en over in een 15 ml buis met homogenisatiebuffer (steriel water / 1% v / v Tween 80/1% gew / vol albumine).
5. Met behulp van de zuiger van een 5 ml spuit stam longen door 100 um zeef in een kleine petrischaal.
6. Flush zeven meerdere keren met een pipet 1 ml voorzien van een barrière tip en distribueren van de long homogenaat onder 8 agar platen (ca. 250 pl / plaat;. Ervoor zorgen dat ze een goed gedroogde oppervlak).
7. Plaat voorzichtig de monsters met behulp van wegwerp spreaders die in 2% worden verwijderdBuraton.
8. Verlaat agar platen te drogen in de kast. Seal elke plaat met parafilm, wikkel in aluminiumfolie en incubeer rechtop bij 37 ° C gedurende ten minste 4 weken.

3. Bouw van Escape-proof Mosquito Cages

Knaagdier Plasmodium stammen zijn niet schadelijk voor de mens. Echter, aangezien Mtb-geïnfecteerde muizen zijn de ontvangers van de parasiet en werk wordt gedaan onder BSL 3 voorwaarden, voorzorgsmaatregelen zijn nodig om te voorkomen dat de muggen ontsnappen hun kooien. Afhankelijk van de geplande infectie regime, autoclaveerbaar en herbruikbare metalen frame kooien of zelfgemaakte disposable kooien worden gebruikt. De laatste twee worden aanbevolen als door beet infectie van proefdieren nodig is door een bepaald aantal muggen per muis worden uitgevoerd. Als zelfgemaakte kooien zijn nodig op kooien exacte specificaties als de gezondheid van de muggen en de veiligheid van het laboratorium afhankelijk van hun sound constructie (figuur 2).

1. Neem een doos, zoals een half-pint ijs karton of papier koffiekopje (figuur 2).
2. Snijd een kleine opening in de zijkant van de doos en dek af met een dubbele laag van latex met een gleuf gesneden in elk stuk een beveiligde entree voor de muggen te creëren. OPMERKING: De opening heeft een totale afmeting van 2 cm x 2 cm, de slang (aspirator apparaat) dat we te brengen en / of te-out muggen is een gemodificeerde 15 ml Falcon buis verbonden met een vacuümpomp en dus dient als een aspirator met een diameter van 1,5 cm.
3. Tape een stuk filterpapier aan de binnenkant onderkant van de doos om te genieten van druppels.
4. Sluit ijs bekers met een net (dubbele laag nylon mesh, maat 1 mm x 1 mm) en bevestig aan de doos van tape en elastische band.
5. Voor infectie experimenten waarbij bepaalde aantallen muggen per muis zijn nodig op kooien met 10-15 geïnfecteerde muggen, die elk idealiter een avdelde van 10.000 wildtype speekselklier P. berghei sporozoïeten.
6. Idealiter verhongeren muggen gedurende 24 uur voorafgaand aan het uitvoeren van de bloedmaaltijd.

4. Malaria Infectie van Muizen door muggenbeet

Het knaagdier malariaparasiet hier gebruikt is P. berghei echter elk ander knaagdier Plasmodium stam van belang kan worden gebruikt. Besmettelijke muggen krijgen voor sporozoiet transmissie de gehele levenscyclus van de parasiet wordt gehandhaafd in zowel de gewervelde gastheer (muis) en de mug vector. Parasiet onderhoud wordt uitgevoerd in een insectary uitgevoerd. Voor natuurlijke transmissie-experimenten, moet het minimum aantal sporozoïeten per speekselklier niet minder dan 10.000. Voor gedetailleerde protocollen op parasiet onderhoud verwijzen wij naar Methods in Malaria Research door Moll et al.., 2013.

1. Verdoven naïeve muizen of dieren preinfected gedurende 40 dagen met Mtb met ketamine (100 mg / kg)en xylazine (7 mg / kg) oplossing door intraperitoneale injectie (200 pl / muis). Opmerking: De tijd tussen Mtb en Plasmodium infectie kan worden aangepast afhankelijk van de onderliggende vraagstelling. Evenzo kan de volgorde van de pathogeen uitdagingen worden teruggedraaid, kan ie muizen worden blootgesteld aan besmettelijke muggenbeet voorafgaand aan Mtb infectie.
2. Plaats verdoofd muizen op de verrekening van de mug kooien (een muis per mug kooi voor toegezegde mug muis verhouding) en laat de muggen te voeden door het membraan gedurende 10-15 minuten. OPMERKING: De aanwezigheid van bloed in de mug ingewanden impliceert voeden en dus sporozoieten transmissie.
3. Transfer muizen terug in hun kooien en begeleiden voortdurend totdat ze wakker worden uit anesthesie. OPMERKING: Plaats muizen op keukenpapier en niet op beddengoed (verstikkingsgevaar) en warm houden (plaats nauw samen en geldt voor instellingen met een papieren handdoek).
4. Dood de muggen door bespuiten met 70% ethanol of andere desinfectantia door de nettoing van de kooi. Autoclaaf kooien en gooi als wegwerp werden gebruikt.

5. Monitoring parasitemia

1. Punctie staart aderen aan het einde met een naald en het verzamelen van een druppel bloed aan elk uiteinde van een glijbaan.
2. Gebruik een andere dia naar een druppel bloed te trekken dan de helft van de lengte van de dia. Flip over de strooier aan de andere kant gebruiken voor de tweede uitstrijkje. Verlaat dia aan de lucht drogen.
3. Giemsa
   1. Plaats de glaasjes in houders glijbaan en bevestig de bloeduitstrijkjes door korte onderdompeling in absolute methanol. OPMERKING: Door het gebruik van glaswerk op minimum moet worden beperkt in de BSL 3 gebruiken we polypropyleen cuvetten voor alle oplossingen.
   2. Dompel de uitstrijkjes in Giemsa (1:10 in gedemineraliseerd water). Na 10 min, dompel de dia's in en uit kleuring cuvetten gevuld met gedemineraliseerd water een paar keer om weg te spoelen het overtollige vlek.
   3. Tenslotte drogen dia verticaal.
4. ALTERNATIEVE VLEK: Wright & #180; s vlek
   1. Los vlek Wright bij een concentratie van 1 mg / ml in methanol.
   2. Filtreer door vouwfilter voor gebruik.
   3. Dompel de bloeduitstrijkjes in kleuring oplossing en incubeer gedurende 4 minuten (NB: methanol fixatie van uitstrijkjes is niet nodig omdat de kleuring oplossing methanol is gebaseerd).
   4. Was door spoelen slides in gedeïoniseerd water zoals hierboven beschreven en laat dia aan de lucht drogen.
   5. Zodra vlek Giemsa / Wright 's is voltooid, voorzichtig overbrengen alle gebruikte reagentia in een-Buraton met pot beschikking.
5. Bloeduitstrijkje analyse
   1. Analyseer gebrandschilderde bloeduitstrijkjes met lichtmicroscopie bij een 100-voudige vergroting met olie-immersie.
   2. Telling geïnfecteerde en geïnfecteerde erytrocyten in een gebied van de bloedvlek waar erytrocyten zijn gerangschikt in een monolaag.
   3. Om een ​​goed gedefinieerde parasitemie bereiken telling tenminste 10 verschillende gezichtsveld weergeven van een erytrocyt monolaag.
   4. Calculat de relatieve parasitemie (in%) door deling van het aantal geparasiteerde erytrocyten door het aantal erytrocyten en vermenigvuldigen met 100.

Resultaten

Infectie van muizen met Mtb en P. berghei via de natuurlijke route, bijvoorbeeld aerosol en mugbeet respectievelijk resulteert in consistente en reproduceerbare infectie van dieren (Tabel 1) ^1. We kunnen controleren succesvolle infectie en het verloop van zowel malaria en tuberculose door bepaling van de initiële gebeurtenis (prepatency) en het aantal parasieten in het bloed (P. berghei parasitemie) en de last van Mtb in verschillende organen, respectievelijk. Een voorbeeld van succesvolle malariaparasiet overdracht van besmettelijke mugbeet wordt getoond in Tabel 1 en Figuur 3. Voeden van 10-sporozoieten geïnfecteerde muggen op elke muis resulteerde in een 100% infectie zoals 4-5 dagen later (Tabel 1 en Figuur 3A) bevestigd door de aanwezigheid van bloed-stadium parasieten. Belangrijk vinden we soortgelijke aantal parasieten in het bloed van individuele muizen van dezelfde experimentele grOUP, wat aangeeft dat sporozoiet overdracht door muggen bijten resulteert in een consistente en reproduceerbare infectie. Door het vergelijken van de prepatency in naïeve controle muizen met dat in het Mtb-coinfected dieren, kunnen we zien dat prepatency is iets vertraagd in muizen die waren preinfected met Mtb (Tabel 1, Figuur 3B) ^1. Zoals we al eerder ¹ hebben gemeld, kunnen we de impact van Mtb co-infectie op het verloop van malaria door dagelijkse controle parasitemia in Giemsa-gekleurde bloeduitstrijkjes bepalen, zoals weergegeven in figuur 3B.

Infectie van muizen met Mtb door gebruik van een inhalatie belichtingssysteem resultaten succesvolle afzetting van bacteriën in de longen met een relatief lage variabiliteit tussen individuele muizen (Figuur 4A). We kunnen mycobacteriële ladingen volgen in de longen en andere organen van de rente over de tijd door CFU vastberadenheid. Een voorbeeld voor de mycobacteriële lading in longen vanMtb geïnfecteerde C57BL / 6 muizen in afwezigheid of aanwezigheid van P. berghei wordt getoond in figuur 4B.

Tabel 1. Prepatency na sporozoiet overdracht door muggen bijten. Alle muizen ontwikkeld bloed-stadium infecties na natuurlijke overdracht van P. berghei sporozoites door muggenbeet. Aangepast van ¹ PLoS ONE, 7 (10), e48110 met toestemming.

Experimentele muis-groep (C57BL / 6)	Daag door 10 besmettelijke muggenbeten	Aantal bloed-stadium positieve dieren / Aantal dieren per groep	Mean prepatency [d]
naïeve	P. berghei	7/7	4,4
Mtb besmet	P. berghei	7/7	5,5 d>

Figuur 1. Algemeen schema van de experimentele procedure. Worden C57BL / 6 muizen blootgesteld aan Mtb-bevattende aerosol druppels in een Glas-Col aerosol kamer. Een dag na infectie aerosol wordt de opname van Mtb geverifieerd door analyse CFU van de longen. 40 dagen na MTB challenge (als tuberculose chronisch is geworden in de geïnfecteerde muizen), dieren worden blootgesteld aan P. berghei besmette muggen. Om succesvol sporozoiet transmissie te bevestigen en om het verloop van Plasmodium infectie volgen, wordt parasitemia dagelijks gevolgd in Giemsa-gekleurde bloeduitstrijkjes beginnen 3 dagen na de muggenbeet.

/ Files/ftp_upload/50829/50829fig2highres.jpg "src =" / files/ftp_upload/50829/50829fig2.jpg "/>
Figuur 2. Schets van een mug kooi. Worden Infectious muggen vervat in een doos, zoals een half-pint ijs doos. Een kleine opening wordt gesneden in de zijkant van de doos en bedekt met een dubbele laag van latex met een gleuf gesneden elk stuk een veilige toegang voor de muggen creëren. Een stukje filtreerpapier wordt geplakt aan de binnenkant onderkant van de doos om te genieten van druppels. Ijs bekers worden afgesloten met netten (Nylon netwerk) die naar de doos wordt vastgesteld door tape en elastische band.

Figuur 3. Bloed parasitemia. A) Voorbeeld van een Wright `s lood bloeduitstrijkje toont geparasiteerde erytrocyten (Schaal bar, 20 & #181;. M.) B) parasitemia in muizen bloed werd gecontroleerd door het analyseren van de dagelijkse Giemsa gekleurd bloeduitstrijkjes. Coinfected muizen een verminderde parasitemie in vergelijking met Plasmodium enkele geïnfecteerde muizen (n = 10); resultaten worden getoond als gemiddelden ± SD, *** p <0,001. Herdruk van ¹ PLoS ONE, 7 (10), e48110 met toestemming.

Figuur 4. Detectie van Mtb in de longen. C57BL / 6 muizen werden aerosol geprikkeld met 100 CFU van Mtb en 40 dagen later geïnfecteerd met P. berghei door muggenbeet. A) Een dag na aerosol infectie van de opname van het gewenste aantal Mtb werd geverifieerd door plating hele longhomogenaten voor CFU bepaling. B) BacteriënL-belastingen op het moment van co-infecties werden bepaald in de longen lysaten van 3 muizen via CFU analyse (Mtb d40/d0). 12 dagen na co-infectie, werden long lysaten plated voor CFU analyse van de impact van Plasmodium coinfection op Mtb controle te bepalen. Merk op, dat Mtb aantallen in de longen verhoogd tijdens co-infectie met P. berghei NK65. X-as voor de etikettering: na Mtb -infection/time na co-infectie. Aangepast van ¹ PLoS ONE, 7 (10), e48110 met toestemming.

Discussie

We beschreven hoe muizen productief kan worden besmet met Mtb en P. berghei via hun natuurlijke routes van infectie. We passen gevestigde infectie protocollen experimentele tuberculose of malaria ^{13 12} bestuderen en onlangs hen genomen maatregelen om coinfection tussen Mtb en Plasmodium studeren in het muismodel ^1.

De meest kritische stappen voor een succesvolle infectie is de transmissie van zowel pathogenen in de gewenste cijfers. Mycobacteriële voorraden mag niet ouder dan 2 jaar, omdat ze levensvatbaarheid zullen na verloop van tijd, en de oorspronkelijk vastgestelde titer van de voorraden zal waarschijnlijk niet meer accuraat zijn. Daardoor zou infectie doses veel lager dan verwacht. Daarom moet CFU titers van stamculturen om de paar maanden worden bepaald. Even belangrijk is de gestandaardiseerde teelt en productie van Mtb voorraden in de eerste plaats. Kweekomstandigheden zoalsmedium, supplementen, tijd en volume moeten worden gestandaardiseerd om te kunnen vergelijken van gegevens uit experimenten met verschillende aandelen van Mtb. Mycobacteriën neiging om klonteren in cultuur, daarom is het belangrijk om kweekomstandigheden houden gestandaardiseerd, oogst bacteriën gelijktijdig groeifase en resuspendeer vaak tijdens aliquoteren. Anders is er een grote variatie in CFU titers en infectie uitkomst kan zijn.

De generatie van homogeen besmette muggen batches is een cruciale stap. Aangezien verschillende muggen voeden elke individuele muis, is het belangrijk dat alle muggen gebruikt voor een infectie experiment uit dezelfde batch en dat uitsluitend partijen waar meer dan 90% muggen besmet worden gebruikt.

Het huidige model kan worden gebruikt om immuunreacties en modulaties in coinfected gastheer ontleden door te vergelijken met de immuunresponsen bij enkele geïnfecteerde gastheren. We kunnen toepassen various gevestigde methodologieën zoals histologie, immunohistochemie, cytometrie analyse van immuuncelpopulaties of PCR en ELISA voor cytokine en chemokine detectie om het weefsel of lichaamsvloeistoffen plaats. Opgemerkt zij, dat deze muismodellen hebben bepaalde beperkingen. Overwegende dat de meerderheid van de mensen die besmet zijn met Mtb ontwikkelen van een latente infectie met geen tekenen van klinische symptomen, muizen ontwikkelen een chronische ziekte met progressieve longpathologie. Toch C57BL / 6 muizen zijn relatief goed bestand tegen Mtb infectie en niet ontwikkelen klassieke granulomen zoals waargenomen in tuberculosepatiënten mens. Hierdoor immunopathologische reacties in de muis weerspiegelen niet latent of actieve menselijke tuberculoseziekte behoren. Ondanks de discrepantie tussen latente en chronische ziekten bij de mens en de muis, zijn muizen uitgebreid gebruikt om gastheer factoren die Mtb-infectie onder controle en zijn waardevolle en onmisbare hulpmiddelen te onderzoeken identificeren en te bestuderenimmuunresponsen bij infectieziekten. Belangrijk gevoeligheid voor Mtb infectie varieert aanzienlijk gebruikte inteelt muizenstammen en gevoelige stammen DBA of C3H kunnen in co-en single-infectie studies. Verder kunnen naast de pathogene species hierin beschreven andere Mycobacterium species plaats (bijvoorbeeld klinische isolaten) worden gebruikt. Ook, terwijl er geen enkele malaria model repliceert alle aspecten van de ziekte bij de mens verschillende muismodellen hebben sterk lijken op de verschillende aspecten van natuurlijk verworven menselijke malaria-infectie. Bijvoorbeeld, P. berghei ANKA en P. yoelii YM/17XL worden op grote schaal bestudeerd modellen van menselijke (P. falciparum-geïnduceerde) ernstige malaria, met P. berghei ANKA wordt beschouwd als een uitstekend model voor menselijke hersen malari s ^14,15. P. berghei NK65 is een uitstekend model voor hyperparasitemie en acute malaria anemie, en is onlangsbeschreven als een experimenteel model voor malaria-gerelateerde acute respiratory distress syndrome (MA-ARDS ^16). Met behulp van de beschreven coinfection model, konden we recent aantonen dat gelijktijdige P. berghei NK65 infectie verergert chronische tuberculose ^1.

Naast het gebruik van verschillende knaagdieren malariaparasieten, kan de volgorde en timing van infectie gebeurtenissen worden aangepast afhankelijk van de onderliggende vraagstelling. Ter plaatse kan gelijktijdige Plasmodium infecties zich op het moment van Mtb infectie of later verkregen zijn. In beide gevallen zal de immuunrespons op Mtb en Plasmodium kunnen anders worden beïnvloed. Daarom kunnen muizen worden geïnfecteerd met Plasmodium sporozoieten voor of na Mtb infectie. Bovendien kunnen muizen op verschillende tijdstippen worden aangevochten plaatsen Mtb infectie om de impact van de Plasmodium-geïnduceerde immuunrespons op acute versus chronische beoordelentuberculose. Belangrijk, bij het ​​kiezen van een malariaparasiet voor het bestuderen van malaria-tuberculose co-infectie, moet men zich ervan bewust dat sommige knaagdier Plasmodium spanningen veroorzaken acute ziekte in bepaalde muizen en bezwijken voor infectie in slechts enkele dagen of weken, terwijl Mtb veroorzaakt chronische en bij immunocompetente langdurige infecties muizen. Vandaar, de timing van co-infecties is cruciaal om tot een vroegtijdige dood van proefdieren te vermijden.

De modulatie van de immuniteit van de gastheer door de gelijktijdige infectie met verschillende pathogenen soort blijft slecht begrepen. Onze experimentele coinfection model geeft een krachtig hulpmiddel om Mycobacterium onderzoeken - Plasmodium interactie met het immuunsysteem van een coinfected gastheer en zal bijdragen aan ons begrip hoe co-infecties kunnen beïnvloeden pathogenese, ziekte uitkomst, vaccinatie, immunodiagnostiek, en therapie.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Buraton	Schülke		active ingredients: aldehyds (formaldehyde, glutaraldehyde, oxalaldehyde, ethyl hexanal)
Middlebrook 7H9	Sigma	M0178	Voor Mtb bouilloncultures
Middlebrook 7H11	BD Biosciences	283810	Agar medium voor Mtb-kweek
Middlebrook OADC-verrijkingsmedium	BD Biosciences	212240	Voegen aan 7H9 en 7H11 voor Mtb-kweek
Kleurschotel	Science Services	E62542-12
24-schuifhouder met handvat	Science Services	E62543-06
Giemsas Azur-Eosin-Methyleenblauw oplossing	Merck Millipore	109204
Wright´s-kleuring	Sigma	W0625
Inhalatie-expositiesysteem	Glas-Col
Verstuitver	Glas-Col
Hoorntjes	Häagen-Dazs		Gebruikt als muggenkooitjes
Mugenkooitjes met metalen frame	BioQuip Products	1450A