Methodenartikel

Productie en zuivering van niet-Replicatieve Canine adenovirus type 2 afgeleide vectoren

6.9K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/50833

⸱

3 december 2013

 ,  ,  , 
1INSERM UMR 1043, CNRS UMR 5282, Université Toulouse 3, 2UMR Viroligie, INRA ENVA ANSES

In dit artikel

Samenvatting

De afgelopen 15 jaar hebben honden-adenovirus type 2 (CAV2)-afgeleide vectoren hun efficiëntie bewezen om cellen in vitro en in vivo te transduceren en worden ze veel gebruikt voor vaccinatie en gentherapie. Hier beschrijven we een procedure om CAV2-vectoren te construeren, produceren en zuiveren, wat leidt tot virale suspensies met een hoog titer.

Samenvatting

Adenovirus (Ad) afgeleide vectoren zijn op grote schaal gebruikt voor korte of lange termijn genoverdracht, zowel voor gentherapie als voor vaccintoepassingen. Vanwege de frequente reeds bestaande immuniteit tegen het klassiek gebruikte humane adenovirus type 5, is hondenadenovirus type 2 (CAV2) voorgesteld als een alternatieve vector voor humane genoverdracht. De goed gekarakteriseerde biologie van CAV2, samen met de gemakkelijke genetische manipulatie, bieden grote voordelen, met name voor genoverdracht naar het centrale zenuwstelsel, of voor het induceren van een breed scala aan beschermende immuunresponsen, van humorale tot cellulaire immuniteit. Tegenwoordig vertegenwoordigt CAV2 een van de meest aantrekkelijke niet-menselijke adenovirussen voor gebruik als vaccinvector. Dit protocol beschrijft een eenvoudige methode om recombinante CAV2-vectoren te construeren, produceren en titeren. Na het klonen van de expressiecassette van het gen van belang in een shuttle-plasmide, wordt het recombinante genomische plasmide verkregen door homologe recombinatie in de E. coli BJ5183 bacteriestam. Het resulterende genomische plasmide wordt vervolgens getransfecteerd in hondenniercellen die de complementerende CAV2-E1-genen (DK-E1) tot expressie brengen. Een virale amplificatie maakt de productie van een groot viraal stock mogelijk, die gezuiverd wordt door ultracentrifugatie door cesiumchloridegradiënten en ontzilt door middel van dialyse. De resulterende virale suspensie heeft routinematig een titer van meer dan 1010 besmettelijke deeltjes per ml en kan direct in vivo worden toegediend.

Inleiding

In de afgelopen decennia hebben adenovirus- (Ad-) afgeleide vectoren hun effectiviteit bewezen voor gentherapie en vaccinatie, evenals in oncolytische virotherapie 1. Ads zijn niet-omhulde icosaëdrische virussen van de Adenoviridae-familie, die zijn geïsoleerd uit zoogdieren, vogels, reptielen, amfibieën en vissen. Sinds hun ontdekking in 1953 zijn Ads intensief bestudeerd als modellen om virus/cel-interacties te bestuderen en, meer recent, als vector-gebaseerde gentransportsystemen 2. Inderdaad bieden op Ads gebaseerde vectoren veel voordelen, zoals hun brede gastheerbereik en goed gekarakteriseerde biologie, samen met de gemakkelijkheid waarmee ze genetisch gemanipuleerd en geamplificeerd kunnen worden voor grootschalige productie.

Om klinische moeilijkheden te overwinnen die verband houden met pre-existente immuniteit in menselijke populaties tegenover vectoren afgeleid van humane Ads 3, zijn wij en anderen begonnen om vectoren af te leiden van niet-menselijke Ads 4. Bovendien lijken niet-menselijke adenovirale vectoren meer aangepast te zijn voor massale vaccinatie in de veterinaire geneeskunde dan de klassiek gebruikte adenovirustype 5 (Ad5), omdat ze meer voldoen aan veiligheids- en beveiligingsvereisten tijdens de risicobeoordeling door de nationale regelgevende autoriteiten. Aan het einde van de jaren 1990 beschreven we de eerste recombinante CAV2 als een niet-menselijke alternatief voor vectoren afgeleid van Ad5 5. Sindsdien hebben talrijke studies het potentieel van CAV2-vectoren voor therapeutische of antigene genoverdracht bevestigd (voor reviews 6,7). Net als andere Ads zijn CAV2-afgeleide vectoren stabiel en kunnen ze in hoge titers worden geproduceerd, wat hun gebruik in vivo vergemakkelijkt. Ze zijn ook veilig, omdat ze niet integratief zijn, hoewel ze langdurige transgeenexpressie in vivo mogelijk maken (>1 jaar) 8. Opmerkelijk is dat CAV2-vectoren, beter dan humane Ads-serotypen, zeer neurotrofisch zijn gebleken, met een zeer efficiënte retrograde transport in axonen 9,10. Deze intrinsieke eigenschap heeft geleid tot het idee om recombinante CAV2-vectoren te gebruiken om neuronen van specifieke hersengebieden te transduceren die moeilijk toegankelijk zijn voor lentivirale vectoren, tot nu toe algemeen gebruikt voor genoverdracht in het centrale zenuwstelsel 11.

Hier beschrijven we een eenvoudig en klassiek protocol om niet-replicatieve CAV2-vectoren af te leiden van de Manhattan-stam te construeren, produceren en zuiveren. Recombinante CAV2-genomen worden geconstrueerd door het gewenste gen van belang (GOI) te klonen in een cassette stroomafwaarts van de cytomegalovirus (CMV) vroege promotor, die een ubiquiteit expressie biedt. CAV2-vectoren hebben een kloombekwaamheid van ~4,2 kbp, wat het mogelijk maakt grote cDNA te exprimeren. In een tweede stap wordt deze expressiecassette door homologe recombinatie in plaats van de E1-regio van het CAV2-genoom geplaatst, wat leidt tot een niet-replicatief virus (dlE1), zoals oorspronkelijk beschreven door Chartier et al.12 Uiteindelijk worden virale deeltjes geproduceerd na transfectie van het genomische plasmide in een CAV2-E1-expresserende hondenniercellijn (DK-E1) en worden ze serieel geamplificeerd voorafgaand aan concentratie en zuivering van virale stockoplossingen. De hier beschreven methode maakt gebruik van een tweestaps ultracentrifugering in cesiumchloride (CsCl) gradiënten, wat verrijking van infectieuze deeltjes met een hoge uiteindelijke titer mogelijk maakt (gewoonlijk meer dan 1010 infectieuze deeltjes per ml). De virale suspensie wordt vervolgens door chromatografie door wegwerpbare Sephadex G-25 kolommen ontzilt, zodat deze uiteindelijk zuiver genoeg is om direct in vivo te worden gebruikt.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

1. Constructie van een niet-replicatief CAV2-genoomplasmide

Opmerking: alle plasmiden die in dit protocol worden beschreven, zijn eerder beschreven7 en zijn op aanvraag verkrijgbaar.

  1. Cloneer het GOI in het pShuttle-plasmide, met behulp van geschikte restrictie-enzymen, om pShuttle-GOI te genereren (Figuur 1A).
  2. Verter 2 μg van pShuttle-GOI door AscI/PacI. De vertering geeft het Shuttle-GOI-fragment vrij (~2,9 kbp + GOI ORF-sequentie) van de plasmidebackbone (2,8 kbp).
  3. Zuiver het Shuttle-GOI-fragment na agarosegelelektroforese, met behulp van NucleoSpin Gel en PCR Clean-up kit.
  4. Parallel hieraan verteer 1 μg van het pCAV2 genoomplasmide door SwaI. Het pCAV2-plasmide bevat een uniek SwaI-snijplaats in de E1-regio (Figuur 1B). Verhit-inactiveer dit restrictie-enzym bij 65 °C gedurende 20 min.
  5. Transformeer competente E. coli BJ5183 bacteriën met 500 ng van het gezuiverde Shuttle-GOI-fragment en 100 ng van gelinealiseerd pCAV2-plasmide voor homologe recombinatie (Figure 1B). Verspreid op LB-Amp platen. Bebroed platen bij 37 °C gedurende minimaal 20 uur.
  6. Voer PCR-analyse rechtstreeks uit op bacteriële kolonies met EmeraldAmp master mix met voorwaartse (5'-CACGAGGCCCTTTCGTCTTCAA-3') en omgekeerde (5'-GCGGTAGTTTATCACAGTTAAATTGC-3') primers, onder de volgende cycluscondities: 10 min bij 95 °C (voor één cyclus), 95 °C gedurende 1 min; 58 °C gedurende 1 min; 72 °C gedurende 1 min/kbp (voor 39 cycli), en tenslotte 5 min bij 72 °C. Een product van 1 kbp + GOI ORF-sequentie wordt versterkt vanuit pCAV-GOI positieve klonen, terwijl geen PCR-product kan worden gedetecteerd met negatieve klonen.
  7. Inoculeer ten minste twee positieve kolonies per nacht in 5 ml LB-amp-medium bij 37 °C in een shaker (220 rpm).
  8. Extracteer plasmide-DNA's met behulp van Nucleospin plasmide kit. Transformeer competente E. coli DH5α bacteriën met een aliquot van elke DNA-prep. Verspreid bacteriële suspensie op LB-Amp platen en bebroed overnacht bij 37 °C.
  9. Inoculeer twee kolonies van elke positieve klonering per nacht in 3 ml LB-amp-medium bij 37 °C in een shaker (220 rpm). Extracteer plasmide-DNA met behulp van Nucleospin plasmide kit.
  10. Verteer het resulterende DNA en het ouderlijke pCAV2-plasmide (als controle) met NdeI. Het restrictiepatroon van het ouderlijke pCAV2 is 14,8 kbp, 9 kbp, 7,9 kbp en 1,6 kbp. De GOI-expressiecassette is ingezet binnen het 7,9 kbp-fragment en bevat ten minste één NdeI-snijplaats, d.w.z. één in de cassette en de potentiële plaatsen die aanwezig zijn in de GOI.
  11. Selecteer positieve constructies en ga verder met stap 2 met ten minste 2 onafhankelijke klonen.

2. Transfectie van recombinant CAV2-genoomplasmide in DK-E1-cellen

Opmerking: CAV2-afgeleide niet-replicatieve vectoren zijn genetisch gemodificeerde organismen geclassificeerd als Bioveiligheidsniveau 2 (BSL-2), terwijl hun gebruik op diermodellen is geclassificeerd als BSL-1. Gebruik alstublieft de juiste beveiligingsmaatregelen en afvalverwerkingsmaatregelen, inclusief persoonlijke beschermingsmiddelen, en werk onder BSL-2 laminaire stroomkappen.

  1. Een dag voor de transfectie, zaai DK-E1-cellen op een 6-well plaat. Kweek cellen bij 37 °C en 5% CO2, in Dulbecco's Gemodificeerd Eagle Medium (DMEM) met hoge glucose, bevattende 7% hitte-inactiveerd foetaal calf serum (FCS), 1 mM natriumpyruvaat, en 100 U/ml penicilline/100 μg/ml streptomycine. Cellen moeten 70-80% confluënt zijn voor transfectie.
  2. Verteer 2 μg van pCAV-GOI-plasmide met AscI, om de niet-virale sequentie van het plasmide vrij te geven. Controleer het resulterende restrictiepatroon door middel van 0,8% agarosegelelektroforese. Vertering moet een ~31 kbp-fragment opleveren dat het recombinante genoom bevat en een 2 kbp-fragment dat overeenkomt met de plasmidebackbone.
  3. Meng verteerde DNA met 200 μl Jet Prime Buffer door 10 sec te vortexen. Voeg 4 μl Jet Prime toe en meng door 10 sec te vortexen. Draai kort rond om druppels te verwijderen en incubeer gedurende 10 min bij kamertemperatuur.
  4. Voeg de transfectiemix druppelsgewijs toe aan cellen. Schud de platen voorzichtig om de mix gelijkmatig te verdelen en incubeer bij 37 °C.

3. Propagatie van recombinant CAV2

  1. Een week na transfectie, verzamel cellen en cultuurmedium in een 15 ml polypropyleen buis. Ontwricht cellen door drie vries-dooicycli (-80 °C/37 °C) en verduidelijk het lysaal door centrifugatie gedurende 10 min bij 1.800 x g.
  2. Verzamel supernatant en bewaar bij -20 °C voor verdere viruspropagatie.
  3. Besmet een 80-90% confluënte

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

De productie van recombinante CAV2-vectoren is gebaseerd op basis- maar essentiële moleculaire biologische technieken. Alvorens virale vectoren kunnen worden geproduceerd, is het noodzakelijk om een recombinant CAV2-genoom te construeren dat een expressiecassette voor het transgen bevat. Deze constructie bestaat uit twee stappen: eerst wordt het gen van interesse (GOI) in een shuttle-plasmide gekloond als expressiecassette (i.e. met promoter en polyadenyleringssignaal). Dit functionele element wordt geflankeerd ...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

De eenvoudige methode die hierin wordt beschreven, aangepast van de goed gedocumenteerde Ad5-technologie, maakt de efficiënte productie van niet-replicatieve CAV2-vectoren mogelijk met een typische klooncecapaciteit van ongeveer 4,2 kbp. Wat betreft tijdoverwegingen, wordt een recombinant CAV2-genoom meestal in twee weken gegenereerd, terwijl het nog eens 5 weken zal duren om virale suspensies te versterken, zuiveren en titreren.

Hoewel de productie van de eerste batch CAV2-afgeleide vectoren ...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

Auteurs hebben niets te onthullen.

Dankbetuigingen

Dit werk werd financieel ondersteund door subsidies van INSERM, de CNRS, de Fondation pour la Recherche Médicale en de Agence Nationale pour la Recherche (ANR- 10-Blanc-1322) aan D.G-D; Het zevende kaderprogramma van de Europese Commissie aan B.K.; M.S. werd ondersteund door een postdoctorale beurs van FRM (programma "Equipe FRM 2009"); C.B. werd ondersteund door een postdoctorale beurs van UE, onder subsidieovereenkomstnummer 245266 (Orbivac).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
BeperkingsenzymenNew England BiolabsVerschillend
Jet Prime transfectiekitPolyplus114-01
DMEMGibco (Life Technologies)10567014
E. coli BJ5183 bacteriënAgilent200154
PD-10 ontzoutingskolomGE Healthcare17-0851-01
EmeraldAmp polymeraseTakaraRR320A
Nucleospin plasmidkitMacherey-Nagel740558.250
NucleoSpin Gel en PCR Clean-upMacherey-Nagel740609.50
14 ml buizen, Ultra ClearBeckman344060

Referenties

  1. Kaufmann, J. K., Nettelbeck, D. M. Virus chimeras for gene therapy, vaccination, and oncolysis: adenoviruses and beyond. Trends Mol. Med. 18, 365-376 (2012).
  2. Curr, Topics Microbiol. Immunol. 343, 195-224 (2010).
  3. Zak, D. E., et al. Merck Ad5/HIV induces broad innate immune activation that predicts CD8(+) T-cell responses but is attenuated by preexisting Ad5 immunity. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 109, 3503-3512 (2012).
  4. Paillard, F. Advantages of non-human adenoviruses versus human adenoviruses. Hum. Gene Ther. 8, 2007-2009 (1997).
  5. Ackermann, A., Guelzow, T., Staeheli, P., Schneider, U., Heimrich, B. Visualizing viral dissemination in the mouse nervous system, using a green fluorescent protein-expressing Borna disease virus vector. J. Virol. 84, 5438-5442 (2010).
  6. Bru, T., Salinas, S., Kremer, E. J. An update on canine adenovirus type 2 and its vectors. Viruses. 2, 2134-2153 (2010).
  7. Bouet-Cararo, C., et al. Canine adenoviruses elicit both humoral and cell-mediated immune responses against rabies following immunisation of sheep. Vaccine. 29, 1304-1310 (2011).
  8. Soudais, C., Skander, N., Kremer, E. J. Long-term in vivo transduction of neurons throughout the rat CNS using novel helper-dependent CAV-2 vectors. FASEB J. 18, 391-393 (2004).
  9. Deinhardt, K., et al. Rab5 and Rab7 control endocytic sorting along the axonal retrograde transport pathway. Neuron. 52, 293-305 (2006).
  10. Soudais, C., Laplace-Builhe, C., Kissa, K., Kremer, E. J. Preferential transduction of neurons by canine adenovirus vectors and their efficient retrograde transport in vivo. FASEB J. 15, 2283-2285 (2001).
  11. Peltekian, E., Garcia, L., Danos, O. Neurotropism and retrograde axonal transport of a canine adenoviral vector: a tool for targeting key structures undergoing neurodegenerative processes. Mol. Ther. 5, 25-32 (2002).
  12. Chartier, C., et al. Efficient generation of recombinant adenovirus vectors by homologous recombination in Escherichia coli. J. Virol. 70, 4805-4810 (1996).
  13. Reed, L. J., Muench, H. A simple method of estimating fifty percent endpoints. Am. J. Hyg. 27, 493-497 (1938).
  14. Segura, M. M., Puig, M., Monfar, M., Chillon, M. Chromatography purification of canine adenoviral vectors. Human Gene Ther. Methods. 23, 182-197 (2012).
  15. Segura, M. M., et al. A real-time PCR assay for quantification of canine adenoviral vectors. Journal of virological. 163, 129-136 (2010).
  16. Fernandes, P., et al. Bioprocess development for canine adenovirus type 2 vectors. Gene Ther. , (2012).
  17. Rinne, A., Littwitz, C., Bender, K., Kienitz, M. C., Pott, L. Adenovirus-mediated delivery of short hairpin RNA (shRNA) mediates efficient gene silencing in terminally differentiated cardiac myocytes. Methods Mol. Biol. 515, 107-123 (2009).
  18. Huang, B., Kochanek, S. Adenovirus-mediated silencing of huntingtin expression by shRNA. Hum. Gene Ther. 16, 618-626 (2005).
  19. Tordo, N., et al. Canine adenovirus based rabies vaccines. Dev. Biol. 131, 467-476 (2008).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Productie van virale vectorencesiumchloride zuiveringvirale titerbepalinghomologe recombinatievries dooi cycliimmunofluorescentie confocale microscopievirale amplificatiebereiding van virale stokkengentherapie toepassingen

Gerelateerde artikelen