Methodenartikel

In vivo herprogrammeren van volwassen lichaamscellen te Pluripotentie door overexpressie van Yamanaka Factors

15K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/50837

⸱

17 december 2013

 ,  ,  , 
1Nanomedicine Lab, UCL School of Pharmacy, University College London, 2Nanomedicine Lab, Faculty of Medical & Human Sciences, University of Manchester

In dit artikel

Samenvatting

Deze studie toont de herprogrammering van somatische cellen naar pluripotentie in vivo zonder de vorming van teratomen. We gebruikten hydrodynamische injectie in de staartader van plasmide-DNA dat codeert voor de Yamanka-factoren om de in vivo herprogrammering van volwassen hepatocyten in cellen met verbeterde pluripotentie te induceren.

Samenvatting

Geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPS) die het resultaat zijn van de herprogrammering van somatische cellen naar een pluripotente toestand door geforceerde expressie van gedefinieerde factoren bieden nieuwe mogelijkheden voor regeneratieve geneeskunde. Dergelijke klinische toepassingen van iPS-cellen zijn tot nu toe beperkt, voornamelijk vanwege de lage efficiëntie van de bestaande herprogrammeringsmethodologieën en het risico dat de gegenereerde iPS-cellen tumoren vormen bij implantatie.

We stelden ons voor dat de herprogrammering van somatische cellen naar pluripotentie in vivo zou kunnen worden bereikt door gentransfer van herprogrammeringsfactoren. Om cellen efficiënt in vivo te herprogrammeren, moeten hoge niveaus van de Yamanaka (OKSM) transcriptiefactoren worden geëxpresseerd in het doelweefsel. Dit kan worden bereikt door verschillende virale of nonvirale genvectoren te gebruiken, afhankelijk van het doelweefsel. In deze specifieke studie werd hydrodynamische staartvene-injectie (HTV) van plasmide-DNA gebruikt om de OKSM-factoren aan muishepatocellen te leveren. Dit leverde bewijs van in vivo herprogrammering van volwassen, somatische cellen naar een pluripotente toestand met hoge efficiëntie en snelle kinetiek. Bovendien werd er geen tumor- of teratoomvorming waargenomen in situ.

Er kan worden geconcludeerd dat het herprogrammeren van somatische cellen in vivo een potentiële aanpak kan bieden om snel, efficiënt en veilig verhoogde pluripotentie te induceren in vergelijking met protocollen die in vitro worden uitgevoerd, en kan in de toekomst worden toegepast op verschillende weefseltypes.

Inleiding

Ethische bezwaren over het gebruik van embryonale stamcellen zijn een van de beperkingen geweest in de ontwikkeling van stamcelonderzoek. De ontdekking door Yamanaka en collega's dat de geforceerde expressie van vier transcriptiefactoren (namelijk: Oct3/4, Klf4, Sox2, c-Myc (OKSM)) kon leiden tot in vitro herprogrammering van somatische cellen in pluripotente cellen, zogenaamde geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPS-cellen), heeft echter nieuwe kansen geopend. Virale1-5 en non-virale6-10 genoverdracht, eiwit-cytoplasmatische translocatie11,12 en miRNA13-16 transfectie behoren tot de verschillende methoden die tegenwoordig worden gebruikt om iPS-cellen te genereren. Desondanks lijden dergelijke herprogrammeringsmethodologieën aan verschillende problemen die hun translatie naar de klinische praktijk beperken, zoals: a) ernstige beperkingen in de efficiëntie van celherprogrammering; b) het overheersende gebruik van virale vectoren; c) lange en meertrapse protocollen voor kweekcondities; en d) het risico van tumorigeniteit door implantatie van de in vitro gegenereerde iPS-cellen17-20.

Genoverdracht van gedefinieerde transcriptiefactoren3-5 door retrovirussen is de meest gebruikte methode om somatische cellen te herprogrammeren. Het bevat echter de risico's van de mogelijkheid van insertionele mutagenese, stabiele transductie en langdurige proto-oncogene expressie21,22. Non-virale genoverdrachtsvectoren zoals plasmide-DNA6,7,23 of RNA10 levering met behulp van liposomen of elektroporatie zijn ook onderzocht. Hoewel veiliger in vergelijking met virussen, bieden deze vectoren aanzienlijk beperkte transductie en herprogrammeringsefficiëntie24,25 .

Een van de centrale dogma's van dit opkomende veld is dat in vivo implantatie van iPS-cellen zal leiden tot hun ongecontroleerde differentiatie en de vorming van een tumorachtige massa (teratoma), bestaande uit verschillende weefsels uit de drie verschillende kiembladen. Daarom is het concept van herprogrammering naar pluripotentie voornamelijk gericht geweest op in vitro manipulaties van primair geëxtraheerde somatische cellen (meestal fibroblasten). Zoals hierboven beschreven, lijdt dit principe echter aan lange en complexe celkweekprotocollen, inclusief meerdere rondes van behandeling (genoverdracht, groeifactoren, antibiotica, antioxidanten) die zelf de risico's op teratoomvorming of andere vormen van tumorigenese bij implantatie van de cellen kunnen verhogen24-28.

Wij stellen voor dat herprogrammering van volwassen somatische cellen in vivo door de tijdelijke overexpressie van de OKSM-transcriptiefactoren niet leidt tot de vorming van teratomen29. De methode om dat te bereiken zal afhangen van het bereiken van hoge niveaus van transcriptiefactorexpressie binnen het doelweefsel op de meest veilige mogelijke manier. In deze studie hebben we een gevestigde virusvrije genoverdrachtstechnologie geselecteerd die efficiënt de lever heeft getargeerd om cellen in vivo naar pluripotentie te herprogrammeren. Deze technologie omvat grootvolume, snelle hydrodynamicale staartveneninspuiting (HTV) van plasmide-DNA30,31. Hoge expressieniveaus van getransfecteerde genen kunnen worden bereikt in volwassen hepatocyten na deze non-virale genoverdrachtsmethode. Bovendien minimaliseert deze technologie de potentiële risico's van het gebruik van virale vectoren (bijv. permanente genomische insertie, insertionele mutagenese).

Protocol

1. In vivo Reprogramming van leverweefsel door HTV-toediening van pDNA

  1. Laat vrouwelijke Balb/C-muizen, 6 weken oud, een week acclimatiseren in de dierenfaciliteit voordat er enige procedure wordt uitgevoerd.
  2. Bereid 0,9% zoutoplossing in gedistilleerd water en filter door een 0,22 μm microfilter.
  3. Bereid een oplossing met 75 μg pCX-OKS-2A en 75 μg van pCX-cMyc plasmide DNA in 1,5 ml 0,9% zoutoplossing per muis. Opmerking: Het totale injectievolume moet tussen 8-10% van het totale lichaamsgewicht liggen.
    Opmerking: houd de muizen voorafgaand aan de injectie in een verwarmde kamer bij 37 °C tot de staartaderen gemakkelijk kunnen worden gevisualiseerd en uitgezet lijken.
  4. Induceer anesthesie met isofluraan voorafgaand (in de verwarmde kamer) en tijdens de injectie (met een anesthesiemasker).
  5. Toedien de pDNA-oplossing of zoutoplossingscontrole met een 27 G-sering door HTV-injectie. Opmerking: voor een succesvolle transfectie moet het totale volume in niet meer dan 5-7 sec worden geïnjecteerd.
  6. Controleer dat de dieren goed herstellen van de injectie.

2. Leverperfusie en isolatie van primaire hepactocyten voor qRT-PCR-studies

  1. Induceer op verschillende tijdstippen, waaronder 2, 4, 8, 12 en 24 dagen na HTV-injectie, diepe anesthesie met isofluraan.
  2. Spray 70% ethanol op de buik van het dier, maak een incisie door de huid op de ventrale middenlijn met chirurgische schaar en dissepeer de buikspierlaag om de ingewanden bloot te leggen.
  3. Snij het middenrif om de borstholte met schaar bloot te leggen en klem de cava-ader met vergrendelde pincetten.
  4. Verplaats de ingewanden naar rechts en de leverkwabben zodat zowel de inferieure cava als de poortader gemakkelijk toegankelijk zijn.
  5. Canuleer de inferieure cava-ader met een 22 G-katheter en snij de poortader door om overmatige druk te voorkomen.
  6. Begin de perfusie met 10 ml HBSS-buffer (Ca2+ en Mg2+ vrij, met bicarbonaat), voorverwarmd op 37 °C. Perfuseer de buffer langzaam met een 10 ml-sering, tot de lever wit wordt (3 min).
  7. Vervolg de perfusie met Lever Digest Medium, voorverwarmd op 37 °C, met een stromingssnelheid van 0,6 ml/min (gedurende 15 min) tot de lever gezwollen en los is. Opmerking: Overmatige vertering en perfusie kunnen hepatocyten of herprogrammeerde cellen beschadigen.
  8. Vervolg het experiment bij 4 °C.
  9. Verwijder de lever met een pincet na het doorknippen van de falciforme en coronaire ligamenten en was deze met Hepatocyte Wash Medium, terwijl u deze door een 100 μm celzeef haalt om een celsuspensie te verkrijgen.
  10. Verzamel de celsuspensie in 50 ml buizen en pas het volume aan tot 15 ml met Hepatocyte Wash Medium.
  11. Centrifugeer de celsuspensie bij 50 g gedurende 4 min. Houd de temperatuur op 4 °C. Gooi de supernatant weg (die Kupffer- en epitheelcellen bevat) en suspendeer het cellys in 10 ml Hepatocyte Wash Medium. Opmerking: Het cellys moet heel voorzichtig worden gesuspendeerd, hepatocyten zijn zeer fragiele cellen.
  12. Herhaal de centrifugatieprocedure in totaal drie keer en suspendeer het uiteindelijke lys in 10 ml Hepatocyte Wash Medium.
  13. Schat het aantal cellen met behulp van een optische microscoop en een hemocytometer.
  14. Bereid aliquots van 2 x 106 cellen, centrifugeer bij 300 x g om alle cellen te herstellen en gooi de supernatant weg.
  15. Op dit punt kan het cellys worden ingevroren en bewaard bij -20 °C tot verdere verwerking of direct worden gebruikt voor de RNA-extractie.

3. Genexpressiestudie van geïsoleerde hepatocyten voor upregulatie van pluripotente genen

  1. Extracteer RNA uit 2 x 106 cellen met een spinkolomkit volgens de instructies van de leverancier.
  2. Gebruik 1 μg van het geëxtraheerde RNA om een twee-staps qRT-PCR uit te voeren volgens de instructies van de leverancier.
  3. Gebruik de hepatocyten van de met zoutoplossing geïnjecteerde dieren als controle om de relatieve genexpressie van herprogrammering, pluripotentie en hepatocytenmarkers te corrigeren.

4. Flowcytometrie-analyse van verhoogde pluripotentie op eiwitniveau

  1. Voer op dag 1 en 4 na injectie leverperfusie uit en isoleer primaire hepatocyten zoals hierboven aangegeven.
  2. Pas de celdichtheid aan tot 1 x 107 cellen/ml en bereid 100 μl aliquots voor.
  3. Fixeer de cellen met BD Cytofix-fixeerbuffer en maak doorlaatbaar met 1x BD Perm/Wash-buffer.
  4. Incubeer de cellen gedurende 30 min met anti-muis OCT4-PerCP-Cy5.5 of anti-muis Nanog-PE.
  5. Voeg negatieve en isotypecontroles toe.
  6. Analyseer de gekleurde cellen met een CyAn ADP High Performance Research Flow Cytometer.

5. Immunokleuring van leversecties voor markeringen van pluripotentie

  1. Perfuseer de lever vier dagen na injectie zoals hierboven aangegeven, maar alleen met HBSS-buffer om het bloed uit het leverweefsel te verwijderen.
  2. Snij een stuk leverweefsel en dompel het in 2-methylbutaan (voorgekoeld in vloeibare stikstof) om door te gaan

Resultaten

Figuur 1 toont het overzicht van de procedure die de gentransfer van OKSM-coderende plasmiden naar de lever van muizen omvat en de verschillende technieken die zijn uitgevoerd om in vivo celreprogrammering te observeren. Na HTV-injectie van de plasmiden werd op dag 2 na injectie een significante toename in genexpressie van de getransfereerde reprogrammeringsfactoren (Oct3/4, Sox2, Klf4 en cMyc) op mRNA-niveau waargenomen. De expressie van deze factoren neemt na verloop van tijd af na de injectie, zoals getoond in Figuur 2a. Wat betreft de expressie van endogene pluripotentiemarkers (Nanog, Ecat1 en Rex1), waren hun niveaus op dag 2 en 4 na injectie significant verhoogd in vergelijking met die in hepatocyten van dieren die met saline waren geïnjecteerd, en keerden ze vanaf dag 8 terug naar de basiswaarden (Figuur 2b). Tegelijkertijd werd de dedifferentiatie van de hepatocytenpopulatie bevestigd door de downregulatie van hepatocyt-specifieke genen (Alb, Aat en Trf), die op dag 4 statistisch significant was en vanaf dag 8 de basiswaarden bereikte (Figuur 2d).

De expressie van Oct3/4 en Nanog op proteïneniveau werd onderzocht met flowcytometrie. Zoals getoond in Figuur 2c, wordt alleen Oct3/4 tot expressie gebracht op dag 1 na HTV-injectie, terwijl er voor de expressie van de endogene pluripotentiemarker Nanog tot dag 4 gewacht moest worden.

Het voorkomen van in vivo celreprogrammering werd verder bevestigd door immunohistochemische analyse van leverweefsels met anti-OCT4, anti-SOX2 en anti-Nanog antilichamen en door specifieke kleuring voor ALP-activiteit. Positieve cellen voor alle markers en enzymatische activiteit werden reproduceerbaar aangetroffen in de leverweefsels van OKSM-geïnjecteerde dieren, maar niet in de zoutoplossing-geïnjecteerde controles (Figuur 3).

De mogelijke toxische bijwerkingen en teratoomvorming door in vivo celreprogrammering via HTV-injectie van pDNA werden onderzocht door kwantificering van leverenzymgehaltes in serum, evenals H&E- en PAS-kleuring van leverweefselsneden over een periode van 120 dagen. Tot dag 2 werden voorbijgaande en niet ernstige tekenen van weefselschade waargenomen, maar daarna niet meer. Er werd gedurende de studieperiode geen vorming van teratomen of enig teken van dysplasie of morfologische veranderingen waargenomen (Figuur 4). Er waren gedurende de gehele studie bij geen van de dieren hepatische structurele of functionele afwijkingen, zoals bevestigd door albumine- en leverenzymgehaltes en glycogeenkleuring van weefselsneden (Figuren 4b en c).

In vivo injectie van herprogrammeringsfactoren, muisdiagram, plasmide, weefselanalyse, PCR, cytometrie.
Figuur 1. Schematisch overzicht van de in vivo herprogrammeringsprocedure en de analyse ervan. Het protocol bestaat uit twee hoofdfasen: (i) toediening van herprogrammeringsfactoren in vivo en (ii) weefselextractie en monsteranalyse. Klik hier om de figuur in een groter formaat te bekijken.

Genexpressieanalyse; staafdiagrammen met relatieve expressiegegevens over meerdere dagen; figuren a-d; wetenschappelijke resultaten.
Figuur 2. In vivo overexpressie van Yamanaka-transcriptiefactoren in de lever van volwassen muizen. Balb/C-muizen kregen via HTV-injectie uitsluitend 0,9% zoutoplossing, 75 μg pCX-OKS-2A en 75 μg pCX-cMyc in 0,9% zoutoplossing, en op dag 2, 4, 8, 12 en 24 werd er een RT-qPCR-analyse van hepatocyten uitgevoerd om de relatieve genexpressie te bepalen van: (a) getransfecteerde transcriptiefactoren (OKSM) en (b) endogene pluripotentiemarkers; (c) flowcytometrie-analyse van OCT3/4-positieve en Nanog-positieve cellen; (d) relatieve genexpressie van hepatocytmarkers zoals bepaald door RT-qPCR. Alle genexpressieniveaus werden genormaliseerd ten opzichte van de groep met HTV-injectie van zoutoplossing. (* p<0,05 geeft een statistisch significant verschil aan vergeleken met de groepen met HTV-injectie van zoutoplossing, verkregen via variantieanalyse en de paarsgewijze vergelijking van Tukey). Figuur aangepast van Yilmazer et al.29 Klik hier om de figuur in een groter formaat te bekijken.

Vergelijking via immunofluorescentiemicroscopie van OCT4, SOX2, NANOG in cellen behandeld met zoutoplossing versus OKSM.
Figuur 3. In vivo herprogrammering van cellen in leverweefsel van volwassen muizen via immunohistochemie. Balb/C muizen kregen via HTV-injectie enkel 0,9% zoutoplossing, of 75 μg pCX-OKS-2A en 75 μg pCX-cMyc in 0,9% zoutoplossing. Op dag 4 werden de levers geoogst en werden bevroren weefselcoupes gekleurd met anti-OCT4, anti-SOX2 of anti-Nanog antilichamen om de immunoreactiviteit te beoordelen, of met BCIP/NBT om de ALP-activiteit in het weefsel te bepalen (40X). De schaalbalken representeren 100 μm. Figuur aangepast naar Yilmazer et al.29 Klik hier om de figuur in een groter formaat te bekijken.

Leverhistologie, enzymgehaltes en albumine bij behandeling met saline versus OKSM, experimentresultaten.
Figuur 4. Het effect van in vivo celreprogrammering op de leverfunctionaliteit en histopathologie. Balb/C-muizen die via HTV waren geïnjecteerd met ofwel 75 μg pCX-OKS-2A en 75 μg pCX-cMyc in 0,9% saline, of enkel 0,9% saline. Op dag 2, 4, 8, 12, 50 en 120 werden leverweefsels en sera geïsoleerd en verwerkt voor: (a) H&E-kleuring; (b) gehaltes van leverenzymen; (c) gehaltes van albumine; (d) PAS-kleuring. Representatieve beelden zijn vastgelegd met lichtmicroscopie (10X). Schaalbalken representeren 100 μm. Figuur aangepast van Yilmazer et al.29 Klik hier om de grotere figuur te bekijken.

Discussie

Deze studie levert proof-of-principle bewijs van in vivo cel-herprogrammering naar pluripotentie na de efficiënte overdracht en overexpressie van de OKSM-factoren naar de lever van volwassen muizen. Met behulp van verschillende technieken zoals qRT-PCR, flowcytometrie, IHC of serumanalyse, werd het doelweefsel onderzocht om in vivo cel-herprogrammering te observeren. Zeer snel na de inductie van overexpressie van de OKSM-factor in het weefsel, werden pluripotentie-markers opgereguleerd op mRNA- en eiwitniveau (binnen 48 uur). Gedurende deze experimenten bleek dat tussen de 5-15% van de uit het weefsel geëxtraheerde cellen Nanog en Oct3/4 positief waren. Verder werden gedurende 120 dagen geen structurele of functionele afwijkingen in de lever waargenomen. Expressie van transgenen door HTV-injectie van plasmide-DNA in andere weefsels dan de lever (long, milt, nier en hart) is eerder gerapporteerd, maar de niveaus van genexpressie waren minstens 3 ordes van grootte lager dan die in hepatocyten30. De gegevens in deze studie geven aan dat herprogrammering van somatische cellen naar een pluripotente toestand in vivo veilig, snel en efficiënt is. Gezien de meerderheid van de bestaande in vitro cel-herprogrammeringsmethodologieën die over het algemeen pluripotente (iPS) celgeneratie binnen 3 weken bereiken met minder dan 1% efficiëntie32, kan in vivo herprogrammering naar pluripotentie zeer interessante alternatieven bieden. We veronderstellen dat het concept van in vivo herprogrammering naar pluripotentie kan worden toegepast op verschillende soorten somatische cellen met hoge efficiëntie (afhankelijk van de gebruikte vector), maar het niveau van functionele pluripotentie dat wordt bereikt in de in vivo herprogrammeerde cellen zal moeten worden bepaald. Bovendien, met de ontwikkeling van verbeterde protocollen en technologieën, kunnen in vivo herprogrammeerde cellen mogelijk worden geëxtraheerd en gebruikt voor doeleinden in de regeneratieve geneeskunde.

Er zijn enkele kritieke stappen die moeten worden gevolgd om volwassen, somatische cellen in vivo met hoge efficiëntie te herprogrammeren. Het bereiken van hoge niveaus van genexpressie in het doelweefsel is een voorwaarde. In deze studie werd dit geïllustreerd door de efficiënte overdracht en expressie van plasmide-DNA naar hepatocyten te gebruiken met behulp van HTV-injectie. De belangrijkste factoren voor HTV-injectie zijn het volume, dat tussen de 8-10% van het totale lichaamsgewicht van het dier moet zijn, en de snelheid van injectie, die binnen 5-7 seconden moet worden uitgevoerd. Muizen jonger dan 6 weken oud mogen niet worden gebruikt, omdat HTV-injectie meer weefselschade in de lever kan veroorzaken, wat de efficiëntie van cellulaire herprogrammering kan beïnvloeden. De genetische achtergrond van de dieren had geen invloed op het bepalen van de efficiëntie van in vivo herprogrammering, aangezien we eerder vergelijkbare niveaus van herprogrammering hebben gerapporteerd in zowel Balb/C als TNG-A muizen, de laatste een transgene stam die de eGFP reporter in het Nanog-locus heeft ingebracht en wordt gefokt op Sv129 achtergrond29.

We speculeren dat in vivo cel-herprogrammering naar een pluripotente toestand (die moet worden bepaald) kan worden toegepast op andere weefseltypen, op voorwaarde dat de OKSM-factoren efficiënt worden afgeleverd aan doelcellen, waardoor hoge niveaus van genexpressie mogelijk zijn. Een verscheidenheid aan niet-virale en virale genoverdrachtsvectoren zijn bestudeerd in preklinische en klinische onderzoeken om verschillende cel- en weefseltypen te targeten33. Bijvoorbeeld, voor neurale of oculaire weefsels zijn adeno-geassocieerde virussen de voorkeursvector voor efficiënte in vivo genoverdracht34-37, terwijl in spierweefsel injecties met naakt plasmide-DNA relatief hoge niveaus van genexpressie hebben laten zien38,39. Daarom moet de methode van genoverdrachtsvector zorgvuldig worden geselecteerd afhankelijk van het weefseltype om efficiënte en snelle in vivo cel-herprogrammering naar een pluripotente toestand te bereiken.

Openbaarmakingen

De auteurs verklaren dat ze geen concurrerende financiële belangen hebben.

Dankbetuigingen

Dit werk werd gedeeltelijk ondersteund door de Engineering and Physical Sciences Research Council (EPSRC, Swindon, Verenigd Koninkrijk) en de Europese Commissie FP-7 Programma's NANONEUROHOP (PIEF-GA-2010-276051) en ANTICARB (HEALTH-2008-20157). AY werd ondersteund door een fulltime PhD-beurs van het Ministerie van Onderwijs (Turkije) en IL erkent gedeeltelijke ondersteuning van de British Council en de CAIXA Foundation (Spanje). De financiers hadden geen rol in de ontwerpstudie, gegevensverzameling en -analyse, besluit om te publiceren, of de voorbereiding van het manuscript.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
pCX-OKS-2A pDNAAddgene19771Verkregen van Addgene als bacteriële stab, plasmideproductie uitgevoerd in Plasmid Factory (Duitsland)
pCX-cMycAddgene19772Verkregen van Addgene als bacteriële stab, plasmideproductie uitgevoerd in Plasmid Factory (Duitsland)
0.22 μm filterMillioporeSLGP033RS
IsofluraneAbbottB505
HBSS-bufferSigma-AldrichH6648Ca2+ en Mg2+ vrij, met bicarbonaat
Lever Digest MediumGibco17703-034
Hepatocyte Wash MediumGibco17704-024
100 μm celstrainerBD Biosciences352360
Nucleospin RNA II kitMacherey-Nagel740955.25Kit voor RNA-isolatie uit cellen en weefsels
iScript cDNA-synthesekitBio-Rad170-8890
iO SYBR Green SupermixBio-Rad170-8880
Oct3/4 voorwaartse primerSigmasequentie gegeven in opmerkingenTGAGAACCTTCAGGAGATATGCAA
Oct3/4 omgekeerde primerSigmasequentie gegeven in opmerkingenCTCAATGCTAGTTCGCTTTCTCTTC
Sox2 voorwaartse primerSigmasequentie gegeven in opmerkingenGGTTACCTCTTCCTCCCACTCCAG
Sox2 omgekeerde primerSigmasequentie gegeven in opmerkingenTCACATGTGCGACAGGGGCAG
C-myc voorwaartse primerSigmasequentie gegeven in opmerkingenCAGAGGAGGAACGAGCTGAAGCGC
C-myc omgekeerde primerSigmasequentie gegeven in opmerkingenTTATGCACCAGAGTTTCGAAGCTGTTCG
Nanog voorwaartse primerSigmasequentie gegeven in opmerkingenCAGAAAAACCAGTGGTTGAAGACTAG
Nanog omgekeerde primerSigmasequentie gegeven in opmerkingenGCAATGGATGCTGGGATACTC
Ecat1 voorwaartse primerSigmasequentie gegeven in opmerkingenTGTGGGGCCCTGAAAGGCGAGCTGAGAT
Ecat1 omgekeerde primerSigmasequentie gegeven in opmerkingenATGGGCCGCCATACGACGACGCTCAACT
Rex1 voorwaartse primerSigmasequentie gegeven in opmerkingenACGAGTGGCAGTTTCTTCTTGGGA
Rex1 omgekeerde primerSigmasequentie gegeven in opmerkingenTATGACTCACTTCCAGGGGGCACT
Alb voorwaartse primerSigmasequentie gegeven in opmerkingenGTTCGCTACACCCAGAAAGC
Alb omgekeerde primerSigmasequentie gegeven in opmerkingenCCACACAAGGCAGTCTCTGA
Aat voorwaartse primerSigmasequentie gegeven in opmerkingenCAGAGGAGGCCAAGAAAGTG
Aat omgekeerde primerSigmasequentie gegeven in opmerkingenATGGACAGTCTGGGGAAGTG
Trf voorwaartse primerSigmasequentie gegeven in opmerkingenACCATGTTGTGGTCTCACGA
Trf omgekeerde primerSigmasequentie gegeven in opmerkingenACAGAAGGTCCTTGGTGGTG
B-actine voorwaartse primerSigmasequentie gegeven in opmerkingenGACCTCTATGCCAACACAGT
B-actine omgekeerde primerSigmasequentie gegeven in opmerkingenAGTACTTGCGCTCAGGAGGA
BD Cytofix fixatiebufferBD Biosciences560585
1x BD Perm/Wash-bufferBD Biosciences560585
anti-muis OCT4-PerCP-Cy5.5BD Biosciences560585
anti-muis Nanog-PEBD Biosciences560585
2-MethylbutaanSigma-AldrichM32631
X100-TritonSigma-AldrichX100-500ML
GeitenserumSigma-AldrichG9023
BSASigmaA2153
konijn pAb anti-OCT4Abcamab19857Gebruik in een concentratie van 3 μg/ml
konijn pAb anti-SOX2Abcamab97959Gebruik in een concentratie van 1 μg/ml
konijn pAb anti-NanogAbcamab80892Gebruik in een concentratie van 1 μg/ml
muis mAb anti-SSEA1Abcamab16285Gebruik in een concentratie van 20 μg/ml
geiten pAb anti-konijn IgG gelabeld met Cy3Jackson ImmunoResearch Laboratories Inc.111-165-003-JIRGebruik in een concentratie van 1/250
geiten pAb anti-muis IgG gelabeld met Cy3Jackson ImmunoResearch Laboratories Inc.115-165-003-JIRGebruik in een concentratie van 1/250
VECTASHIELD montagemedium met DAPIVector LaboratoriesH-1200
BCIP/NBT vloeibaar substraatsysteemSigmaB1911
Waterig montagemediumSigma
16% ParaformaldehydeFisherAA433689MStockoplossing is 16%, gebruik het op 4%
Hematoxylinen en eosineSigmaGH53/HT110216
PAS-kleuringSigma395B

Referenties

  1. Blelloch, R., Venere, M., Yen, J., Ramalho-Santos, M. Generation Of Induced Pluripotent Stem Cells In The Absence Of Drug Selection. Cell Stem Cell. 1, 245-247 (2007).
  2. Stadtfeld, M., Nagaya, M., Utikal, J., Weir, G., Hochedlinger, K. Induced Pluripotent Stem Cells Generated Without Viral Integration. Science. 322, 945-949 (2008).
  3. Takahashi, K., et al. Induction Of Pluripotent Stem Cells From Adult Human Fibroblasts By Defined Factors. Cell. 131, 861-872 (2007).
  4. Takahashi, K., Yamanaka, S. Induction Of Pluripotent Stem Cells From Mouse Embryonic And Adult Fibroblast Cultures By Defined Factors. Cell. 126, 663-676 (2006).
  5. Yu, J., et al. Induced Pluripotent Stem Cell Lines Derived From Human Somatic Cells. Science. 318, 1917-1920 (2007).
  6. Gonzalez, F., et al. Generation Of Mouse-Induced Pluripotent Stem Cells By Transient Expression Of A Single Nonviral Polycistronic Vector. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106, 8918-8922 (2009).
  7. Okita, K., Nakagawa, M., Hyenjong, H., Ichisaka, T., Yamanaka, S. Generation Of Mouse Induced Pluripotent Stem Cells Without Viral Vectors. Science. 322, 949-953 (2008).
  8. Woltjen, K., et al. Piggybac Transposition Reprograms Fibroblasts To Induced Pluripotent Stem Cells. Nature. 458, 766-770 (2009).
  9. Yusa, K., Rad, R., Takeda, J., Bradley, A. Generation Of Transgene-Free Induced Pluripotent Mouse Stem Cells By The Piggybac Transposon. Nat. Meth. 6, 363-369 (2009).
  10. Warren, L., et al. Highly Efficient Reprogramming To Pluripotency And Directed Differentiation Of Human Cells With Synthetic Modified Mrna. Cell Stem Cell. 7, 618-630 (2010).
  11. Kim, D., et al. Generation Of Human Induced Pluripotent Stem Cells By Direct Delivery Of Reprogramming Proteins. Cell Stem Cell. 4, 472-476 (2009).
  12. Zhou, H., et al. Generation Of Induced Pluripotent Stem Cells Using Recombinant Proteins. Cell Stem Cell. 4, 381-384 (2009).
  13. Anokye-Danso, F., et al. Highly Efficient Mirna-Mediated Reprogramming Of Mouse And Human Somatic Cells To Pluripotency. Cell Stem Cell. 8, 376-388 (2011).
  14. Lin, S. -L., et al. Regulation Of Somatic Cell Reprogramming Through Inducible Mir-302 Expression. Nucleic Acids Res. , (2011).
  15. Miyoshi, N., et al. Reprogramming Of Mouse And Human Cells To Pluripotency Using Mature Micrornas. Cell Stem Cell. 8, 633-638 (2011).
  16. Subramanyam, D., et al. Multiple Targets Of Mir-302 And Mir-372 Promote Reprogramming Of Human Fibroblasts To Induced Pluripotent Stem Cells. Nat. Biotechnol. 29, 443-448 (2011).
  17. Dolgin, E. Flaw In Induced-Stem-Cell Model. Nature. 470, 13 (2011).
  18. Miura, K., et al. Variation In The Safety Of Induced Pluripotent Stem Cell Lines. Nat. Biotech. 27, 743-745 (2009).
  19. Pera, M. The Dark Side Of Pluripotency. Nature. 471, 46-47 (2011).
  20. Saha, K., Jaenisch, R. Technical Challenges In Using Human Induced Pluripotent Stem Cells To Model Disease. Cell Stem Cell. 5, 584-595 (2009).
  21. Okita, K., Ichisaka, T., Yamanaka, S. Generation Of Germline-Competent Induced Pluripotent Stem Cells. Nature. 448, 313-317 (2007).
  22. Varas, F., et al. Fibroblast-Derived Induced Pluripotent Stem Cells Show No Common Retroviral Vector Insertions. Stem Cells. 27, 300-306 (2009).
  23. Jia, F., et al. A Nonviral Minicircle Vector For Deriving Human Ips Cells. Nat. Meth. 7, 197-199 (2010).
  24. Gonzalez, F., Boue, S., Belmonte, J. C. I. Methods For Making Induced Pluripotent Stem Cells: Reprogramming A La. Nat. Rev. Genet. 12, 231-242 (2011).
  25. Stadtfeld, M., Hochedlinger, K. Induced Pluripotency: History, Mechanisms, And Applications. Genes Dev. 24, 2239-2263 (2011).
  26. Gore, A., et al. Somatic Coding Mutations In Human Induced Pluripotent Stem Cells. Nature. 471, 63-67 (2011).
  27. Hussein, S. M., et al. Copy Number Variation And Selection During Reprogramming To Pluripotency. Nature. 471, 58-62 (2011).
  28. Lister, R., et al. Hotspots Of Aberrant Epigenomic Reprogramming In Human Induced Pluripotent Stem Cells. Nature. 471, 68-73 (2011).
  29. Yilmazer, A., De Lázaro, I., Bussy, C., Kostarelos, K. In Vivo Cell Reprogramming Towards Pluripotency By Virus-Free Overexpression Of Defined Factors. Plos One. 8, (2013).
  30. Liu, F., Song, Y. K., Liu, D. Hydrodynamics-Based Transfection In Animals By Systemic Administration Of Plasmid Dna. Gene Ther. 6, 1258-1266 (1999).
  31. Zhang, G., Budker, V., Wolff, J. A. High Levels Of Foreign Gene Expression In Hepatocytes After Tail Vein Injections Of Naked Plasmid Dna. Hum. Gene. Ther. 10, 1735-1737 (1999).
  32. Yamanaka, S. Induced Pluripotent Stem Cells: Past, Present, And Future. Cell Stem Cell. 10, 678-684 (2012).
  33. Therapy Giacca, M. G. ene , Springer. (2010).
  34. Colella, P., Auricchio, A. Aav-Mediated Gene Supply For Treatment Of Degenerative And Neovascular Retinal Diseases. Curr. Gene Ther. 10, 371-380 (2010).
  35. Dayton, R. D., Wang, D. B., Klein, R. L. The Advent Of Aav9 Expands Applications For Brain And Spinal Cord Gene Delivery. Expert Opin. Biol. Ther. 12, 757-766 (2012).
  36. Mccown, T. J. Adeno-Associated Virus (Aav) Vectors In The Cns. Curr. Gene Ther. 11, 181-188 (2011).
  37. Vandenberghe, L. H., Auricchio, A. Novel Adeno-Associated Viral Vectors For Retinal Gene Therapy. Gene Ther. 19, 162-168 (2012).
  38. Herweijer, H., Wolff, J. A. Progress And Prospects: Naked Dna Gene Transfer And Therapy. Gene Ther. 10, 453-458 (2003).
  39. Wolff, J. A., Budker, V. The Mechanism Of Naked Dna Uptake And Expression. Adv. Genet. 54, 3-20 (2005).

Herprints en machtigingen

Meer artikelen verkennen

Inductie van pluripotentiehydrodynamische staartvene-injectieisolatie van primaire hepatocytenflowcytometrie-analyseQ-RT-PCR genexpressieimmunohistochemische kleuringdoorsnijden van leverweefselbeoordeling van teratoomvorming
In vivo herprogrammeren van volwassen lichaamscellen te Pluripotentie door overexpressie van Yamanaka Factors
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan de bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleidsoverzicht

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.