Het analyseren van Protein Dynamics gebruik van waterstof Exchange Massaspectrometrie

Samenvatting

Eiwitconformatie en dynamiek zijn de sleutel tot het begrijpen van de relatie tussen eiwit structuur en functie. Waterstofwisselproces combinatie met hoge-resolutie massaspectrometrie is een veelzijdige methode om de conformationele dynamica van proteïnen en karakteriseren eiwit-ligand en eiwit-eiwit interacties, zoals contact interfaces en allosterische effecten.

Samenvatting

Alle cellulaire processen afhankelijk van de functionaliteit van eiwitten. Hoewel de functionaliteit van een bepaald eiwit is het rechtstreekse gevolg van de unieke aminozuursequentie wordt alleen gerealiseerd door het vouwen van de polypeptideketen tot een gedefinieerde driedimensionale opstelling of meer algemeen in een ensemble van interconverting conformaties. Onderzoek naar het verband tussen eiwit conformatie en functionaliteit is dus essentieel voor een volledig begrip van hoe eiwitten in staat zijn hun grote verscheidenheid aan taken vervullen. Een mogelijkheid om vormveranderingen een eiwit ondergaat tijdens het doorlopen van de functionele cyclus te bestuderen ^waterstof-1 H / ² H-uitwisseling in combinatie met hoge-resolutie massaspectrometrie (HX-MS). HX-MS is een veelzijdige en robuuste methode die een nieuwe dimensie toevoegt aan structurele informatie verkregen door bijvoorbeeld kristallografie. Het wordt gebruikt om eiwitten te bestuderen en uitklappen binding van kleine molecule liganden, eiwit-eiwit interacties, conformationele veranderingen in verband met katalyse enzym en allosterie. Bovendien wordt HX-MS vaak gebruikt wanneer de hoeveelheid eiwit zeer beperkt of kristallisatie van het eiwit niet haalbaar. Hier bieden wij een algemeen protocol voor het bestuderen eiwitdynamica met HX-MS en beschrijven als een voorbeeld hoe de interactie grensvlak van twee eiwitten in een complex te onthullen.

Inleiding

Het aantal kristalstructuren van eiwitten en eiwitcomplexen afgelopen jaren snel gestegen. Zij presenteren waardevolle momentopnamen van de structurele organisatie van deze eiwitten en vormen een basis voor de structuur-functie analyse. De dynamiek van eiwitten en conformationele veranderingen, die essentieel zijn voor hun functies, zelden onthuld door röntgenkristallografie. Cryo-elektronenmicroscopie, daarentegen, kan eiwitten en eiwitcomplexen vangen in verschillende conformaties, maar algemeen niet beneden oplossen conformationele veranderingen in secondaire structuur niveau ^1. Conformationele dynamica van eiwitten in oplossing bij atomaire gegevens kunnen alleen worden opgelost door NMR, maar deze methode is gelimiteerd tot eiwitten relatief kleine grootte (gewoonlijk ≤ 30 kDa) en heeft hoge concentraties van eiwitten (≥ 100 uM), die experimenten belemmert met oligomerisatie of aggregatie gevoelig eiwitten ^2. Een methode dieis in staat om een brug tussen hoge-resolutie X-ray kristallografie en cryo-elektronenmicroscopie en die wordt niet beperkt door proteïne grootte of concentratie amide ^waterstof-1 H / ² H-uitwisseling (HX) in combinatie met massaspectrometrie (MS). De laatste jaren methode ontwikkeld om een waardevol analytisch instrument voor de analyse van eiwit dynamica, eiwitvouwing, eiwitstabiliteit en conformatieveranderingen ^3-5. De moleculaire basis van deze methode is de labiele aard ruggengraat amide waterstof in eiwitten, die wisselen met deuterium atomen wanneer het eiwit in een _D2O oplossing. De latere toename van eiwitmassa loop van de tijd wordt gemeten met een hoge-resolutie MS.

Kortom ongestructureerde peptiden HX alleen afhankelijk van de temperatuur, katalysatorconcentratie (OH ^-, H ₃ O ⁺ dwz pH, zie figuur 3) en aminozuur-zijketens van aangrenzende residuen door inductieve, katkatalytische en sterische effecten. Deze effecten op de intrinsieke chemische wisselkoers k _ch zijn elegant gekwantificeerd door Bai et al.. ⁶ en een programma beschikbaar is (met dank Z. Zhang), die k _l berekent voor elk aminozuur in een polypeptide afhankelijk van pH en temperatuur. Bij neutrale pH en omgevingstemperaturen k _l ligt in de orde van 10 ¹ -10 ³ sec ^-1. In opgevouwen eiwitten HX kan 2-9 ordes van grootte trager vooral door waterstofbinding in de secundaire structuur en in mindere mate door beperkte toegang gehydrateerde OH ^- ionen om het interieur van een strak gevouwen eiwit. HX in natieve eiwitten impliceert dus gedeeltelijke of globale ontvouwen, chemische uitwisseling en opnieuw vouwen om de natuurlijke toestand volgens vergelijking (1) en de waargenomen wisselkoersen k _obs afhangen van de opening tarief k _op, de slotkoers k _cl en de intrinsieke chemische uitwisseling rate k _ch volgens vergelijking (2).

Onder natuurlijke toestand omstandigheden k _op veel kleiner is dan k _l en kan worden verwaarloosd in de noemer. Er zijn twee extreme uitwisseling regimes genoemd EX1 en EX2. Als de k _cl is veel kleiner dan k _l (EX1) is het waargenomen aantal is nagenoeg gelijk aan de opening tarief en HX staat directe observatie van het ontvouwen van een structureel element. Een dergelijke uitwisseling regime, waar alle amide protonen uitwisseling in een keer bij het ​​openen van het structurele element, is gemakkelijk in MS door een bimodale verdeling van de isotoop pieken ^7. Als k _cl veel groter is dan k _l (EX2) de waargenomen evenredig is met k _ch waarbij de evenredigheidsconstante is gelijk aan het vouwen ontvouwen evenwichten k _u = k _op / K _cl. Onder deze omstandigheden veel openen en sluiten gebeurtenissen nodig voordat alle amide protonen ruil voor deuteronen, leiden tot een geleidelijke stijging van de gemiddelde massa terwijl de isotopische verdeling blijft ongeveer gelijk. Het regime EX2 maakt de bepaling van de vrije energie van ontvouwing ΔG _u en derhalve de stabiliteit van een constructiedeel. Onder natuurlijke toestand staat de EX2 regime is het meest gebruikelijk. Verhoging van de pH en de toevoeging van chaotrope middelen kan de uitwisseling mechanisme verschuiven naar EX1. Daarom kan HX-MS worden gebruikt thermodynamische staand en kinetische parameters van eiwitvouwing en conformatieveranderingen.

Zoals hierboven vermeld HX intrinsiek pH en temperatuur afhankelijke en uitwisseling halfwaardetijd van een geheel aan oplosmiddel blootgestelde proton van de hoofdketen amidegroep tussen 5-400 msec bij fysiologische pH (pH 7,6) en 30 ° C, maar 10 minuten naar> 15 uur met een gemiddelde van> 2 uur bij pH 2,9 en 0 °C (behalve het proton van de eerste ruggengraat amidebinding van een polypeptide, die wisselt met een halfwaardetijd van ca.. 1-2 min). Onder dergelijke trage uitwisseling omstandigheden is het mogelijk om het monster te verteren met proteasen (bijv. pepsine) die actief zijn onder deze omstandigheden, met uit verlies van alle in de opgenomen deuteronen gegevens. Sinds de introductie van peptische digestie onder langzaam uitwisselen omstandigheden kan niet alleen de totale HX kinetiek van full-length eiwitten geanalyseerd maar HX kan worden gelokaliseerd op specifieke gebieden ^8,9. Ruimtelijke resolutie is momenteel beperkt tot de omvang van de peptische fragmenten, die in het algemeen tussen 10-30 residuen. Kan echter overlappende fragmenten te wijten aan de niet-specifieke aard van splitsing in pepsine tot een toename van ruimtelijke resolutie. Bovendien werden verscheidene andere proteasen actief bevonden onder quench omstandigheden echter veel minder efficiënt dan pepsine ^10. Verdere increase van ruimtelijke resolutie kan worden bereikt door versnippering van peptiden in de gasfase door methoden die de deutereringsgraad patroon zoals electron capture dissociatie (ECD), elektron overdracht dissociatie (ETD) en infrarood multiphoton dissociatie (IRMPD) ^11-13 bewaard. Deze technieken Teneinde het verlies van ruimtelijke resolutie door intramoleculaire proton migratie ("scrambling"), die wordt waargenomen door botsing geïnduceerde dissociatie (CID) de meest gebruikte techniek fragmentatie. Deze werkwijzen vereisen optimalisatie voor elke individuele peptide en is dus nog steeds zeer uitdagend.

HX-MS is gebruikt om eiwit-ligand en eiwit-eiwit interacties van virale capside assemblage ^14-17 analyseren. Eiwit ontvouwen en opnieuw vouwen en de temperatuur geïnduceerde conformationele veranderingen werden onderzocht ^7,18,19. Fosforylering en enkel aminozuur-mutatie-gerelateerde conformatie verandert ^16,20 en nucleotide-geïnduceerde veranderingen werden geanalyseerd ^21,22. Daarom lijkt deze methode bij uitstek geschikt voor montage en dynamica van moleculaire machines te analyseren. Een aantrekkelijke kandidaat, wiens mechanisme is van groot algemeen belang, is de Hsp90 chaperonne complex.

Protocol

1. Voorbereiding van Buffers en eiwitmonsters

1. Bereid _H2O buffer. Gebruik Hsp90 standaard buffer (40 mM HEPES / KOH, pH 7,5, 50 mM KCl, 5 mM _MgCl2, 10% glycerol) en _H2O buffer.
   Opmerking: Als het monster werd gedialyseerd voor de analyse, gebruik maken van de dialysebuffer als H ₂ O-buffer. Het is essentieel dat de _D2O buffer verschilt van het _H2O buffergeheugen in de waterstofisotopen. Vluchtige buffers zoals _NH4 CO ₃ of _NH4-acetaat buffer of componenten zijn niet geschikt!
2. Bereid D ₂ O buffer door vriesdrogen van Hsp90 standaard buffer met een stofzuiger concentrator. Na volledige verdamping van _H2O commentaar zuiver _D2O de buis naar de oorspronkelijke totale hoeveelheid (bijv. 1 ml buffer met 15% glycerol vereist de toevoeging van 850 pl D ₂ O) te bereiken. Herhaal de volledige verdamping van de buffer en los de buffer / zout comcomponenten in _D2O 2x.
3. Bereid afschrik buffer (0,4 M KH ₂ PO ₄ / H ₃ PO ₄ pH 2,2).
   Opmerking: Om de efficiëntie van peptische digest van zeer stabiele eiwitten 4 M guanidinehydrochloride en 0,5 M Tris (2-carboxyethyl) fosfine (TCEP-HCl) kan worden toegevoegd verbeteren.
4. Bereid 100% controle monster (6 M guanidinehydrochloride, D ₂ O). Voeg guanidine hydrochloride een Hsp90 monster tot een eindconcentratie van 6 M bereikt verdampen _H2O uit het monster en voeg _D2O de buis de aanvankelijke totale volume (bijvoorbeeld 100 gl monster bereikt met 10% glycerol vereisen de toevoeging 90 pl _D2O). Herhaal de volledige verdamping van de buffer en los de buffer / zoutcomponenten in D ₂ O.
   Opmerking: 20-100 pmol monster voor elke injectie. Bereid genoeg monster met een controlegroep van 100% voor elke dag van de HX-MS experimenten.
5. Bereid 50 pmol Hsp90 in 5 pi Hsp90 standaard buffer.
   Opmerking: Een hoeveelheid van 20-100 pmol monster voor elke bijzondere ruwe data. De hoeveelheid monster in de reactie 1-5 pl ideaal. Pas de concentratie aan deze eisen past. Elke buffer kan, zolang het geen oplosmiddelen of vluchtige bestanddelen bevatten worden gebruikt.

2. Preparaat van geïmmobiliseerde Pepsin op Aldehyd Activated Beads

1. Los 80 mg verse pepsine in 2 ml 50 mM natriumcitraat (pH 5).
2. Los 20 mg natriumcyanoboorhydride, voorzichtig behandelen (zeer giftig!) In 1 ml 2 M Na ₂ SO ₄ en voeg toe aan pepsine oplossing.
3. Incubeer het mengsel gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur onder zachtjes roeren (bijv. overhead shaker).
4. Voeg 600 mg parels geïmmobiliseerde aldehydegroepen aan het mengsel en incubeer gedurende 5-10 minuten bij kamertemperatuur.
5. Voeg 2,2 ml van 2 M Na ₂ SO₄ (pH 5) in 100 ul porties elke 3 min dan een uur langzaam zout uit de pepsine. Meng het monster voorzichtig tussen toevoegingen in een overhead-schudder bij kamertemperatuur.
6. Incubeer de pepsine kralen bij 4 ° C gedurende 14-16 uur / 's nachts in een overhead shaker.
7. Blus de reactie door toevoeging van 1 ml 1 M ethanolamine en incubatie bij kamertemperatuur gedurende 2 uur.
8. Spin down de kralen in een 50 ml falcon buis bij 500 rpm, de bovenstaande vloeistof en resuspendeer de kralen in 0,1% mierenzuur. Herhaal deze stap 2x. Na de laatste centrifugatiestap, gooi supernatant en raming volume van kralen. Voeg een gelijk volume van 0,1% mierenzuur en bewaar bij 4 ° C.

3. Voorbereiding van Kolommen voor amide Waterstof-uitwisseling

1. Gebruik guard kolom met een binnendiameter van 1 mm voor het vangen kolommen en van 2 mm voor pepsine kolommen.
2. Schroef de ene kant van de kolom bewaker en verwijder het filter. Schroef verpakking funnel op het open uiteinde van de kolom. Gebruik van een 1/16 inch adapter en slang een lege injectiespuit (5 ml) tegen de onderkant uitlaat van de kolom. Zorg ervoor om het gasdicht vast aan de kolom bewaker.
3. Breng enkele druppels suspensie rupsmateriaal boven de trechter. Trek de zuiger van de spuit aan de slurry te zuigen door de trechter in de kolom bewaker. Solliciteer meer drijfmest kraal materiaal op de trechter en de procedure voortzetten totdat de kolom bewaker volledig is gevuld met kraal materiaal. Verwijder de trechter en plaats filter en filter ring op het open einde. Schroef de kolom dop op de kolom bewaker en verwijder de spuit van de andere kant. Sluit beide uiteinden van de wacht kolommen met pluggen om uitdroging van kolom materiaal te voorkomen.

4. Het opzetten van het systeem voor de Hydrogen Exchange massaspectrometrie (HX-MS)

1. Sluit de kolom val met de HPLC (figuur 1). Equilibreer de kolom door de stroomsnelheid vanEen pomp met 0,4 ml / min met 0,1% mierenzuur als oplosmiddel. Laat de kolom pepsine noch de analytische kolom nog niet aan.
2. Kalibreer de massaspectrometer en sluit de uitlaat van de HPLC naar de bron van de massaspectrometer.

5. Bepaling van het dynamisch bereik van Exchange

1. Bereid ultrazuiver oplosmiddel A (0,1% mierenzuur in water) en ultrazuiver oplosmiddel B (0,1% mierenzuur in acetonitril), klaar gemengde oplosmiddelen zijn commercieel verkrijgbaar. Spoel de HPLC pompen. Stel de chromatografie en massaspectrometrie methoden in de besturingssoftware uitgesproken door een programma met een stapsgewijze gradiënt na een korte ontzoutingsstap. Voor full-length Hsp90 gebruik een 1-2 min. ontzoutingsstap gevolgd door het inschakelen van de 6-wegklep van ontzouten / LOAD elueren en een stap gradiënt van 90% oplosmiddel A/10% oplosmiddel B tot 5% oplosmiddel A/95% oplosmiddel B. Voordat injectieset de injectieklep te laden en de 6-wegklep naar / VULLEN positie ontzouten.
   Noot: Gebruik een pepsine of analytische kolom tijdens dit experiment niet te gebruiken.
2. Bereid 100-200 pmol Hsp90 in 1-10 ui _H2O buffer en incubeer gedurende 10 minuten bij 30 ° C. Voeg temperatuur aangepast D ₂ O-buffer aan het monster volume tot 100 ul brengen en incubeer precies voor een bepaalde periode (bijv. 10 sec, 100 sec, 1000 sec). Voeg 100 ul afschrik buffer en meng door en neer te pipetteren. Injecteer 200 ui monster in de injectiepoort van de injectie ventiel met een Hamilton spuit. Start het chromatografie programma en schakel de injectie klep in INJECTEER positie. Na 2 min. schakelt de 6-wegklep van ontzouten / VULLEN te elueren. Herhaal dit voor ten minste drie tijdstippen.
3. Herhaal stap 5.2 maar voeg 2-3x overmaat Sti1 de Hsp90 monster voor incubatie gedurende 10 minuten bij 30 ° C.
4. Bepaal het eiwit van volledige lengte massa door deconvolutie van spectra in de massaspectrometrie software. Bereken het aantal incorporated deuteronen door het vergelijken van het molecuulgewicht van volledige lengte Hsp90 met de waargenomen massa na elke run (bijv. 10 sec, 100 sec, 1000 sec).
5. Teken de opgenomen deuteronen voor Hsp90 in afwezigheid en aanwezigheid van Sti1 (y-as) versus tijd (x-as). Bepaal het tijdpunt in het dynamische bereik waar het verschil tussen beide curven maximaal. Gebruik deze waarde voor de incubatietijd in D ₂ O bij het ​​identificeren van Hsp90-Sti1 interface en dynamiek op peptide-niveau.

6. Bepaling van Peptic Peptiden behulp van MS / MS-spectra

1. Sluit de kolom pepsine en analytische kolom systeem.
2. Stel de parameters voor de chromatografie en massaspectrometrie in de besturingssoftware door te kiezen gradiënt aard en gewicht methode spectrometrie. Kies een steile helling (bv. meer dan 90 min) om een goede chromatografische resolutie te garanderen. Enable MS / MS-spectra van de massaspectrometer.
   Opmerking: Goede resolutietie op de HPLC en hoge nauwkeurigheid massa hebben hoogste prioriteit in deze stap.
3. Bereid 100-200 pmol Hsp90 in 100 pl _H2O buffer. Voeg 100 ul afschrik buffer en meng door en neer te pipetteren. Injecteer 200 ui monster in de injectiepoort van de injectie ventiel met een Hamilton spuit. Start het chromatografie programma en schakel de injectie klep in INJECTEER positie. Na 2 min. schakelt de 6-wegklep van ontzouten / LADEN om de positie te elueren.
   Opmerking: Als er meerdere eiwitten in HX-MS (bijvoorbeeld eiwit-eiwit interactie interfaces) te analyseren de peptiden voor elk eiwit individueel worden bepaald.
4. Identificeer peptische peptiden van Hsp90 door te zoeken op een databank (dwz Mascotte) voor de resulterende peptiden.
   Opmerking: Het is mogelijk om een aangepaste database als het doel is om zoveel ulcus peptiden bepalen mogelijk en analyse uitgevoerd met gezuiverd eiwit. Zuiverheid van het monster zal have rekening worden gehouden.
5. Herhaal deze stap zonder MS / MS en het verloop dat wordt gebruikt voor de eigenlijke HX experiment. Voor Hsp90 en Sti1 gebruik een 10 min. gradiënt van 90% oplosmiddel A/10% oplosmiddel B tot 45% oplosmiddel A/55% oplosmiddel B.
   Opmerking: Hellingen zijn doorgaans tussen 5-15 min en zijn sterk afhankelijk van de complexiteit monster en HX systeemspecificaties.
6. Bepaal de retentietijden van de ulcus peptiden geïdentificeerd in 6.4 in het verloop gebruikt in 6.5 en maak een lijst toe met 1.) Peptide sequentie 2.) Peptide laadtoestand en 3.) Retentietijd. Dit wordt gebruikt om elke peptide identificeren na HX experimenten.
   Opmerking: Wees ervan bewust dat peptiden met kleine m / z verschillen, identiek laadtoestand en identieke retentietijd een bron van onduidelijkheid kan zijn.

7. Identificatie van eiwit-eiwit interactie Interfaces

1. Stel de gradiënt en massa spectrometrie methode in de controle software. Gebruik een 10 min lineaire gradiënt van 90% oplosmiddel A/10% oplosmiddel B tot 45% oplosmiddel A/55% oplosmiddel B. Plaats een massaspectrometrie methode die is geoptimaliseerd voor de detectie van massa tussen 300-1.500 m / z, hoewel de meeste de peptiden zal onder 1000 m / z. Stel de injectie klep in LOAD positie, de 6-wegklep in LADEN / ontzouten Position. Stel het debiet van de laadpomp tot 0,4 ml / min.
   Opmerking: De duur en aard van de gradiënt zijn monster afhankelijk en kan geoptimaliseerd moeten worden. Langere gradiënten verbeteren van de resolutie van de chromatografie, maar de integratie van deuteronen afnemen in eiwitten als gevolg van back-uitwisseling. De gekozen methode moet hetzelfde zijn voor alle experimenten worden vergeleken.
2. Voor de unexchanged referentie bereiden 20-100 pmol Hsp90 in 100 pl _H2O buffer. Voeg 100 ul ijskoude afschrik buffer, pipet op en neer twee keer en injecteren monster in de injectieklep van de HPLC. Onmiddellijk beginnen de chromatografie programma en swjeuken de injectie klep in INJECTEER positie. Na 2 min. schakelt de 6-wegklep van ontzouten / LADEN om de positie te elueren. Doe dit voor Hsp90 en Sti1 individueel en voor het mengsel van eiwitten.
3. Bereid 20-100 pmol van Hsp90 in een volume van 1-5 pl. Voeg temperatuur aangepast D ₂ O-buffer aan het monster volume tot 100 ul brengen en incubeer precies voor een bepaalde periode (bijvoorbeeld 30 seconden, want conformationele dynamica zie opmerking). Voeg 100 ul ijskoude buffer doof, pipet op en neer tweemaal snel en injecteer 200 ul in de inspuitklep van HPLC. Onmiddellijk beginnen de chromatografie programma en schakel de injectie klep in INJECTEER positie. Na 2 min. schakelt de 6-wegklep van ontzouten / LADEN om de positie te elueren. Doe dit voor elk eiwit afzonderlijk, aan het deuteron opname in elk peptide in afwezigheid van de interactie eiwit te bepalen.
   Opmerking: Bij het ​​bestuderen van de dynamiek van de conformational veranderingen, herhaal het experiment met verschillende incubatie tijd van Hsp90 in D ₂ O buffer. Probeer een breed tijdsbestek te dekken door incubatie tijden kiezen logaritmisch (bijv. 10 sec, 30 sec, 100 sec, 300 sec, 1.000 sec, enz.). D ₂ O-buffer en sample buffer moet precies gelijk zijn, behalve voor de waterstof-isotoop.
4. Bereid een gelijke hoeveelheid 100% controlemonster (20-100 pmol) en voeg _D2O buffer om het monstervolume tot 100 ui te brengen. Voeg 100 ul ijskoude buffer doof, pipet op en neer tweemaal snel en injecteer 200 ul in de inspuitklep van HPLC. Onmiddellijk beginnen de chromatografie programma en schakel de injectie klep in INJECTEER positie. Na 2 min. schakelt de 6-wegklep van ontzouten / LADEN om de positie te elueren.
5. Om de interactie oppervlak bepalen mengen Hsp90 met een minstens 2-voudige overmaat van Sti1 om het evenwicht op de gebonden toestand verschuiven (zie opmerking) en incubeerbij de gewenste temperatuur tot complexvorming in evenwicht. Voeg temperatuur aangepast D ₂ O-buffer aan het monster volume tot 100 ul brengen en incubeer precies voor een bepaalde periode (bijvoorbeeld 30 seconden). Voeg 100 ul ijskoude buffer doof, pipet op en neer tweemaal en snel injecteren in de inspuitklep van HPLC. Na 2 min. schakelt de 6-wegklep van ontzouten / LADEN om de positie te elueren. Herhaal dit experiment met 20-100 pmol Sti1 en overmaat van Hsp90.
   Opmerking: De absolute concentraties afhankelijk van de dissociatie evenwichtsconstante van de interactie. Idealiter na verdunning in _D2O de concentratie van het eiwit in overmaat toegevoegd moet minstens 10x de _KD (overeenkomend met> 85% van de onderste geconcentreerde eiwit gebonden).
6. Analyseer de verkregen gegevens met geschikte software en gebruik de retentietijden bepaald in stap 6.5 op elk peptide te vinden in de analyse. Berekeningte het zwaartepunt van de isotoop distributie voor de unexchanged proteïne (stap 7.2) en voor de HX experimenten (stap 7.3).
   Opmerking: Hoewel de isotoop patronen van de uitgewisselde peptiden er anders uit dan hun unexchanged tegenhangers, zowel de kennis over de laadtoestand van de peptide en de hoge nauwkeurigheid van massa's van de massaspectrometer zorgt voor eenvoudige bepaling van de centroïden.
7. Vergelijk opname van deuteronen doelwiteiwit alleen en met overmaat bindingspartner. Dit kan automatisch gebeuren met commerciële software of handmatig met een spreadsheetprogramma. De 100% controlemonster waarden geven de maximale ruil voor elk peptide en kan worden gebruikt om de hoeveelheid _D2O etiket verloren tijdens het experiment door terug wisselen bepalen.

Resultaten

Hsp90 is een moleculaire chaperonne in gist en lid van de Hsp90 chaperonne familie. Door te gaan door middel van een complex ATPase cyclus het helpt laat inklapbare trap van veel eiwit klanten. Efficiënte vouwen vereist overdracht van cliënten van Hsp70 en interactie van de co-chaperonne Sti1/Hop. Sti1 direct bindt aan Hsp90 en faciliteert client binding door remming van Hsp90 de ATPase activiteit. Interactie van Hsp90 met Sti1 werd onlangs bestudeerd met behulp van HX-MS ^23. Hier presenteren we representatie...

Discussie

Binding van een interactie partner aan een eiwit onvermijdelijk veroorzaakt veranderingen in solvent toegankelijkheid op de bindingsplaats. Bovendien zijn veel eiwitten ondergaan dynamische conformatieveranderingen na binding die andere regio beïnvloeden dan de werkelijke bindende interface. HX-MS is een robuuste methode om deze veranderingen te monitoren en is zelfs in staat om het openbaren van conformationele veranderingen in eiwitten op tijdschalen die andere methoden niet kunnen dekken.

...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
maXis QTOF	Bruker
nanoAcquity UPLC	Waters Corp.
Shimadzu 10AD-VP	Shimadzu
6-port Valve EPC6W with microelectric actuator	Valco	#EPC6W
Injection valve (manual)	Rheodyne	#7725
Poros AL20 media	Applied Biosystems	#1-6029-06
Poros R2	Applied Biosystems	#1-1118-02
Pepsin	Sigma	#P6887	gebruik vers pepsine
Microbore (1 mm)	IDEX	#C-128
Microbore (2 mm)	IDEX	#C-130B
Acquity UPLC BEH C8 Column	Waters Corp.	#186002876
Thermomixer	Eppendorf	#5355000.011
Tubing (various diameters)	IDEX
Fittings	IDEX	#PK-110 met PK-100