Flexibele colonoscopie in Muizen aan de ernst van colitis en Colorectale Tumoren Evalueer behulp van een gevalideerde Endoscopische Scoring System

Samenvatting

In de afgelopen jaren zijn nieuwe generatie endoscopen ontpopt als belangrijk diagnostisch onderzoek hulpmiddelen voor het evalueren van muizen colitis en colorectale tumoren. We presenteren hier een gedetailleerd protocol voor endoscopische beoordeling van ontsteking en colorectale tumoren in muizen, evenals een nieuw scoresysteem dat decimale identifiers gebruikt om de endoscopische ernst van colitis en colorectale tumoren documenteren.

Samenvatting

Het gebruik van moderne endoscopie voor onderzoeksdoeleinden is sterk vergemakkelijkt ons begrip van gastro-intestinale aandoeningen. Met name experimentele endoscopie zeer nuttig voor studies die herhaalde evaluaties in een proefdier, zoals evaluatie mechanismen van chronische inflammatoire darmziekte en de progressie van colorectale kanker vereist zijn. Echter, de gebruikte studies over methoden zijn zeer variabel. Ten minste drie endoscopische scoring systemen verschenen voor murine colitis en gepubliceerde protocollen voor de beoordeling van colorectale tumoren niet de aanwezigheid van gelijktijdige colon ontsteking pakken. Dit onderzoek ontwikkelt en valideert een reproduceerbare endoscopische scoresysteem dat de evaluatie van zowel de ontsteking en tumoren tegelijkertijd integreert. Dit nieuwe scoresysteem heeft drie belangrijke componenten: 1) beoordeling van de omvang en de ernst van colorectale ontsteking (op basis van perianale bevindingen, transparantie van de wall, mucosale bloeden, en focale laesies), 2) kwantitatieve opname van tumorlaesies (raster kaart en grafiek), en 3) numerieke sortering van klinische gevallen door hun pathologische en onderzoek relevantie op basis van decimale eenheden met toegewezen categorieën waargenomen laesies en endoscopische complicaties (decimaal identifiers). De video-en handschrift hierin gepresenteerd werden bereid, na IACUC-goedgekeurde protocollen, zodat onderzoekers hun eigen experimentele muizen scoren met behulp van een goed gevalideerde en zeer reproduceerbare endoscopische methode, met de optie systeem distale onderscheiden van proximale endoscopische colitis (D-PECS ).

Inleiding

Muizen-endoscopie is uitgevoerd als een belangrijke onderzoeksmethode voor meer dan een decennium ^1-3. Tot op heden zijn de meeste onderzoeken waarin muizen endoscopie hebben gebruikt starre endoscopen, hoewel sommige hebben ook flexibele sigmoïdoscopie. Muizen endoscopie biedt directe resultaten en een meer objectieve inschatting van de mate van het intestinale normaliteit, de ernst van de ontsteking, en de progressie van de tumor ten opzichte van indirecte maatregelen, zoals gewichtsverlies, diarree en histologie (die niet optimaal wanneer laesies zijn fragmentarisch), terwijl het aanbieden van inzichten over de algehele gezondheid van de dikke darm. Met name, endoscopie maakt de herhaalde beoordeling van proefdiermodellen tijd, in tegenstelling tot traditionele histologisch onderzoek dat het dier wordt gedood en dubbele punten voor analyse ¹ te oogsten vereist. Ondanks deze voordelen is het gebruik van murine endoscopische technologie niet wijdverbreid en wordt beperkt door het ontbreken van gestandaardiseerde protocollen voor implementatiop en scoren van pathologische bevindingen. Goed uitgevoerd, muizen endoscopie houdt grote belofte voor ons begrip en karakterisatie van diermodellen voor multiple chronische gastro-intestinale ziekten, met inbegrip van inflammatoire darmziekten, colitis, en colorectale tumoren verder te vergemakkelijken.

Het nut van muizen endoscopische techniek scharnieren op de reproduceerbaarheid en objectiviteit, die het bestaan ​​van gestandaardiseerde onderzoek procedures en een consistente, niet-redundante en betrouwbare scoresysteem voor intestinale pathologieën vereist. Ten minste drie beschrijvende scoringssystemen voor endoscopische beoordeling van colitis ^4-6, en voor colon tumoren in muizen ^4,7,8 gepubliceerd. Echter, deze meldde benaderingen en scoring systemen zijn niet goed vergelijkbaar tussen de studies. In veel gevallen is er geen duidelijke omschrijving van de criteria voor de indeling van de laesies, en wanneer de criteria worden gegeven, ze lopen sterk uiteen. Bovendienzijn er geen meldingen scoren systemen die de beoordeling van zowel colitis en tumoren, twee van de meest voorkomende colon pathologieën die gelijktijdig kunnen optreden en hebben interactieve effecten op de uitkomst, in een enkel meetinstrument integreren. Ten slotte is de endoscopische scoring systemen die bestaan ​​voor colitis hebben vaak inflammatoire categorieën met beperkt discriminatie (dwz. Smalle scoreopties over korte integer schalen, vaak 1-4) om goed te vertegenwoordigen ziekteprogressie scenario's en maken het gebruik van parametrische statistische analyse.

In dit artikel beschrijven we het gebruik van een flexibele endoscoop om de ernst van murine colitis en colon tumoren beoordelen en beschrijven een gestandaardiseerd protocol voor deze technologie gebruikte in de anatomische evaluatie van de perianale gebied, rectum en distale colon. We illustreren effectief oplossen van problemen tijdens endoscopie om trauma en artefacten te minimaliseren, en beschrijven we een reproduceerbare scoresysteemgebaseerd op gevalideerde gepubliceerde klinische parameters. Het scoresysteem integreert evaluatie van zowel intestinale ontstekingen en tumoren met behulp van een hoge mate van discriminatie met 12 mogelijke kwaliteiten van een ontsteking, tumor in kaart brengen en plotten opties, en een roman decimale eenheid (dwz, decimaal identifiers) om de bevindingen met specifieke diagnostische waarde te markeren ( dwz tumorontwikkeling, complicaties tijdens endoscopie, enz.). Het gebruik van de decimale identifiers zorgt voor een snelle opvolging van relevante verzamelingen gegevens voor verder stroomafwaarts analyse. Tot slot, betrouwbaarheid en validiteit testen van het scoresysteem voeren we in verschillende muismodellen van colitis en de colitis-geassocieerde kanker (dextransulfaatnatrium (DSS) geïnduceerde colitis, Clostridium difficile infectie, en azoxymethane / DSS-geïnduceerde dikke darm kanker).

Protocol

1. Het opzetten van de Endoscopie System

1. Het opzetten van de endoscopie systeem voor verlamming van de muizen, volgens de instructies van de fabrikant. Gebruik een video ureteroscope ontworpen voor mensen voor dit protocol (figuur 1). De buitendiameter van de buis inbrengen 9,9 Fr (3,3 mm), het distale uiteinde is 8,5 Fr (2,8 mm) en de binnendiameter van de instrumentatie kanaal 6 Fr (1,2 mm).
2. Hoewel het gebruik van endoscopen zijn niet gekoppeld aan ziekteoverdracht [9], steriliseer de endoscoop lens met 70% ethanol of ¹⁰ met geschikte technieken bij het ​​werken met sporenvormende micro-organismen. Bereid bacteriostatisch steriel glijmiddel en niet-krassen veeg weefsels naar de endoscoop punt verzadigen.
3. Bevestig een 3 ml spuit vol met lucht (of een geschikte _CO2 gasmengsel) naar de top van de instrumentatie kanaal.
4. Schakel de stroom in, en stel de witbalans in normale witte licht,evenals smalle band imaging (NBI) modus, indien van toepassing. Sinds 2001 heeft NBI verstrekt diagnostische beeldvorming voordelen als het benadrukt fijne structuren bloedvat op de slijmvliezen, waaronder colitis en tumorous laesies, die kenmerkend zijn abnormale vascularisatie ¹¹ hebben. NBI-filter modus beperkt de golflengte van het gevangen licht 390-445 nm en 530-550 nm, welke structuren hoogtepunten met hemoglobine.
5. Print de beoordeling scoreformulier (figuur 2) om uw bevindingen te registreren. Vertrouwd te raken met de verwachte normale en NBI beelden (figuur 3A) en de definitie en de kwaliteiten van elk criterium voor het examen (zie paragraaf 6.1).
6. Bereid een kleurstof-gebaseerde oplossing van met fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS) voor chromoscopie, indien gewenst. In chromoscopie, wordt het examen uitgevoerd met behulp van een kleurstof als contrastmiddel om mucosale veranderingen te markeren. Gebruik methyleenblauw (0,1-1%) en indigotine (0,1%) oplossing (figuur 3B). Nootdat methyleenblauw een oxidatie-reductiemiddel dat oxiderende radicalen, indirecte verknoping aminozuurresten en DNA degradatie ^12, die kunnen storen monsteranalyse kan produceren.

2. Algemene anesthesie van de Muis

1. Kies het anestheticum en de toedieningsweg. Raadpleeg een dierenarts van een dier bron voorziening of Institutional Animal Care en gebruik Comite (IACUC) over een mogelijke interferentie van medicijnen met het immuunsysteem en onderzoeksdoelen. Sommige medicijnen kunnen cytokineprofiel expressie beïnvloeden bij dieren, waaronder knaagdieren ^13. Gebruik injecteerbare tribroomethanol voor terminal procedures of isofluraan te overleven endoscopieën, samen met de juiste controles.
2. Voor inductie toedienen 4-5% isofluraan in 100% zuurstof met een snelheid van 0,2-0,5 L / min, gebruik 0.5-2% onderhoud. Dit protocol is niet geschikt voor alle dieren. Raadpleeg uw faciliteit dierenartsvoor de juiste instructies en training. Voldoen aan de relevante IACUC aanbevelingen aan de hoogste normen voor het welzijn van dieren te bereiken. Zorg ervoor dat de muis als volledig verdoofd.
3. 'Strap' de verdoofde muis om een ​​steunvlak tafel in een dorsale of ventrale positie met behulp van laboratorium plakband. Pas op voor de anatomische oriëntatie op uw endoscoop scherm. Beveilig de onderste ledematen en staart. Een band van tape kan ook op de borst geplaatst worden om beweging weg van de respirator te voorkomen, maar vermijd beperken thoracale ventilatory bewegingen.

3. Gedetailleerde endoscopisch onderzoek

1. Kijk voor perianale letsels voordat u de endoscoop in het rectum, dan vooraf de reikwijdte via de anus.
2. De vacht van de endoscoop met steriele chirurgische glijmiddel. Wees er zeker niet om de vacht van het oppervlak van de CCD-sensor (Charge Coupled Device).
3. Plaats de endoscoop en de opname te starten. Opgenomen video's zijn nuttig voor meticulous evaluatie van endoscopie indien nodig na het onderzoek. Probeer de endoscopie uitvoeren in de minst mogelijke tijd tot intestinale / mucosale irritatie te voorkomen.
4. Solliciteer lucht met behulp van een injectiespuit langzaam apart gezet van de darmwand. Afhankelijk van de grootte van de muis, gebruik 1-2 ml lucht. Vermijd overmatige lucht inblazing, het kan ademhalingsproblemen en de dood van de verdoofde muis veroorzaken.
5. Vooraf de endoscoop naar voren als je de weg vrij met lucht of zachte rotatie van de scope. Laat de endoscoop niet verder als je niet ziet het darmlumen. Perforaties of rectale / colon scheuren optreden in dit stadium, vooral bij jonge muizen (<8-10 weken oud). Maak foto's als dat nodig is.
6. Naarmate de omvang voorschotten, beoordelen of er spontane bloedingen (gedefinieerd als natuurlijk voorkomende mucosale bloedingen niet geassocieerd met traumatische endoscopie). Spontane bloeden kan worden waargenomen als de endoscoop komt het rectum en het colon.
7. AlsSess de transparantie van de dikke muur. Transparantie wordt gedefinieerd als het vermogen om de intramurale bloedvaten in de dikke darm visualiseren en die van de omliggende ingewanden (figuur 4). Zachte beweging van de scope (back-forward, rechts, links) helpen bepalen of bloedvaten kan worden gezien in de context van andere ingewanden. Mesenteriale vetweefsel kan ook worden gezien. Let op als het rectum binnen de bekkenholte lijkt minder transparant zijn dan de dikke muur in de buikholte.
8. Inspecteren om het type en het aantal focale laesies (oedemateus gebieden, erosies, zweren, tumor massa's) te bepalen. Dit zal worden vastgelegd in het scoreformulier met de dikke darm ontsteking score en de decimale identifiers die zijn ontwikkeld.
9. Zodra het gebied waar de dikke darm buigt caudaal in de proximale colon is bereikt, trekken de endoscoop langzaam en zoek naar de aanwezigheid van contact bloedingen (die door brosheid mucosale na voordoetendoscoop is gevorderd of verwijderd). Het is niet noodzakelijk om de dikke darm oppervlak opzettelijk schrapen. Gezonde colorectale slijmvlies bloedt niet na een goede endoscopisch onderzoek.

4. Biopsie

1. Als biopten nodig zijn, plaatst de biopsietang door de endoscoop kanaal speciaal voor instrumentatie. Bewaken van de voortgang van de tang op de endoscoop scherm om darmperforatie voorkomen.
2. Open de biopsie kopjes van de tang om ongeveer 60-80 ° kop-aan-kop hoek, en deze rechtstreeks naar het gebied van belang. Overmatig geopende tang of druk kunnen extra lagen van darmweefsel, wat resulteert in een biopsie-geïnduceerde perforatie van gezonde transparante darmwand grijpen. Als perforatie optreedt, euthanaseren het dier tijdens anesthesie na uw aanbevelingen IACUC. Perforaties leiden endotoxemie en peritonitis.
3. Sluit de biopsie kopjes, en trek ze uit terwijl de tang gesloten.
4. Remove het preparaat uit de tang door spoelen van het weefsel met een oplossing die aangenaam is voor het weefsel en de tang. RNA later en PBS zijn gemeenschappelijke werkgroep oplossingen, indien nodig, gebruik de naald om het monster te verjagen. Vermijd het uithollen van het pincet bekers of snijkanten.

5. Herstel van Anesthesie

1. Na voltooiing van het onderzoek, een warme omgeving om de muis totdat herstelt. Gebruik ofwel een elektrisch licht, of een warme pad ingesteld op 37 ° C. Vermijd oververhitting; perifere vaatverwijding compromissen herstel dier. Bewaken van de muis nauwkeurig tot volledig herstel.

6. Geïntegreerde Endoscopische Scoring System van colorectale Gezondheid met decimale Identifiers

1. Gebruik het scoreformulier (figuur 2) en de parameter definities hieronder (Endoscopische Evaluatie van Muriene Colorectale Ontsteking en tumoren met behulp van een decimaal-gewogen Scoring System: Parameter Definities, en Protocol) voorvoorbeelden en de optionele 'distale-proximale Endoscopische Colitis scoresysteem' (D-PECS) als leidraad voor nonbiased beoordeling en gedetailleerde registratie.
2. De score van de vier parameters van colorectale ontsteking beschreven op het scoresysteem vorm (figuur 2). Minutieus evalueren de perianale regio, intestinale transparantie, het type van intestinale bloedingen (indien aanwezig), en de aanwezigheid en hoeveelheid van focale laesies (erosieve, colitis, en / of tumor).
3. Bij de beoordeling van tumoren voor onderzoeksdoeleinden, onderzoekt de hoeveelheid, locatie en grootte, en te beschrijven met behulp van de colon kaart en het staafdiagram op het scoreformulier. De numerieke som van de scores verkregen en het aantal laesies (indien van toepassing) wordt de achtergrond colon ontsteking, het meest overheersende type letsel en het aantal laesies bepalen.

Resultaten

Het protocol en de beelden die in deze studie zijn bereid met een Olympus URF-V flexibele endoscoop ¹⁴ en NBI ^11,15. Video beelden werden opgeslagen in MPEG-2 formaat en foto's in JPG, TIF, PNG, of DICOM formaat met maximaal 1280 x 1024 pixels, overdraagbaar naar standaard USB flash draagbare geheugens. NBI verhoogt de visuele contrast van hemoglobine bevattende weefsels. Normaal licht en NBI beeldvorming zijn de belangrijkste kenmerken van de normale anatomie van de colorectale mucosa en de ve...

Discussie

Er zijn verschillende overwegingen ten aanzien van de wijziging en het oplossen van problemen van de endoscopische techniek bij muizen. Kritische aspecten van de procedure die tijdens het gebruik van flexibele endoscopie te worden beheerst onder meer de aanpassing van het volume lucht die nodig is om een ​​opgezette buik en respiratoire compromis van de muis te voorkomen en kleine technische aspecten van het uitzicht besturing met de coördinatie van de gehoekt en staartrotorbediening . Koppelregeling is belangrijk om he...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Isoflurane, USP	Webster Veterinary
Chirurgische smering	Savage laboratories	surgilube, 0281-0205-45
Fosfaatgebufferde zoutoplossing	Thermo Scientific	SH30256
RNAlater	Ambion	AM7021
Methyleenblauw 1% waterige oplossing	Fisher Science Education	S96393
Flexibele digitale ureteroscoop	Olympus America	URF-V
Videosysteemcentrum	Olympus America	VISERA Pro OTV-S7 Pro
Xenon lichtbron	Olympus America	VISERA Pro CLV-S40 Pro
Videorecorder	MediCapture, Inc.	MediCap USB200
Flexibele biopsiebekertang	Olympus America	FBC-3115
Anesthesieapparaat	Euthanex Corporation	EZ-7000 Classic System