Methodenartikel

FtsZ polymerisatie Testen: Eenvoudige Protocollen en overwegingen

DOI:

10.3791/50844

⸱

16 november 2013

 , 
1Department of Molecular Microbiology, Groningen Biomolecular Sciences and Biotechnology Institute, University of Groningen

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Polymerisatie van FtsZ is essentieel voor bacteriële celdeling. In dit rapport beschrijven we eenvoudige protocollen om de polymerisatieactiviteit van FtsZ te monitoren en bespreken we de invloed van de buffersamenstelling. De protocollen kunnen worden gebruikt om de interactie van FtsZ met regulerende eiwitten of antibacteriële geneesmiddelen die de polymerisatie van FtsZ beïnvloeden, te bestuderen.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tijdens bacteriële celdeling, het essentiële eiwit FtsZ assembleert in het midden van de cel naar het zogenaamde Z-ring. FtsZ polymeriseert in lange filamenten in aanwezigheid van GTP in vitro, en de polymerisatie wordt geregeld door verscheidene accessoire eiwitten. FtsZ polymerisatie is uitgebreid bestudeerd in vitro middels basistechnieken zoals lichtverstrooiing, sedimentatie, GTP hydrolyse assays en elektronenmicroscopie. Bufferomstandigheden invloed zowel de polymerisatie eigenschappen van FtsZ, en het vermogen van FtsZ om te interageren met regulerende eiwitten. We beschrijven hier protocollen voor FtsZ polymerisatie studies en voorwaarden en controles te valideren met behulp van Escherichia coli en Bacillus subtilis FtsZ als model eiwitten. Een lage snelheid sedimentatie test wordt ingevoerd dat de studie van de interactie van FtsZ maakt met eiwitten die bundelen of buisvormig maken FtsZ polymeren. Een verbeterde GTPase assay protocol wordt beschreven dat het testen mogelijk maaktGTP hydrolyse van de tijd met verschillende omstandigheden in een 96-well plaat opstart, met gestandaardiseerde incubatietijden dat variatie in kleurontwikkeling in de fosfaat detectiereactie schaffen. De voorbereiding van de monsters voor lichtverstrooiing studies en elektronenmicroscopie wordt beschreven. Verscheidene buffers worden gebruikt om geschikte pH en zoutconcentratie voor FtsZ polymerisatie studies stellen. Een hoge concentratie van KCl is het beste voor de meeste experimenten. Onze methoden bieden een uitgangspunt voor de in vitro karakterisatie van FtsZ, niet alleen van E. coli en B. subtilis maar van andere bacterie. Als zodanig kunnen de werkwijzen worden gebruikt voor onderzoek naar de interactie van FtsZ met regulerende proteïnen of het testen van antibacteriële geneesmiddelen die FtsZ polymerisatie kan beïnvloeden.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De essentiële bacteriële eiwit FtsZ is de best gekarakteriseerde eiwitten van de bacteriële celdeling machines. FtsZ is de prokaryote homoloog van tubuline en polymeriseert in vitro in een GTP-afhankelijke wijze. FtsZ is een zeer aantrekkelijk doelwit voor nieuwe antibiotica vanwege de geconserveerde aard en uniciteit aan bacteriën 1,2. Begin celdeling FtsZ vormt een cytokinetische ring midcell, dat als matrix voor de assemblage van andere celdeling proteïnes. Vorming van de Z-ring is van cruciaal belang voor een correcte lokalisatie van de divisie vlak. De assemblage dynamiek van FtsZ worden gereguleerd door verschillende accessoire eiwitten, zoals (afhankelijk van de bacteriesoort) MinC, SepF, ZapA, UgtP en EzrA 2. FtsZ polymerisatie is intensief bestudeerd in vitro en veel verschillende structuren, waaronder rechte protofilamenten, gebogen protofilamenten, bladen van filamenten, filamentenbundels en pijpen van filamenten des geweestcribed afhankelijk van het samenstel buffer, nucleotide en bijkomende eiwitten opgenomen in de test 3. De architectuur van FtsZ protofilamenten in vivo is nog niet volledig begrepen, hoewel elektronen cryotomography experimenten Caulobacter crescentus suggereren dat de Z-ring is samengesteld uit relatief korte, niet-continue enkele protofilamenten zonder uitgebreide bundeling 4.

In vitro, de polymerisatie eigenschappen van FtsZ en de interactie van FtsZ met de eiwitten zijn gevoelig voor de samenstelling van de reactiebuffer. Zo Recent beschreven wij de interactie site SepF de FtsZ C-terminus en toonde dat een FtsZ B Δ16 C-eindstandige afknotting niet langer bindt aan SepF 5. In een eerdere studie over de SepF-FtsZ B interactie, afkappen een soortgelijke FtsZ B Δ16 nog cosedimented met SepF, die suggereerde dat SepF bindt aan een tweede locatie op FtsZ 6. Het verschil tussen deze studies was de samenstelling van de reactie buffers-bij pH 7.5 was er geen cosedimentation van SepF met de FtsZ afkappen, terwijl bij een pH van 6,5 was er cosedimentation. Gündoğdu et al.. opgemerkt dat SepF niet functioneel en neerslaat bij pH 6,5 7, waaruit blijkt dat de waargenomen cosedimentation bij pH 6,5 wordt waarschijnlijk veroorzaakt door precipitatie van SepF plaats van interactie met de FtsZ B Δ16 C-terminale afgeknotte. De invloed van pH en KCl concentratie op de polymerisatie van FtsZ eerder onderzocht. Polymeren van E. coli FtsZ (FtsZ Ec) bij pH 6,5 zijn langer en overvloediger dan gevormd bij neutrale pH 8,9. Tadros et al.. de polymerisatie van FtsZ Ec bestudeerd in aanwezigheid van monovalente kationen merken dat K + binding wordt gelinkt aan FtsZ Ec polymerisatie en is cruciaal voor FtsZ activiteit 10. De pH is meer critical wanneer de interactie van FtsZ met andere eiwitten bestudeerd, zoals blijkt uit het voorgaande voorbeeld van SepF en de pH afhankelijkheid van het remmende effect van MinC op FtsZ 11. Aangezien zowel pH en zoutconcentratie de interactie van FtsZ invloed kunnen met andere eiwitten, is het belangrijk om de juiste voorwaarden en controles voor de FtsZ polymerisatie studies kiezen.

Hier beschrijven we protocollen FtsZ polymerisatie en GTPase activiteit te bestuderen door lichtverstrooiing, elektronenmicroscopie, sedimentatie, en GTPase assays. Rechte hoek lichtverstrooiing is een standaard methode om FtsZ polymerisatie studeren in real time 12. We introduceerden een aantal verbeteringen aan de sedimentatie en GTPase test. We presenteren in detail hoe de monsters voor te bereiden op lichtverstrooiing en elektronenmicroscopie. Verschillende buffers die in de literatuur FtsZ polymerisatie studie werden getest en beschrijven we de beste voorwaarden voor elk experiment. We laten ook zien welke controles moeten wordengeïntroduceerd om de beste gegevens te verkrijgen.

Deze methoden maken een snelle studie van FtsZ polymerisatie, activiteit en interactie met andere eiwitten met behulp van eenvoudige methoden en apparatuur die beschikbaar is in de meeste laboratoria. Meer geavanceerde methoden om FtsZ polymerisatie studeren bestaan, maar vaak toegang tot meer gespecialiseerde apparatuur en / of wijzigen van FtsZ met fluorescerende labels 8,13,14 vereisen. De eenvoudige methoden beschreven in dit document worden geïllustreerd aan de hand FtsZ van B. subtilis en E. coli, de meest voorkomende Gram + en Gram-model organismen. De protocollen kunnen worden aangepast aan andere FtsZ eiwit. Gebaseerd op inleidende tests met deze nieuwe FtsZs, kleine veranderingen over tijd, buffer of incubatietemperatuur nodig zijn voor een optimaal resultaat. De hier beschreven experimenten moeten helpen bij het vinden van deze optimale omstandigheden.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

FtsZ gelabeld eiwitten werden gezuiverd zoals eerder beschreven 11,15, gedialyseerd tegen 20 mM Tris / HCl (pH 7,9), 50 mM KCl, 1 mM EGTA, 2,5 mM MgAc en 10% glycerol en bewaard bij -80 ° C. Onder deze omstandigheden kan het eiwit worden bewaard dan 2 jaar zonder significant verlies van activiteit. Het eiwit moet worden bewaard in 100 ul aliquots ontdooien en bevriezen van het monster te voorkomen. Na ontdooien kan het monster bij 4 ° C worden bewaard maximaal een week. FtsZ oplosbaar is bij hoge concentraties en kan op 7-10 mg / ml worden opgeslagen. Het is belangrijk om de eiwitconcentratie hoog te houden om ongewenste effecten van opslagbuffer componenten in latere experimenten voorkomen. Daarom moet opslagconcentratie zorgen voor een verdunning FtsZ ten minste 10x glycerol concentratie lager dan 1% te brengen en de concentratie van de andere componenten van de dialyse buffer in het reactiemengsel minimaliseren. FtsZ polymerisatie kan ook worden beïnvloed door de aanwezigheid van hoge natrium 9 of imidazol concentraties dus deze componenten dient te worden verwijderd uit de polymerisatie buffer. SepF werd gezuiverd zoals beschreven 7 en opgeslagen in elutiebuffer bij -80 ° C. Alternatieve gepubliceerde procedures voor zuivering van FtsZ van E. coli en B. subtilis en verwijzingen naar de procedures voor zuivering van FtsZ vanuit verschillende bronnen zijn samengevat in Tabel 1 (zie representatieve resultaten sectie).

1. Monstervoorbereiding

  1. Bereid polymerisatie buffers:
    1 50 mM Hepes / NaOH, pH 7,5
    2 25 mM PIPES / NaOH, pH 6,8
    3 50 mM MES / NaOH, pH 6,5
    4 50 mM Hepes / NaOH, pH 7,5, 50 mM KCl
    5 25 mM PIPES / NaOH, pH 6,8, 50 mM KCl
    6 50 mm MES / NaOH, pH 6,5, 50 mM KCl
    7 50 mM Hepes / NaOH, pH 7,5, 300 mM KCl
    8 25 mM PIPES / NaOH, pH 6,8, 300 mM KCl
    9 50 mM MES / NaOH, pH 6,5, 300 mM KCl
  2. Filter steriliseren alle buffers met behulp van een 22 micrometer membraan filter.
  3. Bereid 100 mM GTP, BBP en MgCl2 voorraad oplossingen in elk polymerisatie buffer uit (1).
  4. Preclear de eiwitten door spinnen bij 100.000 xg gedurende 20 min bij 4 ° C voor alle experimenten.

2. FtsZ Sedimentatie Assay

  1. Bereid het reactiemengsel door toevoeging van MgCl2 en FtsZ een van de polymerisatie buffers (zie monstervoorbereiding punt 1) in buizen geschikt centrifugatie bij hoge snelheid. Totale hoeveelheid moet 49 pi zijn met MgCl2 bij 10 mM en FtsZ bij 12 uM in 50 pl eindvolume.
  2. Pkant de buis in een incubator onder schudden functie, incubeer gedurende 2 min bij 30 ° C bij 300 rpm (alternatief kan het monster worden voorzichtig aangetikt en kort microfuge gevolgd door voorverwarmen bij 30 ° C).
  3. Begin polymerisatie door toevoeging van 1 pi van GTP of BBP voorraadoplossing in dezelfde buffer zoals gebruikt in het experiment (eindconcentratie van 2 mM). Incubeer gedurende 10 min of 2 (bij buffers met 50 mM KCl en 300 mM KCl, respectievelijk) bij 30 ° C bij 300 rpm (of in een incubator met schudden functie).
  4. Breng de buizen een ultracentrifuge rotor en spin beneden voor 10 min bij 350.000 xg (89.700 rpm gedurende TLA 120.1 rotor) bij 25 ° C.
  5. Na het spinnen, voorzichtig de buizen uit de rotor en onmiddellijk Breng de bovenste in een schone buis. Bereid monsters voor SDS-PAGE door het toevoegen van 20 pl supernatant aan 20 ui 2x monsterbuffer. Kook gedurende 10 minuten bij 98 ° C.
  6. Voeg 50 ul van 2x monsterbuffer de pellet fractie bevattende FtsZ polymeren. Plaats de ultracentrifuge buis in een 2 ml buis. Resuspendeer de pellet door koken gedurende 10 minuten bij 98 ° C, voeg 50 pl gedemineraliseerd H2O het monster dezelfde 2x verdunning de supernatant monster maken.
  7. Draai de ultracentrifuge buis ondersteboven in de 2 ml buis en spin down gedurende 5 minuten in een Eppendorf centrifuge bij 18.000 x g. Verwijder de ultracentrifuge buis van de 2 ml buis.
  8. Belasting 10 pi van elke supernatant en pellet monster naast elkaar op een 10% SDS-PAGE gel. Voer de gel bij 150 V.
  9. Vlekken op de gel met Coomassie Brilliant Blue G-250 en bewaar ze voor kwantificering.

3. FtsZ Sedimentatie Assay bij Slow Spin

  1. Bereid polymerisatie oplossing zoals in stap 2, voeg SepF en / of FtsZ (eindconcentratie 12 uM). Deze experimenten kunnen worden uitgevoerd in Beckman disposable 1,5 ml buizen in combinatie met een TLA-55 rotor.
  2. Plaats de buis in een incubator met schudden functies en incubeer gedurende 2 min bij 30 ° C bij 300 rpm.
  3. Begin polymerisatie door de toevoeging van 1 pi van GTP of BBP van een voorraadoplossing (eindconcentratie 2 mM), incubeer gedurende 20 minuten bij 30 ° C bij 300 rpm.
  4. Spin down gedurende 15 min bij 24.600 xg (20.000 rpm voor TLA 55 rotor) bij 25 ° C.
  5. Verwijder de bovenstaande vloeistof en breng in een schone buis worden 20 ul en breng in 20 ui 2x monsterbuffer. Kook gedurende 10 minuten bij 98 ° C.
  6. Voeg 50 ul van 2x monsterbuffer om fractie pellet bevattende polymeren en resuspendeer door koken gedurende 10 minuten bij 98 ° C, voeg 50 pl gedemineraliseerd H2O
  7. Belasting 10 pi van elke supernatant en pellet monster naast elkaar op een 10% SDS-PAGE gel. Voer de gel bij 150 V.
  8. Vlekken op de gel met Coomassie Brilliant Blue G-250 en bewaar ze voor kwantificering.

4. Kwantificering van de FtsZ Sedimentatie Testen

  1. Maak een foto van de Coomassie stained gel met behulp van een gel-documentatiesysteem (bv. LAS-4000, Fujifilm).
  2. Open het imago van de gel in een programma geschikt is voor densitometrische analyse van gels (bv. AIDA beeldanalysator programma (RAYTEST)) en beschrijf analyse in dit programma hieronder.
  3. Klik op de "Evaluatie" knop in de werkbalk.
  4. Selecteer de "2D Densitometrie" uit de lijst en klik op OK.
  5. In het hoofdmenu, klik op "Evaluatie" en kies de "Regio Bepaling" entry.
  6. Om een ​​regio op de gel maken, klikt u op het symbool van Auto-contour gereedschap in de regio Bepaling toolbox.
  7. Klik in de linkerbovenhoek van het eiwit band op de gel, houd de muisknop ingedrukt en sleep het naar de gewenste rechter einde van de band en laat de muisknop los.
  8. Mark elk FtsZ / SepF band op dezelfde manier.
  9. Alle informatie over de evaluatie van de toegewezen regio's vindt u in de regio Report. Om de Regio verkrijgenn Report, klik op de "Show regio Report" knop in de regio Bepaling toolbox.
  10. Om het rapport te exporteren, in het hoofdmenu, klik op Bestand en kies "Exporteren à 2D Regio Report" entry.
  11. In de regio verslag, moet de intensiteit van ieder geschapen regio te vinden. Bereken het percentage eiwit (FtsZ, regulerend eiwit) in de pellet met de intensiteitswaarden van het verslag.

5. 90 ° lichtverstrooiing

  1. Zet een fluorescentie spectrometer (bijv. AMINCO-Bowman Series 2), zodat de lamp op te warmen gedurende enkele minuten om de thermische schommelingen te vermijden en zet een circulerend waterbad om de cuvet kamer temperatuur op 30 ° C te houden
  2. Definieer de operationele parameters van de spectrometer: detector hoge spanning 300 V, emissie en excitatie golflengte: 350 nm, spleetbreedte: 4 nm. Merk op dat veel spectrometers het signaal automatisch aanpassen aan het begin van een experiment om een ​​certain percentage (bijvoorbeeld 60%) van de maximale. Dit veroorzaakt een scatter signaal om te gaan buiten bereik zodra GTP wordt toegevoegd aan polymeriseren FtsZ. Het is verstandig om eerst de juiste signaalversterking-detector hoogspanning-voor maximale polymerisatie tot stand brengen voordat het starten van een reeks experimenten.
  3. Programmeer een data-acquisitie protocol. Kies op tijd gebaseerde overname, met een looptijd van 3600 sec.
  4. Zorgvuldig schoonmaken een fluorescentie cuvet met water en ethanol, eventueel-ultrasone trillingen in een waterbad bij kamertemperatuur gedurende 5 minuten. In dit protocol werden cuvetten met een weglengte van 1 cm en een volume van 200 ul gebruikt en opgeslagen opslagoplossing (0,5-1% Hellmanex). Als alternatief kan eenmalig gebruik UV-compatibel plastic cuvetten (UVette, Eppendorf) worden gebruikt.
  5. Bereid 294 ul van een master mix van de polymerisatie buffer (zie monstervoorbereiding punt 1) met 10 mM MgCl2 en 12 uM FtsZ als uiteindelijke concentratie berekend voor 300 ul, en vortex.
  6. Breng 196 pi van de polymerisatie buffer om de cuvet en plaats deze in spectrometer. Incubeer gedurende 2 minuten bij 30 ° C.
  7. Start de data-acquisitie en wacht 90 seconden om te controleren of het signaal stabiel is.
  8. Voeg 4 pi van 100 mM GTP of BNP (eindconcentratie 2 mM) tot een uiteindelijk reactievolume van 200 ul bereiken pipet op en neer met een groter volume pipet te mengen en opnieuw acquisitie.

6. Transmissie Elektronen Microscopie

  1. Bereid monsters voor de FtsZ sedimentatie assay (het volume kan worden verminderd tot 10 ui eindvolume materiaal slaan).
  2. Na de incubatietijd dien 2 pl van het monster in een gloed ontladen 400 mesh met koolstof beklede koperen rooster, incubeer gedurende 15 sec.
  3. Dep het net droog door voorzichtig aan te raken of te slepen het net parallel of loodrecht op een stuk filtreerpapier.
  4. Vlekken op het rooster met 4 ui van een 2% uranyl-acetaat oplossing. Blot het net droog als beschreven in stap 6.3.
  5. Bekijk het rooster in een Philips CM120 elektronenmicroscoop werkend bij 120 kV bij 39.200 X vergroting.

7. GTP hydrolyse Assay

De opzet van het experiment is ontworpen zodanig dat GTP hydrolyse van FtsZ wordt na verscheidene reactietijden door mengen van het reactiemengsel met malachietgroen. Zo tijde van de kleurontwikkeling malachietgroen is hetzelfde voor elk monster.

  1. Bereid 1,5 ml 2 mM GTP in een van de polymerisatie buffers (zie monstervoorbereiding, punt 1).
    Bereid een 0-40 uM fosfaat standaard oplossing in een polymerisatie buffer en bereid malachietgroen be reagens zoals beschreven in de POMG-25H (bioassays) kit. Als alternatief kan de actieve reagentia worden bereid in eigen huis volgens de protocollen beschreven door Lanzetta et al.. 16
  2. Bereid mastermengsels in een totaal volume van 360 pi: Ik 24 uM FtsZ B, 20 mM MgCl2, polymerisatie buffer II 12 uM FtsZ Ec, 20 mM MgCl2, polymerisatie buffer III (controle 1) 24 uM FtsZ B, 2 mM EDTA, polymerisatie buffer IV (controle 2) 12 uM FtsZ Ec, 2 mM EDTA, polymerisatie buffer
  3. Pipetteer 20 ul aliquots van de mastermengsels, 100 ul fosfaat standaarden en 180 ul 2 mM GTP in een qPCR 96-wells plaat in de volgende volgorde:
    Een B C D E F G H
    1 III III Ik Ik IV IV II II
    2 III III Ik Ik IV IV II II
    3 III III Ik Ik IV IV II II
    4 III III Ik Ik IV IV II II
    5 III III Ik Ik IV IV II II
    6 III III Ik Ik IV IV II II
    7 III III Ik Ik IV IV II II
    8 III III Ik Ik IV IV II II
    9 PS PS PS PS PS PS PS PS
    10 PS PS PS PS PS PS PS PS
    11
    12 GTP GTP GTP GTP GTP GTP GTP GTP

    PS - fosfaat standaard
  4. Plaats de qPCR plaat in een PCR-machine met de ingesteld op 40 min cyclus bij 30 ° C programma
  5. Bereid 20 pi aliquots van malachite groene werken reagens in een 96-wells plaat. Voeg 60 ul van de buffer polymerisatie van het experiment lanen 1'-8 '. Het monster wordt verdund 4x vergeleken met de fosfaat-standaard, kunt u overwegen dit feit tijdens de laatste berekeningen.
    Een B C D E F G H
    1 ' III III Ik Ik IV IV II II
    2 ' III III Ik Ik IV IV II II
    3 ' III III Ik Ik IV IV II II
    4 ' III III Ik Ik IV IV II II
    5 ' III III Ik Ik IV IV II II
    6 ' III III Ik Ik IV IV II II
    7 ' III III Ik Ik IV IV II II
    8 ' III III Ik Ik IV IV II II
    9 ' PS PS PS PS PS PS PS PS
    10 ' PS PS PS PS PS PS PS PS
  6. Voeg 20 ul van GTP naar baan 1, pipet op en neer te mengen, start timer (dit is de starttijd punt voor de 30 min reactie).
  7. Na 10 min, 30 sec toevoegen GTP naar baan 2, pipet op en neer te mengen (20 min reactie).
  8. Na 16 min toevoegen GTP naar baan 3, pipet op en neer te mengen (15 min reactie).
  9. Na 21 min, 30 sec toevoegen GTP naar baan 4, pipet op en neer om te mengen (10 min reactie).
  10. Na 25 min toevoegen GTP naar baan 5, pipet op en neer te mengen (7 min reactie).
  11. Na 27 min, 30 sec toevoegen GTP naar baan 6, pipet op en neer te mengen (5 min reactie).
  12. Na 29 min toevoegen GTP naar baan 7, pipet op en neer te mengen (4 min reactie) ..
  13. Na 30 min overdracht 20 ul van baan 1 naar baan 1 ', pipet op en neer te mengen (beginpunt van malachietgroen kleur ontwikkeling voor de 30 min reactie).
  14. Na 30 min, 30 sec overdracht 20 ul van rijstrook 2-2 ', pipet op en neer te mengen (beginpunt van malachietgroen kleur ontwikkeling voor de 20 min reactie).
  15. Herhaal deze stap voor de lanen 3-7 om de 30 sec.
  16. Na 33 min, 30 sec voeg 20 ul van GTP naar baan 8, pipet op en neer om te mixen en te dragen 20 pl naar baan 8 ', pipet op en neer te mengen (0 min reactie en starttijd punt voor malachietgroen kleur ontwikkeling voor de reactie).
  17. Na 34 min toe 80 ul van rijstrook 9-9 ', pipet op en neer te mengen (de starttijd punt voor malachietgroen kleur ontwikkeling voor de fosfaat standaard 1).
  18. Na 34 min 30 sec overdracht 80 ul van rijstrook 10 tot 10 ', pipet op en neer te mengen (de starttijd punt voor malachietgroen kleur ontwikkeling voor de fosfaat standaard 2).
  19. Verwijder alle luchtbellen uit de monsters en incubeer de plaat bij kamertemperatuur gedurende nogmaals 25 min30 sec.
  20. Plaats de plaat in 96-well plaatlezer.
  21. Na 60 min meten de plaat 10x elke 30 sec bij golflengte 630 nm (malachietgroen kleur ontwikkeling is nu 30 minuten voor de eerste reactie). Elke meting komt overeen met elke tijdstip van stappen 7,6-7,12 en 7,16 en moet apart worden berekend tijdens een data-analyse.
  22. Bereken het vrije fosfaat in elk monster met behulp van de fosfaat standaardijkkromme.
  23. Plot de gegevens als fosfaat vrijkomen in de tijd, en bereken de FtsZ GTP hydrolyse activiteit van het lineaire bereik van de curve.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De zuivering van FtsZ uit verschillende bacteriële bronnen is beschreven in de literatuur en wordt samengevat in Tabel 1.

BronMethodeModificatieVerkregen opbrengst [mg/L van de cultuur]>Referenties
B. subtilis1) Ammoniumsulfaat precipitatie/ionenuitwisselingschromatografienee40Dit werk, 11,15
2) AfiniteitschromatografieHis-tagND17
E. coli1) Ammoniumsulfaat precipitatie/ionenuitwisselingschromatografienee35Dit werk, 11,15
2) Calcium precipitatie, ionenuitwisselingschromatografienee4018
Methanococcus jannaschii1) Afiniteitschromatografie onder denaturerende omstandigheden/hervouding/ammoniumsulfaat precipitatie/gel filtratieHis-tag1,319
2) Afiniteitschromatografie/ gel filtratieHis-tagND20
Thermotoga maritimaIonenuitwisselingschromatografie/gel filtratienee6,719
Pseudomonas aeruginosaAffiniteitschromatografie/gel filtratieStrep-tag, His-tagND21
Mycobacterium tuberculosis1) Afiniteit/ionenuitwisselingschromatografieneeND22
2) Afiniteitschromatografie/ gel filtratienee3023
Aquifex aeolicusAffiniteitschromatografie/gel filtratieHis-tag, C-terminaal afgesneden (331-367)ND24
Caulobacter crescentusIonenuitwisselingschromatografie/ammoniumsulfaat precipitatie/gel filtratieneeND25

Tabel 1. Beschreven FtsZ zuiveringsprotocollen. ND: niet bepaald.

Sedimentatie van FtsZ-polymeren

Aanvankelijk gebruikten we twee verschillende snelheden om FtsZ-polymeren neer te laten bezinken. We ontdekten dat alleen bij een snelheid van 350.000 x g enkele polymeren van FtsZEc worden neergezet (Figuur 1) terwijl bij 190.000 x g alleen bundels van FtsZBs aanwezig zijn in de pelletfractie (gegevens niet getoond). Daarom werd 350.000 x g gebruikt in onze verdere experimenten. Het percentage gepolymeriseerd FtsZEc en FtsZBs is vergelijkbaar bij 50 mM KCl, hoewel de lichtverstrooiingsexperimenten een veel hoger verstrooiingssignaal voor FtsZBs onthulden. Dit is te wijten aan bundels gevormd door FtsZBs die meer licht verstrooien dan enkele polymeren van FtsZEc. Het was niet mogelijk om een hoge hoeveelheid FtsZ-polymeren in de pelletfractie te verkrijgen in het experiment met 300 mM KCl voor zowel FtsZEc als FtsZBs (Figuur 1). We schrijven dit toe aan een combinatie van snelle demontage van de FtsZ-structuren en verminderde bundeling van de filamenten.

Sedimentatie van FtsZ-SepF tubuli

Om de interactie van FtsZ met bepaalde activatoren te analyseren, kunnen sedimentatie-assays worden uitgevoerd bij lagere centrifugeersnelheden. Bij deze snelheid kunnen alleen grote structuren van FtsZ worden gepelleted, bijv. de grote tubuli gevormd door SepF-ringen en FtsZBs-filamenten5, of de bundels gevormd door FtsZ en ZapA. We gebruikten lagere centrifugatie (24.600 x g) om de haalbaarheid van deze benadering voor de tubuli gevormd door FtsZ en SepF aan te tonen. FtsZ werd alleen boven de achtergrondniveaus in de pellet teruggevonden wanneer zowel SepF als GTP aanwezig waren in het monster (Figuur 2), en de aanwezigheid van SepF heeft geen invloed op de GTPase-activiteit van FtsZ7, wat aantoont dat FtsZ volledig actief is in de aanwezigheid van SepF. Specifieke sedimentatie van SepF en FtsZ is ongeveer 45% van de totale SepF en 15% van de totale FtsZ (vergeleken met materiaal dat sedimenteert wanneer GDP wordt toegevoegd). Dit toont aan dat de SepF-FtsZ-tubuli meer SepF bevatten dan FtsZ. Dit kan zijn omdat veel SepF-ringen de FtsZ-SepF-tubuli organiseren5,7. De exacte stoichiometrie van SepF-FtsZ in deze tubuli is niet bekend, maar onze resultaten suggereren dat er meer SepF aanwezig is dan FtsZ.

Polymerisatie- en bundelingseigenschappen van FtsZEc en FtsZBs

Om de polymerisatie-efficiëntie van FtsZBs en FtsZEc in verschillende buffers te karakteriseren, analyseerden we beide eiwitten door middel van lichtverstrooiing bij een hoek van 90°. Bij 50 mM KCl geeft FtsZBs een 20-40-voudig hoger lichtverstrooiingssignaal dan FtsZEc afhankelijk van de buffer-pH (Figuur 3A

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

We beschrijven een reeks methoden die een snelle analyse van FtsZ-activiteit en de interactie ervan met andere eiwitten mogelijk maakt. Lichtverstrooiing, sedimentatie en GTPase-assays evenals elektronenmicroscopie zijn op grote schaal gebruikt om FtsZ-polymerisatie te bestuderen. We hebben enkele verbeteringen aangebracht aan bestaande protocollen, we toonden de invloed van verschillende omstandigheden op FtsZ-assemblage aan, en we stellen controles voor die in FtsZ-studies zouden moeten worden opgenomen.

We introduceren lage snelheid centrifugatie om grote structuren te onderscheiden die worden gevormd door de associatie tussen FtsZ en zijn interacterende eiwitten van FtsZ-polymeren. Deze methode heeft twee voordelen ten opzichte van de standaard sedimentatie-assay. Ten eerste wordt er geen achtergrond gevormd door de FtsZ-polymeren in de pelletfractie omdat ze niet worden afgescheiden bij 24.600 x g. Ten tweede kan de hoeveelheid FtsZ die aanwezig is in de structuur die wordt gevormd met een interacterend eiwit worden berekend vanuit het gel. Twee kritieke stappen in deze methode zijn de incubatietijd en de GTP-concentratie. Het is belangrijk om de grote eiwitstructuur te centrifugeren wanneer deze compleet is, maar voordat deze demonteert wanneer al het GTP is gehydrolyseerd. De beste controle voor deze studie is polymerisatie van FtsZ met GDP. Er is één potentiële beperking van de assay. FtsZ vormt een stabiel complex met SepF, dat gemakkelijk kan worden afgescheiden bij 24.600 x g. Als de sedimentatie met een andere activator of een drug die FtsZ-polymeren bundelingt wordt uitgevoerd, kan het nodig zijn om de assay aan te passen. Dit kan worden gedaan door de incubatietijd te veranderen of de centrifugatiesnelheid te verhogen.

Juiste voorbereiding van het monster is het belangrijkst voor lichtverstrooiingsexperimenten. Eiwitten moeten worden voorafgezuiverd door te centrifugeren en alle buffers moeten worden gefilterd voor gebruik. Als er aggregaten in het monster aanwezig zijn, zullen ze een stabiel signaal verstoren dat wordt verkregen van FtsZ-polymeren. Voor de analyse van de FtsZ-structuren door elektronenmicroscopie is de voorbereiding van een raster de belangrijkste stap. De tijd van monsterincubatie op het raster zal het effect hebben van het produceren van meer of minder gecompacteerde polymeren. Voor bundels van FtsZBs moet de incubatietijd korter zijn dan voor FtsZEc en FtsZBs bij hoge KCl-concentratie. We gebruikten een concentratie van 12 µM voor elk monster om de resultaten te kunnen vergelijken. Voor FtsZBs bij 50 mM KCl moet een lagere FtsZ-concentratie worden gebruikt, aangezien 12 µM resulteerde in een volledige verzadiging van het raster. Dit maakt de polymeren zeer gecompacteerd en moeilijk te detecteren. Minder gecompacteerde polymeren zijn beter te detecteren op EM.

De GTPase-assay is het enige experiment dat wordt gebruikt om de activiteit te bestuderen in plaats van de structuren van FtsZ. Mg2+ is noodzakelijk voor GTP-omzet in FtsZ-polymeren. Dus, in afwezigheid van Mg2+, hydrolyseert FtsZ geen GTP. Daarom is een monster zonder Mg2+ de juiste controle in deze assay, maar kationen van Mg zijn aanwezig in de FtsZ-opslagoplossing. Ze kunnen worden verwijderd door toevoeging van 1 mM EDTA aan het controlemonster. De kritieke stap in deze assay is de incubatietijd. Het is belangrijk om de activiteit van FtsZ na een bepaalde tijd te stoppen. Dit wordt bereikt door het FtsZ-monster over te brengen naar een malachietgroene oplossing in een 96-wells plaat. De ontwikkeling van de malachietgroene kleur is echter een continu proces. Dus de metingen moeten op hetzelfde tijdstip worden genomen voor elk monster. Met behulp van een goed gepland GTP-toevoegprotocol met metingen die elk 30 seconden uit elkaar worden genomen in een vastgestelde volgorde, is het mogelijk om dezelfde incubatie- en monsterverwerkingstijd te verkrijgen voor elk tijdstip. Een andere kritieke stap is het kiezen van de concentratie van het eiwit voor het experiment. In het experiment gebruikten we twee verschillende concentraties voor FtsZEc en FtsZBs. GTP-hydrolyse is veel sneller voor FtsZEc in vergelijking met FtsZBs. De GTPase-activiteit van FtsZEc onder gekozen omstandigheden en bij 12 µM is lineair voor maximaal 5 min en na die tijd plateaus de hydrolysesnelheid. Daarom is het moeilijk om gegevens uit het experiment te interpreteren wanneer het onder deze omstandigheden wordt uitgevoerd. In dit geval moet FtsZEc worden gebruikt bij een lagere concentratie dan FtsZBs om de activiteiten van beide eiwitten te kunnen vergelijken. De GTPase-activiteit van FtsZ's uit verschillende bronnen kan variëren. Dus moet de juiste concentratie worden gekozen. De concentratie voor FtsZ-polymerisatie moet wel boven de kritische concentratie liggen (in het algemeen van 2,5-10 µM). De dynamica van FtsZ-assemblage en demontage is ook belangrijk. Sommige eiwitten vertonen een significante vertraging in polymerisatie na toevoeging van GTP, zoals getoond voor FtsZBs bij 50 mM KCl. Het is nuttig om de lichtverstrooiingsassay uit te voeren vóór de GTPase-assay om de tijd van assemblage en demontage van FtsZ-polymeren te benaderen. Daarna kunnen de incubatietijd en de concentratie van eiwit worden gekozen. Aangezien de gekozen omstandigheden voor FtsZ-polymerisatie cruciaal zijn, is het belangrijk om de juiste pH en KCl-concentratie in elke methode te gebruiken. In dit werk bestudeerden we 9 verschillende buffers met een pH variërend van 6,5-7,5 en KCl-concentraties van 0 M tot 300 mM. We merkten op dat de beste omstandigheid om FtsZ's van B. subtilis en E.coli en hun biologische activiteit te analyseren is bij een pH die dicht bij het fysiologische niveau ligt (7,5) samen met een hoge KCl-concentratie. Bij een hog

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Geen belangenconflicten zijn verklaard.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Het werk in ons laboratorium wordt gefinancierd door een VIDI-subsidie van de Nederlandse Organisatie voor Wetenschappelijk Onderzoek (aan DJS). We danken Marc Stuart en de afdeling Elektronenmicroscopie aan onze universiteit, voor hun hulp en het verlenen van toegang tot de transmissie-elektronenmicroscoop.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
GTPRoche10106399001Part 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7
Thickwall Polycarbonate TubesBeckman Coulter343776Part 2
Optima MAX-XP UltracentrifugeBeckman Coulter393315Part 2, 3
Polyallomer Tube with Snap-on CapBeckman Coulter357448Part 3
AIDA Bio-package, 1D, 2D, FLRaytest Isotopenmessgeräte GmbH15000001Part 4
Luminescence Image Analyzer LAS-4000FujifilmPart 4
Thermo Spectronic AMINCO-Bowman Luminescence SpectrometerSpectronic InstrumentsPart 5
Fluorescence CellHellma Analytics105-250-15-40Part 5
Square 400 Mesh, Copper, 100/vialElectron Microscopy SciencesG400-CuPart 6
CM120 Electron Microscope Operating at 120 kVPhilipsPart 6
96 ml x 0.2 ml PlateBIOplasticsB70501Part 7
Malachite Green Phosphate Assay KitBioAssay SystemPOMG-25HPart 7
PowerWave HT Microplate SpectrophotometerBioTekPart 7

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Haydon, D. J., Stokes, N. R., et al. An inhibitor of FtsZ with potent and selective anti-staphylococcal activity. Science. 321 (5896), 1673-1675 (2008).
  2. Adams, D. W., Errington, J. Bacterial cell division: assembly, maintenance and disassembly of the Z ring. Nat. Rev. Microbiol. 7 (9), 642-653 (2009).
  3. Erickson, H. P., Anderson, D. E., Osawa, M. FtsZ in bacterial cytokinesis: cytoskeleton and force generator all in one. Microbiol. Mol. Biol. Rev. 74 (4), 504-528 (2010).
  4. Li, Z., Trimble, M. J., Brun, Y. V., Jensen, G. J. The structure of FtsZ filaments in vivo suggests a force-generating role in cell division. EMBO J. 26 (22), 4694-4708 (2007).
  5. Król, E., van Kessel, S. P., van Bezouwen, L. S., Kumar, N., Boekema, E. J., Scheffers, D. J. Bacillus subtilis SepF binds to the C-terminus of FtsZ. PLoS One. 7 (8), e43293(2012).
  6. Singh, J. K., Makde, R. D., Kumar, V., Panda, D. SepF increases the assembly and bundling of FtsZ polymers and stabilizes FtsZ protofilaments by binding along its length. J. Biol. Chem. 283 (45), 31116-31124 (2008).
  7. Gündoğdu, M. E., Kawai, Y., et al. Large ring polymers align FtsZ polymers for normal septum formation. EMBO J. 30 (3), 617-626 (2011).
  8. Pacheco-Gomez, R., Roper, D. I., Dafforn, T. R., Rodger, A. The pH dependence of polymerization and bundling by the essential bacterial cytoskeletal protein FtsZ. PLoS One. 6 (6), e19369(2011).
  9. Mendieta, J., Rico, A. I., Lopez-Vinas, E., Vicente, M., Mingorance, J., Gomez-Puertas, P. Structural and functional model for ionic (K(+)/Na(+)) and pH dependence of GTPase activity and polymerization of FtsZ, the prokaryotic ortholog of tubulin. J. Mol. Biol. 390 (1), 17-25 (2009).
  10. Tadros, M., Gonzalez, J. M., Rivas, G., Vicente, M., Mingorance, J. Activation of the Escherichia coli cell division protein FtsZ by a low-affinity interaction with monovalent cations. FEBS Lett. 580 (20), 4941-4946 (2006).
  11. Scheffers, D. J. The effect of MinC on FtsZ polymerization is pH dependent and can be counteracted by ZapA. FEBS Lett. 582 (17), 2601-2608 (2008).
  12. Mukherjee, A., Lutkenhaus, J. Analysis of FtsZ assembly by light scattering and determination of the role of divalent metal cations. J. Bacteriol. 181 (3), 823-832 (1999).
  13. Chen, Y., Erickson, H. P. Rapid in vitro assembly dynamics and subunit turnover of FtsZ demonstrated by fluorescence resonance energy transfer. J. Biol. Chem. 280 (23), 22549-22554 (2005).
  14. Hou, S., Wieczorek, S. A., et al. Characterization of Caulobacter crescentus FtsZ protein using dynamic light scattering. J. Biol. Chem. 287 (28), 23878-23886 (2012).
  15. Mukherjee, A., Lutkenhaus, J. Dynamic assembly of FtsZ regulated by GTP hydrolysis. EMBO J. 17 (2), 462-469 (1998).
  16. Lanzetta, P. A., Alvarez, L. J., Reinach, P. S., Candia, O. A. An improved assay for nanomole amounts of inorganic phosphate. Anal. Biochem. 100 (1), 95-97 (1979).
  17. Ray, S., Kumar, A., Panda, D. GTP regulates the interaction between MciZ and FtsZ: a possible role of MciZ in bacterial cell division. Biochemistry. 52 (2), 392-401 (2013).
  18. Rivas, G., Lopez, A., et al. Magnesium-induced linear self-association of the FtsZ bacterial cell division protein monomer. The primary steps for FtsZ assembly. J. Biol. Chem. 275 (16), 11740-11749 (2000).
  19. Oliva, M. A., Cordell, S. C., Lowe, J. Structural insights into FtsZ protofilament formation. Nat. Struct. Mol. Biol. 11 (12), 1243-1250 (2004).
  20. Lowe, J., Amos, L. A. Crystal structure of the bacterial cell-division protein FtsZ. Nature. 391 (6663), 203-206 (1998).
  21. Cordell, S. C., Robinson, E. J., Lowe, J. Crystal structure of the SOS cell division inhibitor SulA and in complex with FtsZ. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 100 (13), 7889-7894 (2003).
  22. Chen, Y., Anderson, D. E., Rajagopalan, M., Erickson, H. P. Assembly dynamics of Mycobacterium tuberculosis FtsZ. J. Biol. Chem. 282 (38), 27736-27743 (2007).
  23. White, E. L., Ross, L. J., Reynolds, R. C., Seitz, L. E., Moore, G. D., Borhani, D. W. Slow polymerization of Mycobacterium tuberculosis FtsZ. J. Bacteriol. 182 (14), 4028-4034 (2000).
  24. Oliva, M. A., Trambaiolo, D., Lowe, J. Structural insights into the conformational variability of FtsZ. J. Mol. Biol. 373 (5), 1229-1242 (2007).
  25. Thanbichler, M., Shapiro, L. M. ipZ. a spatial regulator coordinating chromosome segregation with cell division in Caulobacter. Cell. 126 (1), 147-162 (2006).
  26. Buske, P. J., Levin, P. A. Extreme C terminus of bacterial cytoskeletal protein FtsZ plays fundamental role in assembly independent of modulatory proteins. J. Biol. Chem. 287 (14), 10945-10957 (2012).
  27. Mukherjee, A., Lutkenhaus, J. Analysis of FtsZ assembly by light scattering and determination of the role of divalent metal cations. J. Bacteriol. 181 (3), 823-832 (1999).

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

FtsZ PolymerizationLight Scattering AssaySedimentation AssayGTP Hydrolysis AssayElectron MicroscopyBuffer ConditionsPotassium ChlorideEscherichia coliBacillus subtilisProtein Interaction

Gerelateerde artikelen