Een gestandaardiseerde muismodel van subarachnoïdale bloeding door intraluminale Cirkel van Willis perforatie wordt beschreven. Vaatperforatie en subarachnoïdale bloeden worden bewaakt door intracraniële druk monitoring. Daarnaast zorgen verschillende vitale parameters worden geregistreerd en gecontroleerd om fysiologische omstandigheden te handhaven.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Een muizenmodel van subarachnoïdale bloeding
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
In deze video publicatie een gestandaardiseerd muismodel van subarachnoïdale bloeding (SAB) wordt gepresenteerd. Bloeden wordt geïnduceerd door endovasculaire Cirkel van Willis perforatie (CWP) en bewezen door intracraniële druk (ICP) monitoring. Waardoor een homogene bloed verdeling in subarachnoïdale ruimtes rond de arteriële circulatie en cerebellaire scheuren wordt bereikt. Dier fysiologie wordt onderhouden door intubatie, mechanische ventilatie, en continue on-line monitoring van diverse fysiologische en cardiovasculaire parameters: lichaamstemperatuur, systemische bloeddruk, hartslag, en hemoglobine verzadiging. Waardoor de cerebrale perfusiedruk kan goed worden gevolgd waardoor minder variabel volume van extravasatie van bloed. Dit maakt een betere standaardisatie van endovasculaire filament perforatie in muizen en maakt het hele model zeer reproduceerbaar. Het is dus direct beschikbaar voor farmacologische en pathofysiologische studies in wild type en genetischely veranderde muizen.
Inleiding
SAH is de beroerte subtype met de minst gunstige uitkomst voor patiënten: 40% van de patiënten overlijdt binnen een maand na de bloeding 1 en overlevenden hebben zelden een klinisch gunstig resultaat.
De grote meerderheid van spontane SAHS (80%) worden veroorzaakt door breuk van intracraniële aneurysmata die meestal gelegen langs de voorste en achterste communiceren slagader, de basilaire slagader, en midden cerebrale slagader (MCA) 2.
Dergelijke aneurysma's zijn moeilijk te modelleren in dieren en dus diermodellen van SAB zijn ofwel uitgevoerd door injectie van bloed in de subarachnoïdale ruimte / cerebrale ventrikels of endovasculaire perforatie van een subarachnoïdale vaartuig.
Autoloog bloed injectie in de cisterna magna is eenvoudig uit te voeren en reproduceerbaar het bloedvolume direct kan worden gecontroleerd 3. Helaas zijn sommige aspecten van de SAH pathofysiologie, bijvoorbeeld devatverwonding, kan niet worden gemodelleerd door deze procedure. Een andere technische benadering voor de inductie van SAH is de opening van een intracisternale ader 4.
De intraluminale CWP op de MCA aftakking schijnt de procedure die modellen de pathofysiologie bij mensen nauwst 5 zijn. De methode werd ontwikkeld en eerst beschreven in ratten Bederson en collega's en tegelijkertijd door Veelken 6,7 en collega's. Later werd het intraluminale perforatie model aangepast aan muizen 8,9. Een filament wordt in de externe halsslagader (ECA) geplaatst en schoof op naar de schedelbasis via de interne halsslagader (ICA). Op het vertakkingspunt van de MCA perforeert de gloeidraad het schip en induceert een bloeden in de subarachnoïdale ruimte aan de schedelbasis. Het bloed verdeelt dan in de resterende subarachnoïdale ruimte langs scheuren en bloedvaten. Bloeden wordt gestopt door stolselvorming op de plaats van perforatie, maar rebleedings, which zijn vaak schadelijk bij patiënten 10, kan optreden. Dienovereenkomstig, de endovasculaire filament model werd een veelgebruikt SAH model tijdens de afgelopen jaren. De meest genoemde nadeel van de gloeidraad perforatie model is dat bloeden volume niet direct kan worden gecontroleerd en kan derhalve variabel. Deze variabiliteit kan aanzienlijk worden verminderd door een strikte beheersing van dierlijke fysiologie en post-hemorragische ICP.
Muizen hebben het grote voordeel dat een groot aantal genetisch gemodificeerde stammen beschikbaar. Vanwege hun kleine omvang chirurgische procedures vaak complexer dan in grotere soorten, zoals ratten of konijnen. Daarom is de inkrimping van de technieken voor de ratten muizen vaak niet tot de gewenste resultaten, bijvoorbeeld als muizen hebben een zeer beperkte lichaamsgewicht en het bloedvolume invasieve technieken voor bloeddruk en gasanalyse en voor hemoglobine verzadiging en hartslagmoeten mogelijk worden toegepast wanneer. Dienovereenkomstig is het doel van de huidige publicatie het filament perforatie model SAH beschrijven muizen en aan hoe dit model in een gestandaardiseerde en zeer reproduceerbare wijze kan worden uitgevoerd.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
Alle chirurgische procedures werden onderworpen aan ethische toetsing en door de regering van Opper-Beieren (referentienummer: 55.2-1-54-2532.3-13-13 en -2532-136-11) goedgekeurd. Dieren mannelijke C57BL / 6 muizen met een lichaamsgewicht van ongeveer 25 g.
1. Bereiding van dieren
- Induceren verdoving door de invoering van de muis in een kamer. Spoel de kamer met 5% isofluraan tot het dier het bewustzijn verliest.
- Injecteer voorgemengd anesthesie intraperitoneaal: fentanyl (0,05 mg / kg), midazolam (5 mg / kg) en medetomidine (0,5 mg / kg). Controleer reflexen vóór en regelmatig tijdens de procedure. Reinject eenderde van het oorspronkelijke bedrag uur anesthesie te handhaven.
- Intubate orotracheally met een buis van een 20 G veneuze katheter 11. Voor intubatie fix het dier op een schuine platform (30 °), trek de tong met gebogen tang, visualiseren de stembanden onder een operatie microscoop en plaats de buis in de luchtpijptijdens inspiratie.
- Plaats de muis in een liggende positie en controleer de juiste plaatsing van de buis met een stuk katoen of een microcapnograph.
- Sluit de intubatie buis naar de respirator. Ventileren muis met luchtruimte aangevuld met 25% zuurstof met een frequentie van 180-220 ademhalingen / min en een slagvolume van 200-250 ul.
- Sluit de intubatie buis naar de microcapnograph. Handhaaf het eindexpiratoire pCO 2 bij 30 mmHg door het aanpassen van de ventilatie frequentie.
- Plaats een rectale sonde en plaats het dier op een verwarmingselement om 37 ° C lichaamstemperatuur te handhaven.
- Breng de ringvormige pulsoximeter sensor aan de rechter achterpoot.
- Open de huid boven de schedel met een schaar. De incisie moet ongeveer 0,5 cm lang en tussen oor en oog.
- Ontleden de linker temporale spier met een scalpel van het slaapbeen.
- Lijm de laser Doppler flowmeter (LDF) probe opde linker slaapbeen. Houd de sonde in een vaste stand totdat de lijm uithardt.
- Boor een gat van ongeveer 1,5 mm diameter met een tandartsboor in de linker temporale bot. Koel het bot met zoutoplossing om warmte te voorkomen.
- Steek de ICP sonde in de schedelholte. Naar voren te duwen zo dorsally mogelijk om hersenweefsel schade en bloeden te voorkomen.
- Als de sonde op de juiste plaats, op te lossen, en verzegelt het met cement. Laat het cement droog gedurende 5 minuten.
- Zet de muis voorzichtig naar rugligging.
- Voor continue bloeddrukmeting, katheteriseren de linker slagader.
- Sluit de femorale katheter om de bloeddrukmeter.
2. SAH Inductie
- Open de huid met een schaar van borstbeen tot kin (2 cm). Ontleden het bindweefsel botweg en duw de speekselklieren opzij.
- Expose de linker gemeenschappelijke halsslagader (CCA) en het mobiliseren van het. Behoud van denervus vagus, die dezelfde bindweefsel koker als CCA loopt. Verplaats craniale en bloot te leggen en te mobiliseren de ICA en de Rekenkamer gebruikmaking van dezelfde techniek.
- Ligeren de Rekenkamer zo ver craniaal mogelijk.
- Toren regelen twee ligations voor het filament rond de Europese Rekenkamer.
- Occlude de CCA en de ICA tijdelijk met microclips. Plaats de microclips met een microclip applicator. Zorg ervoor dat de klemmen correct worden toegepast door ze zachtjes te trekken terug.
- Maak een gat voor de gloeidraad inbrengen in het ECA met een vaartuig een schaar.
- Plaats een Pelvicol 5-0 filament met 12 mm lengte in de ECA.
- Sluit de plaats van inbrengen met een afgesproken ligatie.
- Verwijder de microclips met een microclip applicator van de CCA en de ICA.
- Advance de gloeidraad met een pincet in de ICA tot de ICP stijgt. Een plotselinge stijging van de ICP geeft bloeden inductie.
- Trek de gloeidraad onmiddellijk en afbinden van de Europese Rekenkamer door het sluiten van zowel prearranged ligeringen achtereenvolgens. Dit voorkomt bloeden uit de plaats van inbrengen.
- Hecht de huid wond.
- Controleer de fysiologische parameters van de dieren nog eens 20 minuten.
- Verwijder ICP en LDF sondes en hechtdraad de huid wond.
3. Einde Experiment
- Perfuseren het dier transcardiaal met 20 ml zoutoplossing (kamertemperatuur), gevolgd door 20 ml 4% PFA in PBS (4 ° C).
- Ontleden de hersenen uit de schedel. Snijd de schedel in het middellijn en tussen de orbitale holtes. Schil vervolgens het bot van de hersenen.
- Evalueer het bloed verdeling in de subarachnoïdale ruimte.
4. Overwegingen in de zaak van Survival Chirurgie (niet getoond in de video)
- Injecteer Carprofen (4 mg / kg subcutaan) voor postoperatieve analgesie direct na inductie van anesthesie. In de postoperatieve observatieperiode Carprofen (4 mg / kg subcutaan) wordt iedere 24 uur.
- In plaats van invasieve bloeddrukmeting gebruik maken van een niet-invasieve bloeddrukmeting systeem.
- Bij beëindiging van de anesthesie injecteren tegenwerkende middelen subcutaan: naloxon (1,2 mg / kg), flumazenil (0,5 mg / kg) en atipamezol (2,5 mg / kg).
- Extuberen het dier.
- Na het terugbrengen van reflexen zette het dier in een voorverwarmde kamer. Houd het dier bij ongeveer 32 ° C gedurende 24 uur.
- Dieren worden regelmatig gecontroleerd voor spontane ademhaling en hun algemene toestand tijdens de eerste uren na de operatie. Als de hersenstam wordt beïnvloed dieren hebben ademhalingsproblemen en moet worden gedood.
- Dieren worden dagelijks gecontroleerd op hun algemene conditie en het lichaamsgewicht en voor neurologische en sensorische stoornissen 15.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
Sterfte
Zodra de operatie techniek wordt beheerst de procedure niet ontlokken elke intra-operatieve sterfte. Ook bloeden kan op vrijwel alle dieren. Postoperatieve sterfte 30-40% meeste dieren sterven op dag 1 na operatie (figuur 5).
ICP waarden na SAH
De ICP voor bloeden is ongeveer 4 mmHg. Bloeden resulteert in een sterke toename van de ICP tot 120 mmHg. ICP waarden vervolgens te stabiliseren binnen 5 minuten bij ongeveer...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
Behandeling opties na een SAB zijn schaars en meestal ondoeltreffend. Daarom is de pathofysiologie van post-hemorragische hersenbeschadiging moet verder worden begrepen om nieuwe therapeutische targets te identificeren en nieuwe therapeutische benaderingen te ontwikkelen. Gestandaardiseerd en goed reproduceerbare diermodellen in genetisch gemodificeerde dieren, dwz muizen, zijn cruciaal voor dergelijke onderzoeken. De CWP model is uitgegroeid tot een veel gebruikt model voor SAH als het lijkt op de pathofysiolo...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
Auteurs hebben niets te onthullen.
Dankbetuigingen
Het huidige onderzoek is gefinancierd door de Solorz-Zak Research Foundation.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| Equipment | |||
| operation microscope | Leica | KL2500 | |
| isoflurane vaporizer | Harvard Instruments | Continuous Flow Vaporizer | |
| respirator | Hugo Sachs | Minivent 845 | |
| microcapnograph | Hugo Sachs | Type 340 | |
| temperature controller | FHC | DC Temperature Controller | |
| dental drill | Paggen | Labset- N | |
| ICP monitor | Codman | ICP monitor | |
| blood pressure monitor | AD Instruments | Bridge Amp FE221 | |
| syringe pump | World Precision Instruments | SP101IZ | |
| pulsoximeter | Kent Scientific | MouseSTAT | |
| LDF | Perimed | Periflux 5000 | |
| analog data monitor | AD Instruments | Power Lab 16/35 | |
| Material | |||
| cement for ICP probe fixation | Speiko | Carboxylate cement | |
| glue for LDF probe fixation | Bob Smith Industries | Cyanoacrylate glue (Maxi Cure and Insta Set) | |
| venous catheter | Johnson Johnson | Jelco winged i.v. catheter; REF 4076 | gemodificeerde intubatiebuis |
| tubing for femoral catheter | Smiths Medical | Fine Bore Polythene Tubing; ID 0.28 mm OD 0.61 mm; REF 800/100/100 | gesneden tot 30 cm lengte |
| filament for vessel perforation | Ethicon | Prolene 5-0 | gesneden tot 12 mm lengte |
| surgical equipment | Fine Scientific Instruments | forceps medisch #5, vaatjes 8 cm, microclip 4 mm kaak |
Referenties
- Cahill, J., Zhang, J. H. Subarachnoid hemorrhage: is it time for a new direction. Stroke. 40, 86-87 (2009).
- van Gijn, J., Kerr, R. S., Rinkel, G. J. Subarachnoid haemorrhage. Lancet. 369, 306-318 (2007).
- Lin, C. L., et al. A murine model of subarachnoid hemorrhage-induced cerebral vasospasm. J. Neurosci. Methods. 123, 89-97 (2003).
- Altay, T., et al. A novel method for subarachnoid hemorrhage to induce vasospasm in mice. J. Neurosci. Methods. 183, 136-140 (2009).
- Feiler, S., Friedrich, B., Scholler, K., Thal, S. C., Plesnila, N. Standardized induction of subarachnoid hemorrhage in mice by intracranial pressure monitoring. J. Neurosci. Methods. 190, 164-170 (2010).
- Bederson, J. B., Germano, I. M., Guarino, L. Cortical blood flow and cerebral perfusion pressure in a new noncraniotomy model of subarachnoid hemorrhage in the rat. Stroke. 26, 1086-1091 (1995).
- Veelken, J. A., Laing, R. J., Jakubowski, J. The Sheffield model of subarachnoid hemorrhage in rats. Stroke. 26, 1279-1283 (1995).
- Kamii, H., et al. Amelioration of vasospasm after subarachnoid hemorrhage in transgenic mice overexpressing CuZn-superoxide dismutase. Stroke. 30, 867-871 (1999).
- Parra, A., et al. Mouse model of subarachnoid hemorrhage associated cerebral vasospasm: methodological analysis. Neurol. Res. 24, 510-516 (2002).
- Broderick, J. P., Brott, T. G., Duldner, J. E., Tomsick, T., Leach, A. Initial and recurrent bleeding are the major causes of death following subarachnoid hemorrhage. Stroke. 25, 1342-1347 (1994).
- Thal, S. C., Plesnila, N. Non-invasive intraoperative monitoring of blood pressure and arterial pCO2 during surgical anesthesia in mice. J. Neurosci. Methods. 159, 261-267 (2007).
- Hockel, K., Trabold, R., Scholler, K., Torok, E., Plesnila, N. Impact of anesthesia on pathophysiology and mortality following subarachnoid hemorrhage in rats. Exp. Transl. Stroke Med. 4, 5(2012).
- Wang, Z., Schuler, B., Vogel, O., Arras, M., Vogel, J. What is the optimal anesthetic protocol for measurements of cerebral autoregulation in spontaneously breathing mice? Exp. Brain Res. 207, 249-258 (2010).
- Schwartz, A. Y., Masago, A., Sehba, F. A., Bederson, J. B. Experimental models of subarachnoid hemorrhage in the rat: a refinement of the endovascular filament model. J. Neurosci. Methods. 96, 161-167 (2000).
- Feiler, S., Plesnila, N., Thal, S. C., Zausinger, S., Scholler, K. Contribution of matrix metalloproteinase-9 to cerebral edema and functional outcome following experimental subarachnoid hemorrhage. Cerebrovasc. Dis. 32, 289-295 (2011).
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
