Vaststelling van de minimale bacteriedodende concentratie van een antimicrobieel middel voor planktonische cellen (MBC-P) en biofilmcellen (MBC-B)

Samenvatting

Dit protocol maakt een directe vergelijking mogelijk tussen planktonische en biofilmresistentie voor een bacteriestam die een biofilm in vitro kan vormen met behulp van een 96-put microtiterplaat. Planktonische of biofilmbacteriën worden blootgesteld aan seriële verdunningen van het antimicrobiële middel naar keuze. De levensvatbaarheid wordt beoordeeld door de groei op agarplaten.

Samenvatting

Dit protocol maakt een directe vergelijking mogelijk tussen planktonische en biofilmresistentie voor een bacteriestam die in vitroeen biofilm kan vormen . Bacteriën worden ingeënt in de putten van een 96-wells microtiterplaat. In het geval van de planktonische assay worden seriële verdunningen van het antimicrobiële middel van keuze toegevoegd aan de bacteriële suspensuspensus. In de biofilmtest, eenmaal ingeënt, worden de bacteriën gedurende een bepaalde periode een biofilm laten vormen. Niet-gebonden cellen worden uit de putten verwijderd, de media worden aangevuld en seriële verdunningen van het antimicrobiële middel naar keuze worden toegevoegd. Na blootstelling aan het antimicrobiële middel worden de planktonische cellen voor groei afgetest. Voor de biofilmtest worden de media vernieuwd met verse media zonder antimicrobieel middel en worden de biofilmcellen achtergelaten om te herstellen. De levensvatbaarheid van biofilmcellen wordt na de herstelperiode beoordeeld. De MBC-P voor het antimicrobiële middel wordt gedefinieerd als de laagste concentratie van het medicijn dat de cellen in de planktonische cultuur doodt.  De MBC-B voor een stam wordt daarentegen bepaald door voorgevormde biofilms gedurende 24 uur bloot te stellen aan toenemende concentraties antimicrobieel middel. De MBC-B wordt gedefinieerd als de laagste concentratie antimicrobieel middel dat de cellen in de biofilm doodt.

Inleiding

Antibioticaresistentietesten werden aanvankelijk ontwikkeld om resistentie van planktonische (vrijzwemmende) bacterieculturen te testen. Omdat veel bacteriële infecties biofilms (aan het oppervlak gehechte cellen) omvatten, waren we geïnteresseerd in het ontwikkelen van een methode om biofilmspecifieke antibioticaresistentie te testen. De meeste antibioticaresistentietesten zijn echter slecht geschikt voor het meten van de resistentie van biofilms. Het bepalen van de minimale remmende concentratie (MIC) is bijvoorbeeld de gouden standaard voor het bepalen van antibioticaresistentie van planktonische bacterieculturen ¹. Deze test houdt in dat een verdunde planktonische cultuur wordt gemengd met een verdunningsreeks antibiotica.  De concentratie antibioticum die de zichtbare groei van de planktonische cellen remt, is de MIC. Aangezien deze test afhankelijk is van remming van de groei, kan het per definitie niet werken met biofilmculturen, wat vereist dat de antibioticagevoeligheid van cellen in een voorgekweekte biofilm wordt onderzocht. In plaats van groeiremming te meten, bepaalt de hier beschreven MBC-B-test de concentratie antibioticum die cellen doodt die al in een biofilm bestaan. Deze test is dus bedoeld om antibioticabehandelingen van gevestigde biofilminfecties na te bootsen en een relevanter beeld te geven van de bacteriële antibioticaresistentie in vivo.

Aangezien biofilms over het algemeen antibioticaresistent zijn dan planktonische culturen ^2-4, was het noodzakelijk om een methode te bedenken die de antibioticaresistentie van een biofilm rechtstreeks relateert aan die van een planktonische cultuur. Een ander doel van deze methode is dus om het niveau van antibioticaresistentie tussen planktonische en biofilmcellen direct te kunnen vergelijken. De hier beschreven MBC-P en MBC-B assays maken dit mogelijk omdat cellen onder vergelijkbare omstandigheden worden gekweekt. We hebben deze methode gebruikt om verschillende genen te bestuderen die belangrijk zijn voor biofilmspecifieke antibioticaresistentie ^5-8 .

Protocol

1. MBC-B

1. Het kweken van een biofilm (aangepast van O'Toole⁹).
   1. Kweek een cultuur van de wild-type soort van belang en mutante stam gedurende 16 uur in een rijk medium bij 37 °C.
   2. Verdun de verzadigde nachtculturen 1:100 tot vers medium voor antibioticaresistentietesten. Een standaardmedium voor P. aeruginosa is M63 minimaal medium aangevuld met magnesiumsulfaat en arginine (zie tabel 1). Dit medium stimuleert de vorming van een robuustere biofilm.
   3. Voeg 100 μl verdunning per put toe in een 96-wells microtiterschaal (zie tabel 1). Aangezien deze test meestal in drievoud voor elke stam wordt uitgevoerd, moeten er 24 putten van elke stam zijn.
   4. Incubeer de microtiterplaat gedurende 24 uur bij 37 °C.
2. De voorgevormde biofilm blootstellen aan een concentratiegradiënt van antibiotica
   1. Bereid een 10x verdunningsreeks antibiotica voor 7 putten. Voorbeeld: voor het antibioticum tobramycine zijn de uiteindelijke concentraties in de putten 0,4, 0,2, 0,1, 0,05, 0,025, 0,0125 en 0,006 mg/ml ^5-8 . Bereid uit een bouillon van 25 mg/ml 10x verdunningen van 4, 2, 1, 0,5, 0,25, 0,125 en 0,06 mg/ml. Laat op ijs.
   2. Verwijder het verbruikte supernatant (dat planktonische cellen bevat) met behulp van een meerkanaalspipet (zie tabel 1).
   3. Voeg 90 μl M63 (Mg/Arg) toe aan alle putten.
   4. Voeg 10 μl van elke 10x antibioticaconcentratie toe om de gewenste eindconcentraties te bereiken. Voeg 10 μl water (geen antibioticacontrole) toe aan de uiteindelijke put voor elke replicate en stam.
   5. Incubeer de microtiterplaat gedurende 24 uur bij 37 °C.
3. Het vernieuwen van de media en het mogelijk maken van het losmaken van levende cellen.
   1. Verwijder het verbruikte supernatant (dat planktonische cellen bevat) met behulp van een meerkanaals pipet.
   2. Voeg 115 μl M63 (Mg/Arg) toe aan alle putten.
   3. Incubeer de microtiterplaat gedurende 24 uur bij 37 °C.
4. Test voor levende cellen.
   1. Label twee LB agar platen per 96-well microtiter plaat.
   2. Steriliseer het multiprong-apparaat (zie tabel 1)door de tanden in 100% ethanol te dompelen en de tanden over de open vlam van een Bunsen-brander te laten gaan. herhalen. Laat de tanden iets afkoelen. Breng met behulp van het multiprong-apparaat ~ 3 μl (hoeveelheid die meestal op de uiteinden van de tanden wordt bewaard) van planktonische cultuur van elke put van de microtiterplaat naar het oppervlak van een LB-agarplaat.
   3. Incubeer de LB agar platen gedurende 16 uur bij 37 °C.
   4. Bepaal de minimale bacteriedodende concentratie van het antibioticum door met het oog de cut-off voor bacteriegroei te identificeren (figuur 1).

2. MBC-P

1. Bacteriële stammen voorbereiden
   1. Kweek een cultuur van de wild-type soort van belang en mutante stam gedurende 16 uur in een rijk medium bij 37 °C.
   2. Verdun de verzadigde nachtculturen 1:100 tot vers medium voor antibioticaresistentietesten. Een standaardmedium voor P. aeruginosa is M63 minimaal medium aangevuld met magnesiumsulfaat en arginine (zie tabel 1).
   3. Voeg 90 μl verdunning per put toe in een 96-wells microtiterschaal (zie tabel 1). Aangezien deze test meestal in drievoud voor elke stam wordt uitgevoerd, moeten er 24 putten van elke stam zijn.
2. Planktonische cellen blootstellen aan een concentratiegradiënt van antibiotica
   1. Bereid 10x verdunningsreeks antibioticum voor 7 putten. Voorbeeld: voor het antibioticum tobramycine zijn de uiteindelijke concentraties in de putten 0,032, 0,016, 0,008, 0,004, 0,002, 0,001 en 0,0005 mg/ml. Bereid uit een bouillon van 25 mg/ml verdunningen van 0,32, 0,16, 0,08, 0,04, 0,02, 0,01 en 0,005 mg/ml. Laat op ijs.
   2. Voeg 10 μl van elke 10x antibioticaconcentratie toe om de gewenste eindconcentraties te bereiken. Voeg 10 μl water (geen antibioticacontrole) toe aan de uiteindelijke put voor elke replicate en stam.
   3. Incubeer de microtiterplaat gedurende 24 uur bij 37 °C.
3. Test voor levende cellen.
   1. Label twee LB agar platen per 96-well microtiter plaat.
   2. Steriliseer het multiprong-apparaat (zie tabel 1)door de tanden in 100% ethanol te dompelen en de tanden over de open vlam van een Bunsen-brander te laten gaan. herhalen. Laat de tanden iets afkoelen. Breng met behulp van het multiprong-apparaat ~ 3 μl (hoeveelheid die meestal op de uiteinden van de tanden wordt bewaard) van planktonische cultuur van elke put van de microtiterplaat naar het oppervlak van een LB-agarplaat.
   3. Incubeer de LB agar platen gedurende 16 uur bij 37 °C.
   4. Bepaal de minimale bacteriedodende concentratie van het antibioticum door met het oog de afgesneden bacteriële groei te identificeren (figuur 2).

Resultaten

MBC-P- en MBC-B-assays werden uitgevoerd, waarbij de gevoeligheid van het wilde PA14-type werd vergeleken met PA14 ∆ndvB. Tobramycine werd gebruikt als antibioticum. Resultaten die overeenkomen met stap 1.4.4 (figuur 1) en stap 2.3.4 (figuur 2) worden gepresenteerd. PA14 en ∆ndvB werden in drievoud ingeënt in de MBC-P- en MBC-B-assays. Na het voltooien van stap 1.0-1.4 van het MBC-B protocol en stap 2.0-2.3 van het MBC-P protocol werden de levensvatbare cellen op een LB...

Discussie

Antibioticaresistentie in planktonische cellen wordt gedefinieerd als een toename van de minimale remmende concentratie (MIC) van een antibioticum als gevolg van een permanente verandering in de cellen(bijv. een mutatie). De mechanismen van biofilmspecifieke resistentie of tolerantie die tot nu toe zijn geïdentificeerd, zijn het resultaat van de expressie van wilde genen in biofilms. De klassieke definitie van resistentie is dus niet van toepassing op biofilms. Er is echter een andere reeks definities gepresente...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
1x M63			Bereid een 5x M63 stock oplossing door 15g KH2PO4, 35g K2HPO4 en 10g (NH4)2SO4 op te lossen in 1 L water. Deze stock hoeft niet geautoclaveerd te worden en kan op kamertemperatuur worden bewaard.  Verdun de 5x stock 1:5, autoclaveer, laat afkoelen, en voeg vervolgens de gewenste componenten toe.
KH2PO4	Fisher	P285-500
K2HPO4	Fisher	P288-500
(NH4)2SO4	Sigma	A5132
Magnesium sulfate	Fisher	M63-500	Voeg toe tot 1 mM eindconcentratie.  Bereid een 1 M stock in water en autoclaveer.
Tobramycin	Sigma		Bereid een 50 mg/m stock. Verdeel in aliquoten en bewaar bij -20°C.
Arginine	Sigma	A5131	Voeg toe tot 0.4% eindconcentratie.  Bereid een 20% stock in water en filter sterilise.  Deze alternatieve koolstof/energie bron kan glucose en casamino zuren vervangen
96-wells microtiterplates	Corning	3595	Steriel, platte bodem, lage verdamping
Tranferpette (multichannel pipette)	BrandTech	2703610	8-kanaals, 20-200 μl
Multiprong device	Dan-Kar	MC48	48 prikken passen in ½ van een 96-wells microtiterplaat