Remote Magnetische Aansturing van Micrometrische Probes voor<em&gt; In situ</em&gt; 3D Mapping van bacteriële biofilm Fysische eigenschappen

Samenvatting

Dit document toont een originele methode gebaseerd op de afstandsbedieningsinrichting van magnetische deeltjes geënt in een bacteriële biofilm en de ontwikkeling van specifieke magnetische pincet meten in situ lokale mechanische eigenschappen van het complex levend materiaal gebouwd door micro-organismen aan grensvlakken.

Samenvatting

Bacteriële hechting en groei interfaces tot de vorming van driedimensionale structuren heterogeen zogenaamde biofilms. De cellen woning in deze structuren worden samengehouden door fysische interacties gemedieerd door een netwerk van extracellulaire polymere stoffen. Bacteriële biofilms beïnvloeden vele menselijke activiteiten en het begrip van hun eigenschappen is cruciaal voor een betere controle van hun ontwikkeling - onderhoud of uitroeiing - afhankelijk van hun ongunstig, hetzij gunstig resultaat. Dit document beschrijft een nieuwe methode gericht op het meten in situ lokale fysische eigenschappen van de biofilm die was tot nu uitsluitend getoetst op een macroscopisch homogeen materiaal perspectief. De hier beschreven experiment omvat de invoering van magnetische deeltjes in een groeiende biofilm aan lokale sondes die op afstand worden bediend kan zonder verstoring van de structurele eigenschappen van de biofilm zaad. Dedicated magnetische pincet waren devekeld om een ​​bepaalde kracht uit te oefenen op elk deeltje ingebed in de biofilm. De setup is gemonteerd op het podium van een microscoop om de opname van time-lapse beelden van de deeltjes trekken kunnen ontstaan. De deeltjestrajecten wordt geëxtraheerd uit het trekken sequentie en de lokale visco-elastische parameters afgeleid uit elk deeltje verplaatsing curve, waardoor de 3D-ruimtelijke verdeling van de parameters. Het verkrijgen van inzicht in de biofilm mechanische profiel is van essentieel belang vanuit het oogpunt van een ingenieur van mening voor biofilm controle doeleinden, maar ook vanuit een fundamenteel perspectief op de relatie tussen de architectonische eigenschappen en de specifieke biologie van deze structuren te verduidelijken.

Inleiding

Bacteriële biofilms zijn gemeenschappen van bacteriën in verband met biologische of kunstmatige oppervlakken ^1-3. Ze vormen van een adhesie-groeimechanisme gekoppeld aan de productie van polysaccharide-rijke extracellulaire matrix die het bouwwerk ^4,5 beschermt en stabiliseert. Deze biofilms zijn niet alleen passief assemblages van cellen vast aan oppervlakken, maar georganiseerd en dynamische complexe biologische systemen. Wanneer bacteriën schakelen van plankton tot biofilm levensstijl, worden veranderingen in genexpressie en cel fysiologie en waargenomen als een stijging antibioticaresistentie en gastheer immuunsysteem aan de oorsprong van vele hardnekkige en chronische infecties ^6. Echter, de gecontroleerde ontwikkeling van deze levende structuren bieden ook kansen voor de industrie en milieu-toepassingen, zoals het saneren van locaties met gevaarlijk afval, bio-filtratie van industrieel water of vorming van bio-belemmeringen voor de bodem en het grondwater te beschermen tegen Contaminatie.

Terwijl de moleculaire kenmerken die specifiek zijn voor biofilm manier van leven in toenemende mate worden beschreven, de mechanismen achter de ontwikkeling van de gemeenschap en doorzettingsvermogen blijven onduidelijk. De recente ontwikkelingen op microschaal metingen met scanning elektrochemische of fluorescentiemicroscopie hebben deze levende organisaties is aangetoond dat aanzienlijke structurele, chemische en biologische heterogeniteit ^7. Maar, tot nu toe, biofilm monteurs zijn vooral macroscopisch onderzocht. Zo waarneming van biofilm streamers vervorming als gevolg van variaties in fluïdumstroomsnelheden ^8,9, uniaxiale druk van biofilm stukken heffen van agar medium of gegroeid op hoes schuift ^10,11, dwarskracht biofilm vanuit het milieu en vervolgens overgebracht naar een parallelle plaat reometer ^12,13, atomic force-spectroscopie met een glazen kraal en gecoat met een bacteriële biofilm bevestigd aan een AFM cantilever ¹⁴ of een speciale MICRocantilever methode voor het meten van de treksterkte van vrijstaande biofilm fragmenten ^15,16 zijn uitgevoerd gedurende de laatste tien jaar, het verstrekken van nuttige informatie over de visco-elastische aard van het materiaal ^17. Toch lijkt het waarschijnlijk dat gegevens over in situ biofilm mechanische eigenschappen verloren wanneer het materiaal wordt verwijderd uit zijn natuurlijke omgeving, die vaak in deze benaderingen was. Bovendien is de behandeling van de biofilm als een homogeen materiaal mist de gegevens over de mogelijke heterogeniteit van de fysische eigenschappen binnen de gemeenschap. Daarom is de exacte implicaties van de structuur mechaniek in de biofilmvorming en biologische eigenschappen, zoals genexpressie patroon of chemische gradiënten nauwelijks worden herkend. De overgang naar een microschaal beschrijving van de biofilm fysische eigenschappen, zijn nieuwe speciale gereedschappen nodig.

Deze paper Gegevens een originele aanpak bedacht te bereikenmeting van lokale mechanische parameters in situ zonder de biofilm en waardoor tekening van de ruimtelijke verdeling van de microschaal materiaaleigenschappen en de mechanische heterogeniteit. Het principe van het experiment berust op de dotering van een groeiende biofilm met magnetische microdeeltjes gevolgd door hun afgelegen inladen met magnetische pincet in het rijpe biofilm. Deeltje verplaatsing onder gecontroleerde magnetische kracht toepassing afgebeeld onder de microscoop stelt lokale visco-elastische parameter afleiding, elk deeltje de rapportering van haar eigen lokale omgeving. Uit deze gegevens kan de 3D-mechanische profiel van de biofilm worden getrokken, onthullende ruimtelijke en milieuconditie afhankelijkheden. De hele experiment wordt hier getoond een E. coli biofilm die door een genetisch gemanipuleerde stam die een gederepresseerde F-achtige plasmide. De beschreven in een recent artikel ¹⁸ resultaten geven een unieke visie op het interieur van intacte biofilm mechanica.

Protocol

1. Bacteriën Cultuur en Suspension Voorbereiding

1. Kies een vers gekweekte kolonie uit lysogenie Broth (LB) agar plaat, inoculeren in 5 ml vloeibaar LB-medium dat 100 μ g / ml ampicilline en 7,5 μ g / ml tetracycline en incubeer voor 5 tot 6 uur bij 37 ° C op een trillende platform.
2. Voeg vervolgens 100 μ l van de bacteriecultuur in 5 ml minimaal medium (M63B1) aangevuld met 0,4% glucose en hetzelfde antibioticum concentraties. Incubeer dit vers verdund cultuur overnacht bij 37 ° C op een schuddend platform.
3. Na 16 uur incubatie, voeg 100 ul van de kweek van een nacht tot 5 ml M63B1, 0,4% glucose. Houd de buis bij 37 ° C om de schudtafel tot 0,5 OD wordt bereikt. De suspensie is dan gereed voor injectie in het experiment kanaal voor biofilmvorming.

2. Magnetic Particle Voorbereiding

1. Neem 10 pi magnetische deeltjes -2.8 μ m in diameter - van de voorraad en was ze 3x in 190 ul minimaal medium met behulp van een magnetische monster rek.
2. Stel het deeltje concentratie 5 x 10 ⁶ kralen / ml. Typically 50 pl van de gewassen korrel oplossing wordt gemengd met een verdere 950 μ l M63B1 0,4% glucose.

3. Channel Voorbereiding en biofilmgroei

1. Kanaal Montage
   1. Snijd twee vierkante (800 μ m lengte) borosilicaatglas haarvaten 10 cm lang om twee 8 cm lange stukken te verkrijgen.
   2. Lijm de twee capillaire stukken op twee glasplaatjes - gehalveerd eerste - 2 cm van elkaar met 1 cm overhang aan beide zijden zoals in figuur 1 met behulp van een snelwerkende cyanoacrylaat lijm (de zogenaamde super-lijm).
   3. Autoclaaf de gehele installatie en de nodige slangen nodig voor de verdere kanaal aansluiting.
   4. Verzamel alle steriele materialen ondereen laminaire stroming kap: i) de gemonteerde kanaal en val 1, ii) de slangen en aansluitingen, iii) de twee bubble vallen - de zeepbel filter vaak gebruikt om kinderen sondevoeding (trap 1) en de zelfgemaakte opvanginrichting beveiligen als een 4 cm lange buis met een grotere diameter (trap 2), iv) klemmen, v) 30 ml spuiten gevuld met M63B1, 0,4% glucose, en vi) de fles afval.
   5. Sluit de hele setup met Luer Lock connectoren of kruispunten in de volgende volgorde: 50 ml M63B1 spuit gecontroleerd door de injectiepomp, pediatrische bubble filter, zelfgemaakte Waterventiel, capillair (Figuur 1, paneel B), en de buis om de fles afval. Vul dan de opstelling met steriele M63B1, 0,4% glucose, het inschakelen van de injectiespuit pomp met een snelheid van ongeveer 10 ml / uur, hoger dan de experimentele tarieven. Zorgvuldig volgen en elimineren alle bubbels in het circuit.
   6. Stroming het medium door het systeem gedurende 10-15 min; gelijktijdig mix 1 ml van de bacterie suspensie bij OD 0.5 van Sectie1.3 met 1 ml van de gewassen kraal oplossing bereid in paragraaf 2.2.
   7. Bevestig (maar niet sluiten) klemmen om de buis op twee posities: voor en na de haarvaten. Schakel de stroom uit.
   8. Introduceer de bacteriële-kraal mengsel in de capillair achter de zelfgemaakte opvanginrichting met behulp van een 1 ml spuit, zorg te houden van de buis eindigt aan de lucht insleep te voorkomen. Terugplaatsen van de slang en sluit de klemmen.
   9. Herhaal dezelfde procedure voor de tweede capillaire en laat U alle buizen voor bubbels.
   10. Breng de inrichting aan de microscoop en laat het gedurende 15-20 minuten staan ​​om de bacteriën in staat te regelen en hechten aan het oppervlak van het capillair. Installeer het capillair op de microscoop podium met de afvalcontainer op een iets hoger niveau. Plaats de spuit pomp op het aanrecht naast de microscoop. Verhoog de opvanginrichting voordat de capillaire iets hoger dan de capillaire vliegtuig naar bubbels te vangen.
2. Biofilm Growth
   1. Stel het debiet op de spuit pomp en start de stroom, zal de biofilm nu ontwikkelen op de capillaire oppervlak tijdens de vereiste periode - meestal 24 of 48 uur in deze experimenten.
   2. Focus op de capillaire bodem vlak en start de time-lapse-opname van de voorbeeldfoto's - meestal een overname frequentie van 2 beelden / zal min adequaat de biofilm groei melden. Deze video monitoren biofilmgroei nacontrole (zie uittreksels in Video's 1, 2 en 3).

4. Magnetisch pincet Installatie

1. Schroef de magnetische pincet op handbediende XYZ micromanipulators en schroef de micromanipulators op de microscoop podium om de positie van de pincet passen ten opzichte van het capillair. Plaats de pincet zoals in figuur 2 te zorgen voor de juiste magnetische veldgradiënt wordt opgewekt in de waarneming zone.
2. Sluit de pincet to de functie generator via de eindversterker om een ​​40 sec periode van 24 sec nul signaal en 16 sec van 4 A gelijkstroom met een trekker naar het helder veld licht sluiter wordt na 20 seconden voor signaalsynchronisatie verstrekken van een reeks te genereren gebeurtenissen zoals in Figuur 3.
   NB: De twee bewerkingen kunnen op elk moment tussen capillaire installatie en meting begin bereikt. Zie experimenteren overzicht schets in figuur 4.

5. Creep Curve Acquisitie

1. Gebruik de xy bewegingscontrole van de microscoop fase naar de rand van de linker magnetische pool en de linker rand van het capillair in de observatie hetzelfde veld brengen. Neem de oorsprong van de analyse referentiële op de kruising van x-en y-as gedefinieerd door de rand van het capillair en de rand van het poolstuk, respectievelijk (zie figuur 2).
2. Pas de verticale positie van het capillair met behulp van fijne Focus Controle knop van de microscoop positie. Typisch de eerste onderzochte vlak ligt tussen 4 tot 7 μ m boven het capillaire bodem. Video 1 correspondeert met het xy veld dat de linker hoek heeft aan de basis van de ruimtelijke referentiële.
3. Trigger de 40 sec opeenvolging van gebeurtenissen in punt 4.2 en figuur 3 beschreven door het inschakelen van de stroomgenerator en tegelijkertijd handmatig activeren de beeldacquisitie sequentie Video 1.
4. Verplaats de capillair naar rechts veld buurman een 250 μ m vertaling van de microscooptafel naar links en werken als in paragraaf 5.3 tot Video 2 van schijf 2 te genereren en zo verder tot de gewenste video verkrijgen. Typisch 3 tot 4 gebieden 250 x 250 μ m ² verzameld langs de x-as alvorens de vliegtuig en herhalen dezelfde handelingen voor het nieuwe vliegtuig.

6. Kracht IJking

1. Bereid een glycerol-oplossing door het mengen van 39,8 g glycerol met 190 μ l van bi-gedestilleerd water en 10 ul van magnetische deeltjes in een 2 x 10 ⁹ deeltjes / ml en vul een experimenteel kanaal met dit mengsel en plaats het op de microscoop podium zoals beschreven voor de biofilm monster.
2. Na het installeren van de magnetische pincet als vermeld in paragraaf 4, gelden de magnetische kracht als vermeld in paragraaf 5.4 en maak time-lapse beelden telkens voor een enkele snelheid deeltje (v) en haar positie in de capillaire halen om de kalibratie-bestand af te leiden. Dit bestand moet de uitgeoefende kracht bevatten als functie van de positie in de zone van de analyse van de capillair volgens de wet van Stokes, F = 6πRηv (R: straal van het deeltje).

7. Analyse

1. Gebruik een "particle tracker" software om tekstbestanden te verkrijgen met het deeltje posities in elk frame voor alle stapels van beelden verkregen als vermeld in paragraaf 5. Using het beeld stapel overname frequentie, bereken het deeltje verplaatsing als functie van de tijd (bijvoorbeeld Figuur 5 en video 4).
2. De kracht kalibratiebestand, zet de verplaatsingscurven naleving curves (totaal conformiteit van het materiaal - J (t) - als functie van de tijd) afhankelijk van de mate formule:
   
   waarin de relatie tussen materiaalspanning geeft en toegepaste spanning voor een probe deeltje met straal R ingebed in een onsamendrukbare, homogeen viscoelastische medium zoals eerder vastgesteld Schnurr en medewerkers ^19.
3. Pas de kruip compliantiecurven de algemene Burgers model voor visco-elastische materialen en ontlenen de visco-elastische parameters, J _0, J _1, η _0, η ₁ voor elk deeltje ( Figuur 6) volgens de formule van de Burgers ':
   
   Opmerking: Deze fenomenologische analyse is eerder toegepast voor uiteenlopende materialen zoals biologische materialen zoals biofilms macroscopische reologie interpreteren ^20-22.

Resultaten

Een typische analyse zal de ruimtelijke verdeling van de visco-elastische parameters te leveren tegen de micron schaal op een levend biofilm zonder zijn oorspronkelijke schikking te verstoren. Typische resultaten worden getoond in figuur 7 waarin de waarden J ₀ - de elastische uitvoering - gegeven als functie van de z-as langs de diepte en de y-as langs een dwarsafmeting van de biofilm. Elk punt komt overeen met een kraal die kruip curve analyse heeft gegeven van een J ₀ waarde. De...

Discussie

Deze magnetische deeltjes zaaien en trekken experiment geactiveerd in situ 3D-kaarten van de visco-elastische parameters van een groeiende biofilm in de oorspronkelijke staat. Deze benadering bleek de mechanische heterogeniteit van de E. coli biofilm hier gegroeid en gaf aanwijzingen te wijzen op de biofilm componenten ondersteunen van de biofilm fysische eigenschappen, sterk suggereert een fundamentele implicatie van de extracellulaire matrix en meer bepaald de mate van cross-linking.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Tabel 1: Reagentia en cellen
Magnetische deeltjes	Life technologies	14307D	Micrometrische magnetische deeltjes, 2,8 µm diameter
Ampicilline (antibioticum)	Sigma-Aldrich	A9518
Tetracycline (antibioticum)	Sigma-Aldrich	87128
Bacterie-stam MG1655gfpF	UGB, Institut Pasteur, Frankrijk		Produceert F pili op het oppervlak, resistent tegen Ampicilline en tetracycline.
Tabel 2: Capillairen en slangen
Filters voor kinderperfusie	Prodimed-Plastimed	6932002
Vierkante holle capillairen	Composite Metal Scientific	8280-100	Vervaardigd in borosilicaatglas. Vierkant 0,8 mm x 0,8 mm
Slang siliconenperoxide	VWR International	228-0512	Diameter 1 mm
Slang siliconenperoxide	VWR International	228-0700	Diameter 3 mm
Tabel 3: Biofilmgroei
Lysogeny Broth (LB) oplossing	Amresco-VWR	J106-10PK	Standaard medium gebruikt om bacteriën te kweken.
M63B1 oplossing	Zelfgemaakt		Standaard minimaal medium gebruikt om bacteriën te kweken.
Glucose	Sigma-Aldrich	G8270	Gebruikt om M63B1 medium met 0,4% glucose te maken.
Tabel 4: Elektronica
Camera EMCCD	Hamamatsu	C9100-02
Verwarmingsregelaar	World Precision Instruments	300354
Functiegenerator	Agilent Technologies	33210A
Vermogensversterker	Zelfgemaakt		Geeft een stroom signaal met amplituden tot 4 A.
Spuitpompen	Kd Scientific	KDS-220
Shutter	Vincent Associates	Uniblitz T132
Magneettang	Zelfgemaakt		Twee elektromagnetische polen, elk gemaakt van een koperen spoel met 2.120 windingen van 0,56 mm diameter koperen draad en zachte magnetische kernen (Supra50-Arcelor Mittal, Frankrijk) vierkant gevormd volgens de blauwdruk getoond in Figuur 10. De twee kernen zijn gemonteerd met de noordpool tegen de zuidpool, om een magnetische kracht in één richting langs de lengte van de capillair te genereren. Zie draadgegevens spoel in Figuur 11.
Tabel 5: Optica
Omgekeerde microscoop	Nikon	TE-300
S Fluor x40 Objectief (NA 0,9, WD0,3)	Nikon		Dit is een objectief met een lange werkafstand die het mogelijk maakt om de biofilm in de diepte te observeren.
Epifluorescentiefilters: 1) voor groene fluorescentie: Exc 480/20 nm; DM 495; Em 510/20  2) voor rode fluorescentie: Exc 540/25 nm; DM 565; Em 605/55	Chroma	1)#49020 2)#31002	Deeltjesverplaatsing bij krachttoepassing wordt geregistreerd met behulp van de rode fluorescentiefilterblok.
Tabel 6: Beeldanalyse
ImageJ	NIH - deeltjesvolgplug-in