Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

Snelle generatie van amyloïde uit native eiwitten in vitro

6.1K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/50869

⸱

5 december 2013

 ,  , 
1Department of Immunology, The University of Texas MD Anderson Cancer Center

In dit artikel

Samenvatting

Eiwitten kunnen ofwel een natuurlijke structuur aannemen ofwel verkeerd vouwen in onoplosbare amyloyde. Omstandigheden die de verkeerd vouwende route bevorderen, leiden tot de vorming van verschillende soorten amyloyde fibrillen. De hier beschreven methoden maken een snelle omzetting van natuurlijke eiwitten in amyloyde in vitro mogelijk.

Samenvatting

Eiwitten voeren cruciale taken uit in organismen door functies uit te oefenen die voortvloeien uit hun specifieke driedimensionale vouwen. Hoewel de native structuren van polypeptiden veel doeleinden dienen, wordt nu erkend dat de meeste eiwitten een alternatieve samenstelling van bèta-sheet rijke amyloïde kunnen aannemen. Onoplosbare amyloïde fibrillen worden aanvankelijk geassocieerd met meerdere menselijke aandoeningen, maar ze worden steeds vaker gezien als functionele spelers die deelnemen aan verschillende belangrijke cellulaire processen. Bovendien bevat amyloïde dat in patiëntenweefsels wordt afgezet niet-eiwitachtige componenten, zoals nucleïnezuren en glycosaminoglycanen (GAG's). Deze cofactoren kunnen de vorming van amyloïde faciliteren, wat resulteert in de generatie van verschillende soorten onoplosbare neerslagen. Door gebruik te maken van ons begrip van hoe eiwitten verkeerd vouwen via een intermediaire fase van oplosbare amyloïde precursor, hebben we een methode ontwikkeld om native eiwitten om te zetten in amyloïde fibrillen in vitro. Deze aanpak stelt iemand in staat om amyloïde in grote hoeveelheden te bereiden, de eigenschappen van amyloïde te onderzoeken dat is gegenereerd uit specifieke eiwitten, en de structurele veranderingen te evalueren die gepaard gaan met de omzetting.

Inleiding

Eiwitten zijn de meest voorkomende biologische macromoleculen die in alle soorten cellen voorkomen. Ze komen voor in een grote verscheidenheid aan maten, structuren en post-translationele modificaties en vervullen een enorm scala aan belangrijke biologische functies in hun natuurlijke vorm. Meer dan twee dozijn abnormale polypeptiden zijn betrokken geweest bij talrijke menselijke pathologische aandoeningen, zoals de ziekte van Alzheimer, de ziekte van Parkinson en type 2 diabetes1-4. De misgevouwen terminale eiwitten accumuleren als amyloïde fibrillen, de onoplosbare stabiele aggregaten die extracellulair of intracellulair voorkomen.

Ondanks de implicatie van specifieke eiwitten bij bepaalde ziekten, ondersteunt toenemend bewijs de opvatting dat alle polypeptiden intrinsieke eigenschappen hebben die amyloïde transformatie mogelijk maken. Een genomisch sequentieonderzoek identificeerde het "amyloom", waarbij amyloïde-neigende fragmenten ongeveer 15% van alle coderende peptidesegmenten uit E. coli tot mensen uitmaken5. Dienovereenkomstig is in de afgelopen jaren een toenemend aantal functionele amyloïden ontdekt, die deelnemen aan verschillende belangrijke cellulaire processen. Bijvoorbeeld, bacteriën assembleren amyloïden om biofilms en sporenstructuren te vormen die cruciaal zijn voor hun overleving en pathogenese6-9. Peptidhormonen vormen amyloïde afzettingen tijdens opslag in secretoire korrels van zoogdieren voordat ze worden vrijgegeven, wat verder impliceert dat de eiwit-amyloïde vorm gunstige biologische functies kan dienen6,10,11. Bovendien kunnen eiwitten zich ook samenvoegen tot amyloïde fibrillen om cruciale cellulaire signalen over te brengen12,13.

Jarenlang zijn de meest bestudeerde amyloïden bereid uit individuele peptiden die worden geassocieerd met menselijke ziekten, zoals amyloïde beta of prionpeptide. Deze peptiden hebben meestal geen goed gedefinieerde structuur en vormen spontaan amyloïde in oplossing na verloop van tijd, een proces dat wordt gemedieerd door een gedeeltelijk misgevouwen intermediair dat dient als voorloper van onoplosbaar amyloïde. De voorloper van amyloïde wordt ook wel oplosbaar eiwit-oligomeer genoemd, wat zeldzaam en onstabiel is wanneer het wordt gegenereerd uit natuurlijke peptiden14,15. Echter, zoals eerder beschreven, kan in principe bijna elk eiwit een amyloïde-conformatie aannemen onder de juiste omstandigheden. We hebben onlangs een methode ontwikkeld om gestabiliseerde oplosbare oligomeren van natuurlijke eiwitten te bereiden, die gemakkelijk amyloïde vormen in aanwezigheid van verschillende cofactoren16. De resulterende amyloïde fibrillen weerspiegelen de complexe aard van de terminale eiwit-misvouwingsaggregaten17,18. Hier gebruiken we de term eiwit-alleen-amyloïde om te verwijzen naar de eiwit-fibrillen zonder cofactoren en hybride amyloïde voor de fibrillen die niet-eiwit componenten bevatten.

Eerder zijn verschillende methoden ontwikkeld om amyloïde in vitro te genereren door omstandigheden toe te passen die bekend zijn om eiwit-misvouwing te bevorderen, zoals hoge temperatuur, hydrofobe omgeving en pH-variaties19-23. Echter, ze worden geassocieerd met verschillende problemen, zoals lage efficiëntie, omkeerbare vouwing, grote batchvariaties of langzame kinetiek. De hier beschreven aanpak is reproduceerbaar, gemakkelijk op te schalen en stelt iemand in staat om het tijdstip en de voorwaarden van amyloïde-conversie precies te bepalen.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

1. Prepare MES Buffer

  1. Gebruik MES-buffer (0.1 M 2-(N-morpholino)ethaansulfonzuur en 0.9 M NaCl) om zowel eiwit-alleen amyloïde als gestabiliseerde oplosbare eiwit-oligomeren te bereiden. Weeg 1,95 g MES en 5,27 g NaCl. Voeg H2O toe en pas pH aan tot 4,7. Breng het eindvolume aan tot 100 ml. Bewaar tot 6 maanden bij 4º C.

2. Bereid Eiwit-alleen Amyloïde Direct uit Native Eiwitten

  1. Weeg eiwit naar keuze (elk natuurlijk eiwit of peptide) en reconstitueer tot 10 mg/ml in MES-buffer.
  2. Incubeer gedurende 4 uur in een waterbad op 65 ºC. Aan het einde van de periode is er een wit neerslag zichtbaar in de oplossing.
  3. Neutraliseer het monster met 10% (v/v) Tris-HCl (1 M, pH 10,5).
  4. Dialyseer het eiwit in een dialysecassette gedurende een nacht om het te wisselen naar de gewenste buffer voor verdere analyse.
  5. Een controlemonster van natuurlijk eiwit kan worden bereid door de stappen 2.1, 2.3 en 2.4 te volgen zonder hitteprecipitatie (stap 2.2).

3. Bereid Hybride Amyloïde uit Gestabiliseerde Oplosbare Oligomeren van Natuurlijke Eiwitten

  1. Bereid gestabiliseerde oplosbare eiwit-oligomeren
    1. Weeg eiwit naar keuze en reconstitueer tot 10 mg/ml in MES-buffer. Laat 15 minuten op kamertemperatuur staan.
    2. Weeg 1-ethyl-3-[3-dimethylaminopropyl]carbodiimide hydrochloride (EDC) en bereid een verse voorraad van 20 mg/ml in MES-buffer.
    3. Meng eiwit- en EDC-oplossingen in een verhouding van 2:5 (v/v), d.w.z. 2 mg eiwit voor elke 10 mg EDC.
    4. Incubeer op kamertemperatuur gedurende 2 uur.
    5. Neutraliseer het monster met 10% (v/v) Tris-HCl (1 M, pH 10,5).
    6. Dialyseer het eiwit in een dialysecassette gedurende een nacht om het te wisselen naar de gewenste buffer voor verdere analyse.
    7. Bewaar het gestabiliseerde oplosbare eiwit-oligomeer tot 4 weken bij 4 ºC.
  2. Bereid hybride amyloïde uit gestabiliseerd oplosbaar eiwit-oligomeer.
    1. Om DNA-bevattend amyloïde te bereiden, meng DNA en gestabiliseerd oplosbaar eiwit-oligomeer in een 1:1-verhouding (w/w). Laat minimaal 2 uur bij 4 ºC staan. Gedurende deze periode is er een onoplosbare neerslag zichtbaar in de oplossing wanneer de initiële eiwitconcentratie 0,5 mg/ml of hoger is.
    2. Om RNA-bevattend amyloïde te bereiden, meng RNA en gestabiliseerd oplosbaar eiwit-oligomeer in een 1:1-verhouding (w/w). Laat minimaal 2 uur bij 4 ºC staan. Gedurende deze periode is er een onoplosbare neerslag zichtbaar in de oplossing wanneer de initiële eiwitconcentratie 0,5 mg/ml of hoger is.
    3. Om heparine-bevattend amyloïde te bereiden, meng heparine en gestabiliseerd oplosbaar eiwit-oligomeer in een 1:1-verhouding (w/w). Laat minimaal 2 uur bij 4 ºC staan. Gedurende deze periode is er een onoplosbare neerslag zichtbaar in de oplossing wanneer de initiële eiwitconcentratie 0,5 mg/ml of hoger is.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

De mogelijkheid om natuurlijke eiwitten direct om te zetten in amyloïd is afhankelijk van de conformationele verandering die optreedt bij een hoge temperatuur in de MES-buffer. Neerslag in de oplossing is een goede indicatie van eiwitaggregatie en mogelijk amyloïdvorming. Aan de andere kant wordt EDC gebruikt om de eiwitten te crosslinken, zodat oplosbare eiwitoligomeren kunnen stabiliseren en de in MES-buffer geïnduceerde oligomere conformatie kan worden vastgelegd. Hierdoor zijn de gestabiliseerde eiwitoligomeren multi...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

De hier beschreven methode biedt een snel en flexibel middel om amyoïde fibrillen in vitro te bereiden van vrijwel elk eiwit of peptide naar keuze. Verschillende soorten amyoïde kunnen betrouwbaar worden bereid - alleen eiwitfibrilles of hybride aggregaten die DNA, RNA of glycosaminoglycanen bevatten. De betrokken procedures zijn eenvoudig, duidelijk en vereisen geen geavanceerde technische opleiding. Het amyoïde dat met deze methode is bereid, is vrij stabiel en kan veilig worden bewaard bij 4 °C of worden inge...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

We hebben niets te onthullen.

Dankbetuigingen

Dit werk wordt ondersteund door subsidies aan W.C. van National Institutes of Health Grant AI074809 en The University of Texas M. D. Anderson Cancer Center Institutioneel Onderzoekssubsidieprogramma.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
2-(N-morpholino)ethanesulfonic acid (MES)Sigma-AldrichM8250
NaClFisherBP358-10
1-ethyl-3-[3-dimethyl-aminopropyl] carbodiimide hydrochloride (EDC)Thermo/Pierce22980
DNA van zalmzaadSigmaD1626
RNA van torula gistSigmaR6625
Heparine uit varkensdarmmucosaSigmaH3149
Tris-basisFisherBP152-1
Apparatuur:
WaterbadFisher ScienceIsotemp 210
Slide-A-Lyzer dialysecassetteThermo/Pierce66380

Referenties

  1. Selkoe, D. J. Folding proteins in fatal ways. Nature. 426, 900-904 (2003).
  2. Schnabel, J. Protein folding: The dark side of proteins. Nature. 464, 828-829 (2010).
  3. Goldberg, A. L. Protein degradation and protection against misfolded or damaged proteins. Nature. 426, 895-899 (2003).
  4. Chiti, F., Dobson, C. M. Protein misfolding, functional amyloid, and human disease. Annu. Rev. Biochem. 75, 333-366 (2006).
  5. Goldschmidt, L., Teng, P. K., Riek, R., Eisenberg, D. Identifying the amylome, proteins capable of forming amyloid-like fibrils. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 3487-3492 (2010).
  6. Fowler, D. M., Koulov, A. V., Balch, W. E., Kelly, J. W. Functional amyloid - from bacteria to humans. Trends Biochem. Sci. 32, 217-224 (2007).
  7. Chapman, M. R., et al. Role of Escherichia coli Curli Operons in Directing Amyloid Fiber Formation. Science. 295, 851-855 (2002).
  8. Barnhart, M. M., Chapman, M. R. Curli Biogenesis and Function. Annu. Rev. Microbiol. 60, 131-147 (2006).
  9. Claessen, D., et al. A n olved in aerial hyphae formation in Streptomyces coelicolor by forming amyloid-like fibrils. Genes Dev. 17, 1714-1726 (2003).
  10. Maji, S. K., et al. Functional Amyloids As Natural Storage of Peptide Hormones in Pituitary Secretory Granules. Science. 325, 328-332 (2009).
  11. Badtke, M. P., Hammer, N. D., Chapman, M. R. Functional Amyloids Signal Their Arrival. Sci. Signal. 2, pe43(2009).
  12. Li, J., et al. The RIP1/RIP3 Necrosome Forms a Functional Amyloid Signaling Complex Required for Programmed Necrosis. Cell. 150, 339-350 (2012).
  13. Hou, F., et al. MAVS forms functional prion-like aggregates to activate and propagate antiviral innate immune response. Cell. 146, 448-461 (2011).
  14. Stefani, M. Biochemical and biophysical features of both oligomer/fibril and cell membrane in amyloid cytotoxicity. FEBS J. 277, 4602-4613 (2010).
  15. Glabe, C. G. Structural classification of toxic amyloid oligomers. J. Biol. Chem. 283, 29639-29643 (1074).
  16. Di Domizio, J., et al. Binding with nucleic acids or glycosaminoglycans converts soluble protein oligomers to amyloid. J. Biol. Chem. 287, 736-747 (2012).
  17. Zhang, X., Li, J. -P., Lijuan, Z. Heparan sulfate proteoglycans in amyloidosis. Prog. Mol. Biol. Transl. Sci. 93, 309-334 (2010).
  18. Jiménez, J. S. Protein-DNA Interaction at the Origin of Neurological Diseases: A Hypothesis. J. Alzheimer's Dis. 22, 375-391 (2010).
  19. Bhattacharya, M., Jain, N., Mukhopadhyay, S. Insights into the Mechanism of Aggregation and Fibril Formation from Bovine Serum Albumin. J. Phys. Chem. B. 115, 4195-4205 (2011).
  20. Vetri, V., et al. Bovine Serum Albumin protofibril-like aggregates formation: Solo but not simple mechanism. Arch. Biochem. Biophysics. 508, 13-24 (2011).
  21. Bucciantini, M., et al. Inherent toxicity of aggregates implies a common mechanism for protein misfolding diseases. Nature. 416, 507-511 (2002).
  22. McParland, V. J., Kalverda, A. P., Homans, S. W., Radford, S. E. Structural properties of an amyloid precursor of b2-microglobulin. Nat. Struct. Mol. Biol. 9, 326-331 (2002).
  23. Chiti, F., et al. Designing conditions for in vitro formation of amyloid protofilaments and fibrils. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 96, 3590-3594 (1999).
  24. McParland, V. J., et al. Partially Unfolded States of b2-Microglobulin and Amyloid Formation in vitro. Biochemistry. 39, 8735-8746 (2000).
  25. Liu, K., Cho, H. S., Lashuel, H. A., Kelly, J. W., Wemmer, D. E. A glimpse of a possible amyloidogenic intermediate of transthyretin. Nat. Struct. Mol. Biol. 7, 754-757 (2000).
  26. Pfefferkorn, C. M., McGlinchey, R. P., Lee, J. C. Effects of pH on aggregation kinetics of the repeat domain of a functional amyloid. Pmel17. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 21447-21452 (2010).
  27. Di Domizio, J., et al. Nucleic acid-containing amyloid fibrils potently induce type I interferon and stimulate systemic autoimmunity. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 109, 14550-14555 (2012).
  28. Halle, A., Hornung, V., Petzold, G. C., Stewart, C. R., Monks, B. G., Reinheckel, T., Fitzgerald, K. A., Latz, E., Moore, K. J., Golenbock, D. T. The NALP3 inflammasome is involved in the innate immune response to amyloid-β. Nat. Immunol. 9, 857(2008).
  29. Masters, S. L., O'Neill, L. A. Disease-associated amyloid and misfolded protein aggregates activate the inflammasome. Trends Mol. Med. 17, 276-282 (2011).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Tags

AmyloïdevormingeiwitmispoldingMES-bufferhitteprecipitatieEDC-crosslinkingnucleïnezuuramyloïdeheparine-amyloïdeoplosbare eiwitoligomerengel-shift-assaycytotoxiciteitsanalyse
Snelle generatie van amyloïde uit native eiwitten in vitro
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan de bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleidsoverzicht

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.